生物化学05第五章课件核酸化学.ppt

1、第五章第五章 核酸化学核酸化学第一节第一节 核酸的概述核酸的概述 第二节第二节 核苷酸核苷酸 第三节第三节 核酸的结构核酸的结构 第四节第四节 核酸的提取、分离和测定核酸的提取、分离和测定 第五节第五节 核酸的变性、复性与杂交核酸的变性、复性与杂交 第一节第一节 核酸的概述核酸的概述1 1染色体和基因染色体和基因2 2核酸核酸第一节第一节 核酸的概述核酸的概述（染色体和基因（染色体和基因1 1）在生物细胞核中存在着一种能被碱性染在生物细胞核中存在着一种能被碱性染料着色的螺旋集缩体，它是由核酸、料着色的螺旋集缩体，它是由核酸、组组蛋白、非组蛋白等组成，称此物质为染色蛋白、非组蛋白等组成，称此物质

2、为染色体。体。经典遗传学认为，染色体和基因（遗传经典遗传学认为，染色体和基因（遗传因子）间有平行现象，基因存在于染色体因子）间有平行现象，基因存在于染色体上，基因在遗传中具有完整性，随染色体上，基因在遗传中具有完整性，随染色体的分裂、配对而进行独立的分配。的分裂、配对而进行独立的分配。第一节第一节 核酸的概述核酸的概述（染色体和基因染色体和基因2 2）第一节第一节 核酸的概述核酸的概述（染色体和基因（染色体和基因3 3）复制复制分开分开第一节第一节 核酸的概述核酸的概述（1 1核酸的发现）核酸的发现）1868年，从外科从外科绷带上的脓细胞绷带上的脓细胞的细胞核中分离的细胞核中分离得到一种含磷较

3、得到一种含磷较高的酸性物质，高的酸性物质，称之为核素。称之为核素。（nucleinnuclein）核素实质是一核素实质是一种核糖核蛋白。种核糖核蛋白。瑞士科学家瑞士科学家 F.MiescherF.Miescher18891889年，年，AltmannAltmann首先制备了不含蛋白的核酸制品，并首先制备了不含蛋白的核酸制品，并引入引入“核酸核酸”这一名词。这一名词。2020世纪世纪2020年代测定了核酸的化学组成，并将核酸分为年代测定了核酸的化学组成，并将核酸分为DNADNA和和RNARNA。19431943年，年，E.ChargaffE.Chargaff的工作：嘌呤：嘧啶的工作：嘌呤：嘧啶=

4、1=1：1 1，由此，由此推理出碱基配对的理论。推理出碱基配对的理论。19441944年，年，AveryAvery的肺炎双球菌转化实验，证明遗传物质的肺炎双球菌转化实验，证明遗传物质即为即为DNADNA。19531953年，年，Watson-CrickWatson-Crick建立了建立了DNADNA的双螺旋结构模型。的双螺旋结构模型。遗传密码的阐明、核酸内切酶的发现、核酸的合成与分遗传密码的阐明、核酸内切酶的发现、核酸的合成与分析技术、基因重组技术等的建立形成了分子生物学的基本析技术、基因重组技术等的建立形成了分子生物学的基本完整体系。完整体系。第一节第一节 核酸的概述核酸的概述（2 2核酸的

5、研究史）核酸的研究史）第一节第一节 核酸的概述核酸的概述（核酸的种类）（核酸的种类）核糖核酸核糖核酸（ribonucleic acid-ribonucleic acid-RNARNA）转移转移RNA(transfer RNA-RNA(transfer RNA-tRNAtRNA)信使信使RNA(messenger RNA-RNA(messenger RNA-mRNAmRNA)核糖体核糖体RNARNA（ribosomal RNA-ribosomal RNA-rRNArRNA）脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid-deoxyribonucleic acid-DNADN

6、A）第一节第一节 核酸的概述核酸的概述（核酸的分布）（核酸的分布）真核生物真核生物原核生物原核生物 DNA细胞核（95%）线粒体、叶绿体（5%）核质区（拟核）RNA细胞质（75%）线粒体、叶绿体（15%）细胞核（10%）细胞质第一节第一节 核酸的概述核酸的概述（核酸的功能）（核酸的功能）DNADNA功能：功能：遗传信息的载体，负责遗遗传信息的载体，负责遗传信息的贮存和发布。传信息的贮存和发布。RNARNA功能：功能：三者共同参与遗传信息的三者共同参与遗传信息的表达表达。第一节第一节 核酸的概述核酸的概述（核酸的组成）（核酸的组成）核酸核酸核苷酸核苷酸磷酸磷酸核苷核苷戊糖戊糖碱基碱基水水解解核蛋

7、白核蛋白蛋白质蛋白质这样看这样看核酸是一核酸是一种高聚核种高聚核苷酸，它苷酸，它的基本结的基本结构单位是构单位是核苷酸核苷酸。第二节第二节 核苷酸核苷酸(总）总）1 1核糖核糖2 2碱基碱基3 3核苷核苷4 4核苷酸核苷酸5 5多磷核苷酸（多磷核苷酸（ATPATP）许多个许多个第二节第二节 核苷酸核苷酸(1(1戊糖）戊糖）OHHOHHOHOHHHOCH2HOCH2OHHOHHHOHHD-核糖D-2-脱氧核糖组成核酸的戊糖有两种组成核酸的戊糖有两种 组成组成DNADNA 组成组成RNARNA第二节第二节 核苷酸核苷酸(2(2碱基碱基1 1）核酸中的碱基分两类：核酸中的碱基分两类：（1 1）嘧啶碱

