第三章-蛋白质化学课件.ppt

1、第三章第三章 蛋白质化学蛋白质化学一、氨基酸一、氨基酸二、肽二、肽三、蛋白质的分子结构三、蛋白质的分子结构四、蛋白质结构与功能的关系四、蛋白质结构与功能的关系五、蛋白质的重要性质五、蛋白质的重要性质六、蛋白质的分类六、蛋白质的分类七、蛋白质的分离提纯及应用七、蛋白质的分离提纯及应用蛋白质蛋白质(protein)(protein)是由许多是由许多氨基酸氨基酸(amino acids)(amino acids)通过通过肽键肽键相相连形成的高分子含氮化合物连形成的高分子含氮化合物。各种蛋白质的含氮量很接近，平均为各种蛋白质的含氮量很接近，平均为1616，由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只由于体

2、内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：公式推算出蛋白质的大致含量：样品中蛋白质的含量样品中蛋白质的含量 =样品含氮量样品含氮量 6.25 6.25三聚氰胺相对分子质量：相对分子质量：126，含氮量含氮量66.6，蛋白质的生物学功能蛋白质的生物学功能一、氨基酸一、氨基酸 存在自然界中的氨基酸有存在自然界中的氨基酸有300余种，但目前余种，但目前一般认为一般认为组成生物蛋白质的氨基酸仅有组成生物蛋白质的氨基酸仅有20种种。蛋白质氨基酸蛋白质氨基酸氨基酸氨基酸 非蛋白质氨基酸非蛋白质氨基酸本课程所

3、讲的氨基酸均为蛋白质氨基酸本课程所讲的氨基酸均为蛋白质氨基酸（一）氨基酸的结构与分类（一）氨基酸的结构与分类1 1、氨基酸的结构共性氨基酸的结构共性(1)(1)除脯氨酸（除脯氨酸（亚氨基酸）外，与羧基相邻亚氨基酸）外，与羧基相邻的的碳原子上含有一个氨基，因而称为碳原子上含有一个氨基，因而称为氨基酸。氨基酸。脯氨酸脯氨酸(2)-氨基酸除甘氨酸外氨基酸除甘氨酸外,其其-碳原子是一个手性碳原子是一个手性碳原子，天然蛋白质氨基酸均为碳原子，天然蛋白质氨基酸均为L-型氨基酸型氨基酸。甘氨酸甘氨酸 2 2、氨基酸的分类、氨基酸的分类按按R R基团的性质进行分类基团的性质进行分类*20 20种氨基酸的名称、

4、种氨基酸的名称、缩写符号缩写符号及分类如下及分类如下:非极性非极性AAAA（1 1）按按R R基团的极性分基团的极性分 酸性酸性AAAA 极性极性AA AA 碱性碱性AAAA 极性非解离氨基酸极性非解离氨基酸 疏水性疏水性R R基团基团AAAA（2 2）按）按R R基团的疏水性和亲水性分基团的疏水性和亲水性分 亲水性亲水性R R基团基团AAAA （3 3）按）按R R基团的化学结构分基团的化学结构分 脂肪族脂肪族AAAA 芳香族芳香族AAAA 杂环族杂环族AAAA 非极性氨基酸非极性氨基酸 名称名称 符号符号 结构结构 丙氨酸丙氨酸 AlaAla H2NCH CCH3OHOalanine ln

5、i:n非极性氨基酸非极性氨基酸 名称名称 符号符号 结构结构 丙氨酸丙氨酸 AlaAla缬氨酸缬氨酸 ValVal H2NCH CCHOHOCH3CH3valine vli:n异丙基异丙基 非极性氨基酸非极性氨基酸 名称名称 符号符号 结构结构 丙氨酸丙氨酸 AlaAla缬氨酸缬氨酸 ValVal亮氨酸亮氨酸 LeuLeu H2NCH CCH2OHOCH CH3CH3 leucinelu:si:n季碳原子周围连了季碳原子周围连了4个碳个碳叔碳原子周围连了叔碳原子周围连了3个碳个碳仲碳原子周围连了仲碳原子周围连了2个碳个碳伯碳原子周围连了伯碳原子周围连了1个碳个碳异丁基异丁基非极性氨基酸非极性氨