8、：）嘧啶碱：胞嘧啶（胞嘧啶（C C）尿嘧啶（尿嘧啶（U U）胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（T T）（2 2）嘌呤碱：）嘌呤碱：腺嘌呤（腺嘌呤（A A）鸟嘌呤（鸟嘌呤（G G）第二节第二节 核苷酸核苷酸(2(2碱基碱基22嘧啶嘧啶11）第二节第二节 核苷酸核苷酸(2(2碱基碱基22嘧啶嘧啶22）NNHNH2O 胞嘧啶胞嘧啶Cytosine(C)N HNHOO 尿嘧啶尿嘧啶Uracil(U)N HNHOO胸腺嘧啶胸腺嘧啶Thymine(T)注意与书上图画法的区别注意与书上图画法的区别第二节第二节 核苷酸核苷酸(2(2碱基碱基33嘌呤嘌呤11）第二节第二节 核苷酸核苷酸(2(2碱基碱基33嘌呤嘌呤22）NNN

9、HNNH2腺嘌呤腺嘌呤Adenine(A)N HNNHNONH2鸟嘌呤鸟嘌呤Guanine(G)注意与书上图画法的区别注意与书上图画法的区别第二节第二节 核苷酸核苷酸(3(3核苷核苷1 1）核苷是一种糖苷，由戌糖和碱基缩合而成核苷是一种糖苷，由戌糖和碱基缩合而成糖与碱基之间以糖苷键相连接。糖的第一糖与碱基之间以糖苷键相连接。糖的第一位上的碳原子（位上的碳原子（C C1 1）与嘧啶碱的第一位上的）与嘧啶碱的第一位上的氮原子（氮原子（N N1 1）或嘌呤碱的第九位上的氮原子）或嘌呤碱的第九位上的氮原子（N N9 9）相连，所以糖与碱基间的连键是）相连，所以糖与碱基间的连键是N-CN-C键键，一般称

10、之为，一般称之为N-N-糖苷键。糖苷键。蛋白质与糖连接时，天冬酰氨的氨基与半蛋白质与糖连接时，天冬酰氨的氨基与半羧醛羟基间形成的为羧醛羟基间形成的为N-N-糖苷键糖苷键第二节第二节 核苷酸核苷酸(3(3核苷核苷2 2）胞嘧啶核苷尿嘧啶核苷鸟嘌呤核苷腺嘌呤核苷NNOHHONNNH2HONNOHH2NNNNNNNNH2OHHOHHOHHHOCH2HOCH2OHHOHHOHHOHHOHHOHHHOCH2OHHOHHOHHHOCH2糖与碱基之间以糖与碱基之间以C-NC-N糖苷键连接糖苷键连接第二节第二节 核苷酸核苷酸(4(4核苷酸核苷酸1 1）核苷中的戌糖羟基被磷酸酯化，就形成核苷酸核苷中的戌糖羟基被

11、磷酸酯化，就形成核苷酸作为作为DNA或或RNA结构单元的核苷酸分别是结构单元的核苷酸分别是5-磷磷酸酸-脱氧核糖核苷和脱氧核糖核苷和5-磷酸磷酸-核糖核苷核糖核苷OBOHOHOH2CPOHHOOB=腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶或胸腺密啶核糖核苷酸 OH2CPOHHOOOBOH脱氧核糖核苷酸第二节第二节 核苷酸核苷酸(4(4核苷酸核苷酸2 2）磷磷酸酸碱碱基基戊糖戊糖第二节第二节 核苷酸核苷酸(4(4核苷酸核苷酸3 3）NNNNNHHNHNHOOOOHOHOHOHCH2POHOOO第二节第二节 核苷酸核苷酸(4(4核苷酸核苷酸4 4）腺腺嘌嘌呤呤 A 鸟鸟嘌嘌呤呤 G 胞胞嘧嘧啶啶 C 尿尿嘧

12、嘧啶啶 U 胸胸腺腺嘧嘧啶啶 T RNA AMP GMP CMP UMP 未未发发现现 DNA dAMP dGMP dCMP 未未发发现现 dTMP lRNARNA的名称为某（单、二、三）苷酸，的名称为某（单、二、三）苷酸，DNADNA在某在某（单、二、三）前加脱氧两字。（单、二、三）前加脱氧两字。l如如AMPAMP称腺苷称腺苷磷酸磷酸(或腺苷酸），或腺苷酸），dAMPdAMP称为脱氧称为脱氧腺苷腺苷磷酸（脱氧腺苷酸）磷酸（脱氧腺苷酸）。第二节第二节 核苷酸核苷酸(5(5多磷核苷酸多磷核苷酸1 1）参与核酸生物合成的直接原参与核酸生物合成的直接原料不是一磷酸核苷酸，而是料不是一磷酸核苷酸，而是

13、三磷酸核苷酸，如三磷酸核苷酸，如ATP ATP（三（三磷酸腺苷酸）。磷酸腺苷酸）。ATPATP上的磷酸残基用上的磷酸残基用、来编号。来编号。ATPATP含有两个高能磷酸酯键（含有两个高能磷酸酯键（P P），其水解时释），其水解时释放出的能量为放出的能量为7.37.3千卡千卡/克分子（普通磷酸酯键为克分子（普通磷酸酯键为2 2千卡千卡/克分子）。克分子）。ATPATP在细胞能量代谢中起着及其重要的作用。在细胞能量代谢中起着及其重要的作用。第二节第二节 核苷酸核苷酸(5(5多磷核苷酸多磷核苷酸2 2）O-POO-NNNNNH2OHHOHHOHHOCH2O-POO-O-POO-三磷酸腺苷(ATP)第

14、三节第三节 核酸的结构核酸的结构一、一、DNADNA的结构的结构 二、二、RNARNA的结构的结构 一、一、DNADNA的结构的结构1 1(总）总）（一）（一）DNADNA的的碱基组成的的碱基组成 （二）（二）DNADNA的一级结构的一级结构（三）（三）DNADNA的二级结构的二级结构（四）（四）DNADNA的三级结构的三级结构（一）（一）DNADNA的碱基组成的碱基组成碱基组成的规律：碱基组成的规律：1 1A=TA=T，G=CG=C A+G=C+T A+G=C+T2 2没有组织和器官的特异性没有组织和器官的特异性3 3具有种的特异性具有种的特异性4 4年龄、营养状态和环境的改变不影响年龄、营

15、养状态和环境的改变不影响DNADNA的碱的碱基组成基组成（二）（二）DNADNA的一级结构的一级结构1 1各核苷酸残基沿多核苷酸链排列的顺各核苷酸残基沿多核苷酸链排列的顺序叫核酸的一级结构。序叫核酸的一级结构。连接键：连接键：3 3，5 5一磷酸二酯键连接起来一磷酸二酯键连接起来的直线形或环形分子。的直线形或环形分子。DNADNA没有侧链。没有侧链。3553连连接接键键（二）（二）DNADNA的一级结构的一级结构3 3(线条缩写线条缩写)戊糖戊糖5-磷酸磷酸P核苷酸核苷酸53首端首端末端末端PPPPPP 核苷酸顺序又称核苷酸顺序又称碱基顺序碱基顺序，是蛋白质与核，是蛋白质与核酸结构的生物语言。

16、酸结构的生物语言。硷基硷基（二）（二）DNADNA的一级结构的一级结构4 4(字母简写字母简写)5PPPPPP 3 或或 5 3（二）（二）DNADNA的二级结构的二级结构1 1(总总)1 1DNADNA双螺旋结构模型的要点双螺旋结构模型的要点 2 2双螺旋结构的稳定因素双螺旋结构的稳定因素3 3DNADNA双螺旋的不同类型双螺旋的不同类型 （二）（二）DNADNA的二级结构的二级结构2 2公 认 的 为公 认 的 为1 9 5 31 9 5 3 年年w a t s o nw a t s o n 和和crickcrick提出提出的的DNADNA双螺双螺旋结构模型旋结构模型（二）（二）DNADN

17、A的二级结构的二级结构3 3此模型的建立主要基于两方面的根据此模型的建立主要基于两方面的根据（1 1）碱基组成）碱基组成A=TA=T，C=GC=G，并证明，并证明A A与与T T之间可生成两个氢键，而之间可生成两个氢键，而C C与与G G之间三个之间三个氢键。氢键。（2 2）X X衍射结构分析：不同来源的衍射结构分析：不同来源的DNADNA纤维具有相似的纤维具有相似的X X光衍射图谱。光衍射图谱。1 1DNADNA双螺旋结构模型要点双螺旋结构模型要点1 1（1 1）（1 1）DNADNA分子是由两条方向相反的平行的分子是由两条方向相反的平行的多核苷酸链构成。即多核苷酸链构成。即p5p5-糖糖3

18、 3-p-p的结构与的结构与p3p3-糖糖5 5-p-p的结构相对的结构相对;两条链的糖磷酸两条链的糖磷酸主链都是右手螺旋，有一共同的螺旋轴。主链都是右手螺旋，有一共同的螺旋轴。1 1DNADNA双螺旋结构模型要点双螺旋结构模型要点1 1（2 2）螺旋表螺旋表面 有 一面 有 一条 大 沟条 大 沟和 一 条和 一 条小沟小沟大沟大沟小沟小沟1 1DNADNA双螺旋结构模型要点双螺旋结构模型要点2 2（1 1）（2 2）两条链由碱）两条链由碱基间的氢键相连，基间的氢键相连，碱基对与螺旋轴垂碱基对与螺旋轴垂直直,与糖环平面垂与糖环平面垂直直;碱基在糖环的碱基在糖环的内侧，磷酸基在糖内侧，磷酸基在