6、基酸 名称名称 符号符号 结构结构 丙氨酸丙氨酸 AlaAla缬氨酸缬氨酸 ValVal亮氨酸亮氨酸 LeuLeu异亮氨酸异亮氨酸 Ilele H2NCH CCHOHOCH3CH2CH3叔碳Isoleucineaslu:si:n仲丁基仲丁基 非极性氨基酸非极性氨基酸 名称名称 符号符号 结构结构 丙氨酸丙氨酸 AlaAla缬氨酸缬氨酸 ValVal亮氨酸亮氨酸 LeuLeu异亮氨酸异亮氨酸 Ile le 脯氨酸脯氨酸 ProPro HNCOHO-吡咯烷基 proline prli:n 非极性氨基酸非极性氨基酸 名称名称 符号符号 结构结构 丙氨酸丙氨酸 AlaAla缬氨酸缬氨酸 ValVal亮

7、氨酸亮氨酸 LeuLeu异亮氨酸异亮氨酸 Ile le 脯氨酸脯氨酸 ProPro苯丙氨酸苯丙氨酸 PhePhe H2NCHCCH2OHOPhenylalaninefenllnin苯甲基苯甲基（苄基）（苄基）非极性氨基酸非极性氨基酸 名称名称 符号符号 结构结构 丙氨酸丙氨酸 AlaAla缬氨酸缬氨酸 ValVal亮氨酸亮氨酸 LeuLeu异亮氨酸异亮氨酸 I Ile le 脯氨酸脯氨酸 ProPro苯丙氨酸苯丙氨酸 PhePhe色氨酸色氨酸 Try Try H2NCHCCH2OHOHN吲哚（苯并吡咯吲哚（苯并吡咯）Tryptophan trptfn 非极性氨基酸（非极性氨基酸（8）名称名称

8、符号符号 结构结构 丙氨酸丙氨酸 AlaAla缬氨酸缬氨酸 ValVal亮氨酸亮氨酸 LeuLeu异亮氨酸异亮氨酸 I Ile le 脯氨酸脯氨酸 ProPro苯丙氨酸苯丙氨酸 PhePhe色氨酸色氨酸 Try Try 甲硫氨酸甲硫氨酸 MetMet H2NCHCCH2OHOCH2SCH3甲基硫醚基甲基硫醚基methionine极性大可解离带负电荷（酸性氨基酸）极性大可解离带负电荷（酸性氨基酸）名称名称 符号符号 结构结构天冬氨酸天冬氨酸 Asp Asp H2NCH CCH2OHOCOHOaspartic acid sp:tk极性极性大可解离带负电荷（大可解离带负电荷（酸性氨基酸）酸性氨基酸）

9、名称名称 符号符号 结构结构天冬氨酸天冬氨酸 Asp Asp谷氨酸谷氨酸 GluGlu H2NCH CCH2OHOCH2COHOglutamic acid lu:tmik 极性极性大可解离带正电荷（大可解离带正电荷（碱性氨基酸）碱性氨基酸）名称名称 符号符号 结构结构赖氨酸赖氨酸 LysLys H2NCHCCH2OHOCH2CH2CH2NH2 lysine lasi:n极性极性大可解离带正电荷（大可解离带正电荷（碱性氨基酸）碱性氨基酸）名称名称 符号符号 结构结构赖氨酸赖氨酸 LysLys精氨酸精氨酸 ArgArg H2NCHCCH2OHOCH2CH2NHCNH2NH胍基 arginine:d

10、ni:n极性极性大可解离带正电荷（大可解离带正电荷（碱性氨基酸）碱性氨基酸）名称名称 符号符号 结构结构赖氨酸赖氨酸 LysLys精氨酸精氨酸 ArgArg组氨酸组氨酸 HisHis H2NCH CCH2OHONNH咪唑 histidinehstdi:n极性非解离氨基酸极性非解离氨基酸 名称名称 符号符号 结构结构甘氨酸甘氨酸 GlyGly H2NCH CHOHO glycine glasi:n极性非解离氨基酸极性非解离氨基酸 名称名称 符号符号 结构结构甘氨酸甘氨酸 GlyGly丝氨酸丝氨酸 SerSer H2NCH CCH2OHOOHserine seri:n极性非解离氨基酸极性非解离氨基