19、糖环的外侧；相邻碱环的外侧；相邻碱基对平面间的距离基对平面间的距离是是0.34nm0.34nm，相邻核，相邻核苷酸彼此相差苷酸彼此相差36360 0，双螺旋的每转有双螺旋的每转有1010对核苷酸，每转高对核苷酸，每转高3.4nm3.4nm。1 1DNADNA双螺旋结构模型要点双螺旋结构模型要点3 3（3 3）碱基成对有一定的规律：）碱基成对有一定的规律：A-TA-T，C-GC-G或或T-AT-A，G-CG-CA A与与T T之间为二个氢键，之间为二个氢键，C C与与G G之间为三个氢键之间为三个氢键双螺旋双螺旋DNADNA分子整个长度的直径相同，为分子整个长度的直径相同，为2nm2nm1 1D

20、NADNA双螺旋结构模型要点双螺旋结构模型要点3 3双 螺 旋双 螺 旋DNADNA分子分子整个长度整个长度的直径相的直径相同，为同，为2nm2nm1 1DNADNA双螺旋结构模型要点双螺旋结构模型要点4 4（4 4）一个链的）一个链的碱基顺序确定后碱基顺序确定后，则另一条链必，则另一条链必有相对应的碱基有相对应的碱基顺序。顺序。碱基互补原则具碱基互补原则具有极重要意义，有极重要意义，DNADNA复制、转录、复制、转录、反转录等过程的反转录等过程的分子基础都是碱分子基础都是碱基互补配对。基互补配对。2 2双螺旋结构的稳定因素双螺旋结构的稳定因素1 1（1 1）氢键）氢键（2 2）离子键及范德华

21、力）离子键及范德华力（3 3）碱基堆积力）碱基堆积力2 2双螺旋结构的稳定因素双螺旋结构的稳定因素2 2（1 1）氢键：）氢键：两条链间碱基的相互作用，两条链间碱基的相互作用，A A与与T T之间为二之间为二条氢键，条氢键，C C与与G G之间为三条氢键。氢键作用力很弱，但之间为三条氢键。氢键作用力很弱，但DNADNA分子中存在大量氢键，因此氢键为一重要稳定因素。分子中存在大量氢键，因此氢键为一重要稳定因素。（2 2）离子键及范德华力：）离子键及范德华力：DNADNA分子中磷酸基因在生理条分子中磷酸基因在生理条件下解离，使件下解离，使DNADNA成为一种多阴离子，这有利于它与带正成为一种多阴离

22、子，这有利于它与带正电荷的其它阳离子基团发生静电作用，这样减少双链间的电荷的其它阳离子基团发生静电作用，这样减少双链间的静电排斥，有利于双螺旋的稳定。静电排斥，有利于双螺旋的稳定。（3 3）碱基堆积力：）碱基堆积力：目前普遍认为堆积碱基间的疏水作目前普遍认为堆积碱基间的疏水作用是稳定用是稳定DNADNA结构的更重要的因素。大量碱基层层堆积，结构的更重要的因素。大量碱基层层堆积，两相邻碱基的平面十分贴近，于是使双螺旋结构内部形成两相邻碱基的平面十分贴近，于是使双螺旋结构内部形成一个强大的疏水区，与介质中的小分子隔开，有利于互补一个强大的疏水区，与介质中的小分子隔开，有利于互补碱基之间氢键的形成。

23、碱基之间氢键的形成。3 3DNADNA双螺旋的不同类型双螺旋的不同类型1 1B B型型DNADNA（B BDNADNA）:在相对湿度为在相对湿度为92%92%时时,所得到的所得到的DNADNA钠盐纤维。钠盐纤维。A A型型DNADNA（A ADNADNA）:在相对温度低于在相对温度低于75%75%时，获得的时，获得的DNADNA钠盐纤维。钠盐纤维。此外还有此外还有Z ZDNADNA等。等。3 3DNADNA双螺旋的不同类型双螺旋的不同类型2 2（四）（四）DNADNA的三结构的三结构 当研究某些小病毒、线粒体、叶绿体及某些细菌中分当研究某些小病毒、线粒体、叶绿体及某些细菌中分离出来降解的离出来

24、降解的DNADNA时，发现它们的双螺旋二级结构还可进时，发现它们的双螺旋二级结构还可进一步紧缩成闭链环状或开链环状以及麻花状等，这是一步紧缩成闭链环状或开链环状以及麻花状等，这是DNADNA形成的三级结构。形成的三级结构。松弛形松弛形解链环形解链环形负超螺旋负超螺旋二、二、RNARNA的分子结构的分子结构1 1（一）（一）RNARNA一级结构一级结构（二）（二）RNARNA的碱基组成的碱基组成（三）（三）RNARNA的类型的类型（四）（四）RNARNA的二级结构的二级结构 （一）（一）RNARNA一级结构一级结构由几十个至几由几十个至几千个千个AMPAMP，GMPGMP，CMPCMP和和UMP

25、UMP四种核四种核苷酸借磷酸二酯苷酸借磷酸二酯键相连的多核苷键相连的多核苷酸链，其中不含酸链，其中不含侧链。侧链。（二）（二）RNARNA的碱基组成的碱基组成含腺嘌呤、鸟嘌呤、含腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、和尿嘧啶四胞嘧啶、和尿嘧啶四种碱基，尚含有多种种碱基，尚含有多种“稀有碱基稀有碱基”和特殊和特殊形式的核苷。形式的核苷。其中以各种甲基化其中以各种甲基化的碱基和的碱基和“假尿嘧啶假尿嘧啶核苷核苷”尤为丰富。尤为丰富。假尿苷假尿苷 这些不寻常的成分可能与这些不寻常的成分可能与tRNAtRNA的生物学功的生物学功能有一定的关系能有一定的关系（三）（三）RNARNA的类型的类型（rRNA 1rRNA

26、1）含量：含量：75-80%75-80%存在：存在：与蛋白质结合成核蛋白的形式，存在于与蛋白质结合成核蛋白的形式，存在于细胞质的核蛋白体中。细胞质的核蛋白体中。功能：功能：以核蛋白体的形式在蛋白质生物合成中以核蛋白体的形式在蛋白质生物合成中提供合适的工作场所。提供合适的工作场所。分子量分子量:它的分子量都比较大，大肠杆菌核糖体它的分子量都比较大，大肠杆菌核糖体中有三类中有三类rRNArRNA（它们的沉降系数分别为（它们的沉降系数分别为5S5S、16S16S、23S23S）；动物细胞核糖体）；动物细胞核糖体rRNArRNA有四类（有四类（5S 5S、5.8S 5.8S、18S18S和和28S28

27、S）。）。（三）（三）RNARNA的类型的类型（rRNA 2rRNA 2）大肠杆菌大肠杆菌5SRNA5SRNA的结构的结构（三）（三）RNARNA的类型的类型（tRNAtRNA）含量：含量：约占约占101015%15%存在：存在：tRNAtRNA溶于溶于“胞液胞液”部分中，它们以部分中，它们以自由状态或以氨基酸结合状态而存在。自由状态或以氨基酸结合状态而存在。分子量：分子量：都较小。都较小。功能：功能：蛋白质的生物合成中起选择性运输蛋白质的生物合成中起选择性运输原料（氨基酸）的作用，因此把原料（氨基酸）的作用，因此把tRNAtRNA叫受体叫受体RNA RNA。（三）（三）RNARNA的类型的类

28、型（mRNA1mRNA1）含量含量:占总占总RNARNA的的5%5%存在：存在：在细胞核中以在细胞核中以DNADNA为模板被合成以后，可为模板被合成以后，可能暂存于核仁内，也可能立即转移到胞质中，并能暂存于核仁内，也可能立即转移到胞质中，并以每分子以每分子mRNAmRNA与几个或几十个核蛋白体结合成串与几个或几十个核蛋白体结合成串珠样的多核蛋白体形式而存在。珠样的多核蛋白体形式而存在。特点：特点：一般都很不稳定，代谢活跃，更新迅速，一般都很不稳定，代谢活跃，更新迅速，寿命较短，种类很多。寿命较短，种类很多。功能功能:在蛋白质生物合成中起传递遗传信息的作在蛋白质生物合成中起传递遗传信息的作用，故

29、也叫信息用，故也叫信息RNARNA（iRNAiRNA）。）。（三）（三）RNARNA的类型的类型（mRNA2mRNA2）真核真核 单顺反子单顺反子5-5-末端有末端有“帽子帽子”3 -3 -末端有末端有polyApolyA片段片段原核原核 多顺反子多顺反子5-5-末端无末端无“帽子帽子”3 -3 -末端末端 无无polyApolyA片段片段顺反子：顺反子：mRNAmRNA上具有翻译功能的核苷酸顺序。上具有翻译功能的核苷酸顺序。polyApolyA片段：片段：指指10-20010-200个多聚腺苷酸，这与个多聚腺苷酸，这与mRNAmRNA顺利通顺利通过核膜进入胞浆有关，也与过核膜进入胞浆有关，也

30、与mRNAmRNA从细胞核转移到核糖从细胞核转移到核糖体的过程有关，也有人认为与病毒侵染性有关。体的过程有关，也有人认为与病毒侵染性有关。“帽子帽子”结构：结构：5-5-末端的末端的G G被甲基化，通过焦磷酸被甲基化，通过焦磷酸与另一个发生了核糖上甲基化的核苷酸以与另一个发生了核糖上甲基化的核苷酸以55、5 5-磷酸二酯键相连磷酸二酯键相连,此结构对此结构对mRNAmRNA的翻译活性是重要的。的翻译活性是重要的。（三）（三）RNARNA的类型的类型（mRNA3mRNA3）（四）（四）RNARNA的二级结构的二级结构1 1(总总)（1 1）由四臂四环组成）由四臂四环组成（2 2）叶柄是氨基酸臂）

31、叶柄是氨基酸臂（3 3）有反密码环）有反密码环（4 4）左臂连接（）左臂连接（D D环）环）（5 5）右侧有一个）右侧有一个TCTC环环（6 6）含有修饰碱基）含有修饰碱基tRNAtRNA的三叶草型结构特点（总）的三叶草型结构特点（总）D环反密码环反密码环TCTC环环可变环可变环（四）（四）RNARNA的二级结构的二级结构2 2(1)(1)（1 1）tRNAtRNA一一般由四臂四环组般由四臂四环组成。分子由成。分子由A-UA-U、G-CG-C碱基对构碱基对构成的双螺旋区叫成的双螺旋区叫做臂；不能配对做臂；不能配对部分叫部分叫环。环。1 12 23 3（四）（四）RNARNA的二级结构的二级结构

32、2 2(2)(2)（2 2）三叶）三叶草 的 叶 柄 叫草 的 叶 柄 叫做 氨 基 酸 臂做 氨 基 酸 臂，它包括，它包括3 3，端 接 受 氨 基端 接 受 氨 基酸 的 部 位酸 的 部 位 CpCpAOHCpCpAOH（四）（四）RNARNA的二级结构的二级结构2 2(3)(3)（3 3）位于氨）位于氨基酸臂对面的基酸臂对面的反密码环含有反密码环含有组成该组成该tRNAtRNA反反密码子的三个密码子的三个核苷酸。核苷酸。反密码子环反密码子环 反密码子反密码子（四）（四）RNARNA的二级结构的二级结构2 2(4)(4)（4 4）左臂连）左臂连接一个二氢尿嘧接一个二氢尿嘧啶环（啶环（D

33、 D环），环），环上含有二氢尿环上含有二氢尿嘧啶。嘧啶。D D环环（四）（四）RNARNA的二级结构的二级结构2 2(5)(5)（5 5）右侧有）右侧有一个一个T TC C环（含环（含有有T T C C顺序，顺序，代表假尿苷）代表假尿苷）和一个可变环，和一个可变环，不同不同tRNAtRNA的可变的可变环上核苷酸的数环上核苷酸的数目变化较大。目变化较大。T TC C（四）（四）RNARNA的二级结构的二级结构2 2(5)(5)（6 6）tRNAtRNA分子分子中含有修饰碱基中含有修饰碱基，但多少不等。，但多少不等。在某些位置上的在某些位置上的核苷酸对于所有核苷酸对于所有的的tRNAtRNA都是同

34、样都是同样的，或变化很少的，或变化很少叫做不变核苷酸叫做不变核苷酸。稀有碱基稀有碱基（五）（五）RNARNA的三级结构的三级结构1 1tRNAtRNA的三级结构的三级结构:倒写的倒写的L L字母字母氨基酸的接受端氨基酸的接受端3 3，-端端-CCA-CCA反密码子反密码子（五）（五）RNARNA的三级结构的三级结构2 2tRNAtRNA的三级结构的三级结构2 2第四节第四节 核酸的提取、分离和测定核酸的提取、分离和测定一、一、RNARNA的分离提取的分离提取二、二、DNADNA的提取和分离的提取和分离 三、核酸含量的测定三、核酸含量的测定 一、一、RNARNA的分离提取的分离提取1 1目前最常

35、用的为酚提取法：目前最常用的为酚提取法：即用缓冲液即用缓冲液饱和的饱和的酚溶液酚溶液直接处理组织或细胞，以除去其中的蛋白质和直接处理组织或细胞，以除去其中的蛋白质和DNADNA若加入适量若加入适量十二烷基硫酸钠或其它去污剂十二烷基硫酸钠或其它去污剂可进一步抑制可进一步抑制核糖核酸酶，并使蛋白质去除得更加干净。核糖核酸酶，并使蛋白质去除得更加干净。将得到的将得到的RNARNA提取液用提取液用乙醇乙醇反复沉淀数次，溶解后进行反复沉淀数次，溶解后进行透析，再冷冻干燥。透析，再冷冻干燥。提取不同种类的提取不同种类的RNARNA时，也可将各种亚细胞部分事先分时，也可将各种亚细胞部分事先分开（因为不同种类

36、的开（因为不同种类的RNARNA存在于细胞中的不同部位），然存在于细胞中的不同部位），然后分别从核蛋白体中提取后分别从核蛋白体中提取rRNArRNA，从多核蛋白体中提取，从多核蛋白体中提取mRNAmRNA，从去除这些成分及其它颗粒后的细胞液中提取，从去除这些成分及其它颗粒后的细胞液中提取tRNAtRNA。一、一、RNARNA的分离提取的分离提取2 21 1密度梯度离心法密度梯度离心法2 22 2柱层析法柱层析法3 3凝胶电泳法凝胶电泳法一、一、RNARNA的分离提取的分离提取3 3(1)(1)离心管中放离心管中放30%-5%30%-5%的的蔗糖溶液。蔗糖溶液。欲分离欲分离RNARNA溶液放在蔗

37、糖溶液放在蔗糖溶液面上。溶液面上。经高速离心数小时后，经高速离心数小时后，分子大小不同的分子大小不同的RNARNA即分即分散于不同密度的蔗糖部位散于不同密度的蔗糖部位中。中。应用啡啶溴红应用啡啶溴红氯化铯氯化铯密度梯度平衡超离心，可密度梯度平衡超离心，可分开不同构象的分开不同构象的DNADNA、RNARNA和蛋白质。和蛋白质。1 1密度梯度离心法密度梯度离心法1 15蔗糖蔗糖10蔗糖蔗糖20蔗糖蔗糖30蔗糖蔗糖一、一、RNARNA的分离提取的分离提取3 3(2)(2)1 1密度梯度离心法密度梯度离心法2 2石蜡油石蜡油蛋白质蛋白质开环形及开环形及线性线性DNA闭环形质闭环形质粒粒DNARNA用

38、垂直转头用垂直转头6500065000转转6h6h，角转头，角转头4500045000转转36h36h，离心后，蛋白质在最上离心后，蛋白质在最上面，面，RNARNA沉淀在底部，超沉淀在底部，超螺旋螺旋DNADNA沉淀较快，开链沉淀较快，开链或环形或环形DNADNA沉淀较慢。沉淀较慢。此法分离的此法分离的DNADNA纯度较纯度较高，可供高，可供DNADNA重组等实验重组等实验用。如需更纯品，可再用。如需更纯品，可再进行一次氯化铯密度梯进行一次氯化铯密度梯度离心。度离心。一、一、RNARNA的分离提取的分离提取4 42 2柱层析法柱层析法常用的支持体为二乙胺乙基（常用的支持体为二乙胺乙基（DEAE

39、DEAE）纤维）纤维素（离子交换），葡聚糖凝胶等（凝胶过滤）素（离子交换），葡聚糖凝胶等（凝胶过滤）因为核酸和核苷酸是两性电解质，在一定因为核酸和核苷酸是两性电解质，在一定的的pHpH值条件下各解离基团的解离情况不同，值条件下各解离基团的解离情况不同，即有与蛋白质相似的等电点（南大即有与蛋白质相似的等电点（南大P147P147）。）。一、一、RNARNA的分离提取的分离提取5 53 3凝胶电泳法凝胶电泳法不同种类的不同种类的RNARNA分子所带电荷与其质量之比分子所带电荷与其质量之比都非常接近，故用一般电泳方法不易分开。都非常接近，故用一般电泳方法不易分开。若以某些凝胶为支持体进行电泳，由于凝

40、若以某些凝胶为支持体进行电泳，由于凝胶的分子筛作用可影响不同胶的分子筛作用可影响不同RNARNA的泳动速度，的泳动速度，则可得到较好的分离效果。则可得到较好的分离效果。二、二、DNADNA的提取和分离的提取和分离0.14mol法法:处理方法处理方法结果结果浓浓NaClNaCl溶液（溶液（1-21-2M M）提取组织中的核蛋白提取组织中的核蛋白稀释至稀释至0.140.14mol mol 后后DNADNA核蛋白的沉出核蛋白的沉出RNARNA核蛋白则不沉出核蛋白则不沉出浓浓NaClNaCl溶解溶解DNADNA核蛋白核蛋白氯仿或酚氯仿或酚除去其中的蛋白质除去其中的蛋白质乙醇沉淀乙醇沉淀提取溶液中的提取

41、溶液中的DNADNA 蔗糖密度梯度离心法蔗糖密度梯度离心法 分开各种分开各种DNADNACSClCSCl或或CsCs2 2SOSO2 2浓溶液的密浓溶液的密度梯度离心法度梯度离心法 分开单股和双股分开单股和双股DNADNA三、核酸含量的测定三、核酸含量的测定1 1紫外吸收：紫外吸收：嘌呤嘌呤碱与嘧啶碱有共碱与嘧啶碱有共轭双键，使碱基轭双键，使碱基核苷、核苷酸和核苷、核苷酸和核酸在核酸在240240290nm290nm紫外波段有紫外波段有一强烈的吸收峰，一强烈的吸收峰，最大吸收值在最大吸收值在260nm260nm附近。附近。不同核苷酸有不同的吸收特性，所以可以用紫不同核苷酸有不同的吸收特性，所以

42、可以用紫外分光光度计定量及定性测定。外分光光度计定量及定性测定。三、核酸含量的测定三、核酸含量的测定2 2对待测样品是否纯品可用对待测样品是否纯品可用260nm260nm与与280nm280nm的的ODOD值，从值，从ODOD260260/280280的比值即可判断。纯的的比值即可判断。纯的DNADNA的比值应为的比值应为1.81.8，纯，纯RNARNA为为2.02.0，如样品中含，如样品中含杂蛋白，测量比值明显下降。杂蛋白，测量比值明显下降。通常通常1OD1OD值相当于值相当于5050g/mlg/ml双螺旋双螺旋DNADNA或或4040g/mlg/ml单螺旋单螺旋DNADNA（或（或RNAR

43、NA）或）或2020g/mlg/ml寡寡核苷酸计算。不纯的样品可用琼脂糖凝胶电核苷酸计算。不纯的样品可用琼脂糖凝胶电泳分离出区带后，经啡啶溴红染色可粗略估泳分离出区带后，经啡啶溴红染色可粗略估计其含量。计其含量。琼脂糖凝胶电泳图琼脂糖凝胶电泳图 6 4kb 8kb 10kb 6kb 三、核酸含量的测定三、核酸含量的测定2 2第五节第五节 核酸的变性、复性与杂交核酸的变性、复性与杂交一、变性一、变性二、复性二、复性三、杂交三、杂交四、核酸序列分析四、核酸序列分析一、变性一、变性1 1定义：定义：指核酸双螺旋区氢键断裂，变成单链，它并不涉指核酸双螺旋区氢键断裂，变成单链，它并不涉及共价键（磷酸二酯

44、键）的断裂。及共价键（磷酸二酯键）的断裂。变性因素：变性因素：热变性、酸碱变性等。热变性、酸碱变性等。一、变性一、变性2 2一、变性一、变性3 3（TmTm值值1 1）通常把通常把DNADNA的双螺旋结构失去一半时的温度称该的双螺旋结构失去一半时的温度称该DNADNA的溶点或溶解温度，用的溶点或溶解温度，用TmTm表示，表示，DNADNA的的TmTm值一值一般在般在707085850 0C C之间。之间。变性的相对量变性的相对量温度温度0 0C C60801001.01.21.41.60TmTmTmTmTmTm100%Poly d(A-T)Poly d(G-C)DNA一、变性一、变性3 3（T

45、mTm值值2 2）TmTm值的大小与下列因素有关：值的大小与下列因素有关：（1 1）DNADNA的均一性的均一性 （2 2）G-CG-C含量含量 （3 3）介质中的离子强度）介质中的离子强度一、变性一、变性3 3（TmTm值值3 3）影响影响TmTm值大小的因素值大小的因素1 1（1 1）DNADNA的均一性：一般均一性越高，的均一性：一般均一性越高，TmTm值的变值的变动范围越小。动范围越小。（2 2）G-CG-C含量：含量：G-CG-C含量越高，含量越高，TmTm值越大，值越大，TmTm与与G-G-C C含量成正比关系。因为含量成正比关系。因为G-CG-C比比A-TA-T更稳定（氢键）。更

46、稳定（氢键）。TmTm与所含与所含G-CG-C的多少的关系，可用经验公式计算不的多少的关系，可用经验公式计算不同同DNADNA的的TmTm：（G GC C）(Tm(Tm69.3)69.3)2.442.44一、变性一、变性3 3（TmTm值值4 4）TmTm与所与所含含G-CG-C的多少的多少有关有关影响影响TmTm值大小的因素值大小的因素2 2一、变性一、变性3 3（TmTm值值5 5）（3 3）介质中的离子强）介质中的离子强度：一般离子强度较低，度：一般离子强度较低，DNADNA的的TmTm值也较低，范值也较低，范围也越窄。围也越窄。温度温度0 0C C70801001.21.41.5901

47、.11.3 A A 2602600.010.020.050.20.10.51.0影响影响TmTm值大小的因素值大小的因素3 3大肠杆菌大肠杆菌DNADNA在不同在不同KClKCl浓度下的浓度下的TmTm二、复性二、复性1 1定义：定义：变性变性DNADNA在适当条件下，又可使两条彼此分开的链在适当条件下，又可使两条彼此分开的链重新缔合成双螺旋结构。重新缔合成双螺旋结构。二、复性二、复性2 2DNADNA复性后，许多物化性质又得到恢复，生物活性可以得复性后，许多物化性质又得到恢复，生物活性可以得到部分恢复。但将热变性的到部分恢复。但将热变性的DNADNA骤然冷却，不能复性，只骤然冷却，不能复性，

48、只有缓慢冷却时才可以复性。有缓慢冷却时才可以复性。二、复性二、复性3 3（影响因素）（影响因素）1 1DNADNA浓度：浓度高时，两条互补链彼此相碰的浓度：浓度高时，两条互补链彼此相碰的机会增加，易于复性。机会增加，易于复性。2 2温度：加热变性的温度：加热变性的DNADNA，当温度超过，当温度超过TmTm后，如后，如迅速冷却到低温时不能复性，但当溶液维持在迅速冷却到低温时不能复性，但当溶液维持在TmTm以下的较高温度时，以下的较高温度时，则可复性，一般比则可复性，一般比TmTm低低25250 0C C左右时最佳。左右时最佳。3 3DNADNA片段大小的影响：大的线状单链，其扩散片段大小的影响

49、：大的线状单链，其扩散速度受到妨碍，减少了互补链的碰撞机会。速度受到妨碍，减少了互补链的碰撞机会。三、核酸的杂交三、核酸的杂交1 1概念：两种来源概念：两种来源不同，具有互补不同，具有互补碱基序列的多核碱基序列的多核苷酸片段在溶液苷酸片段在溶液中冷却时，可以中冷却时，可以再形成双螺旋结再形成双螺旋结构，称为杂交作构，称为杂交作用。用。DNADNA和和DNADNA杂交以杂交以及及DNADNA和和RNARNA杂交杂交在核酸技术中占在核酸技术中占有十分重要的地有十分重要的地位。位。三、核酸的杂交三、核酸的杂交2 2（一）核酸研究的主要工具酶（一）核酸研究的主要工具酶（二）核酸的杂交技术（二）核酸的杂

50、交技术（一）核酸研究的主要工具酶（一）核酸研究的主要工具酶1 1核糖核酸酶类（核糖核酸酶类（RNARNA酶类）酶类）2 2脱氧核糖核酸酶类（脱氧核糖核酸酶类（DNADNA酶）酶）3 3非专一性核酸酶类非专一性核酸酶类1 1核糖核酸酶类（核糖核酸酶类（RNARNA酶类酶类1 1）（1 1）牛胰）牛胰RNARNA酶（酶（RNaseARNaseA或或RNaseIRNaseI）（2 2）RNARNA酶酶T T1 1（RNaseTRNaseT1 1）1 1核糖核酸酶类（核糖核酸酶类（RNARNA酶类酶类2 2）专一作用专一作用RNARNA，而不作用于，而不作用于DNA;DNA;其分子量其分子量14,00