11、酸 名称名称 符号符号 结构结构甘氨酸甘氨酸 GlyGly丝氨酸丝氨酸 SerSer苏氨酸苏氨酸 ThrThr H2NCH CCHOHOOHCH3threonineri:ni:n极性非解离氨基酸极性非解离氨基酸 名称名称 符号符号 结构结构甘氨酸甘氨酸 GlyGly丝氨酸丝氨酸 SerSer苏氨酸苏氨酸 ThrThr半胱氨酸半胱氨酸 CysCys H2NCH CCH2OHOSHcysteine sstn极性非解离氨基酸极性非解离氨基酸 名称名称 符号符号 结构结构甘氨酸甘氨酸 GlyGly丝氨酸丝氨酸 SerSer苏氨酸苏氨酸 ThrThr半胱氨酸半胱氨酸 CysCys酪氨酸酪氨酸 TyrTy

12、r H2NCHCCH2OHOOH对羟苯基 tyrosine trsi:n极性非解离氨基酸极性非解离氨基酸 名称名称 符号符号 结构结构甘氨酸甘氨酸 GlyGly丝氨酸丝氨酸 SerSer苏氨酸苏氨酸 ThrThr半胱氨酸半胱氨酸 CysCys酪氨酸酪氨酸 TyrTyr天冬酰胺天冬酰胺 AsnAsn H2NCH CCH2OHOCNH2O甲酰胺 asparaginesprdi:n极性非解离氨基酸极性非解离氨基酸 名称名称 符号符号 结构结构甘氨酸甘氨酸 GlyGly丝氨酸丝氨酸 SerSer苏氨酸苏氨酸 ThrThr半胱氨酸半胱氨酸 CysCys酪氨酸酪氨酸 TyrTyr天冬酰胺天冬酰胺 AsnA

13、sn谷氨酰胺谷氨酰胺 GluGlu H2NCHCCH2OHOCH2CNH2Oglutamineglu:tmi:n分类中，极性大小，是否能解离，酸碱性氨分类中，极性大小，是否能解离，酸碱性氨基酸只涉及基酸只涉及R基团。基团。人体所需的八种必需氨基酸人体所需的八种必需氨基酸 赖氨酸赖氨酸(Lys)(Lys)缬氨酸缬氨酸(Val)(Val)蛋氨酸蛋氨酸(Met)(Met)色氨酸色氨酸(Trp)(Trp)苏氨酸苏氨酸(Thr)(Thr)异亮氨酸异亮氨酸(Ile)(Ile)苯丙氨酸苯丙氨酸(Phe)(Phe)亮氨酸亮氨酸(Leu)(Leu)（二）氨基酸的理化性质（二）氨基酸的理化性质1、两性解离及等电点

14、两性解离及等电点两性解离两性解离 氨基酸具有质子受体和质子供体的功能，氨基酸具有质子受体和质子供体的功能，是两性电解质。是两性电解质。CHNH2COOHR CHNH2COOHRCHNH3+COO-R CHNH3+COO-RpH=pI+OH-pHpI+H+OH-+H+pHpI氨基酸的兼性离子氨基酸的兼性离子 阳离子阳离子阴离子阴离子CHNH2COOHR CHNH2COOHRCHNH3+COO-R CHNH3+COO-RCHNH2COO-R CHNH2COO-RCH COOHRNH3+CH COOHRNH3+氨基酸的解离取决于所处溶液的氨基酸的解离取决于所处溶液的PH值值。等电点等电点(pI)在某

15、一在某一pHpH的溶液中，氨基酸解离成阳离的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈子，呈电中性电中性。此时溶液的。此时溶液的pHpH值值称为该氨基称为该氨基酸的等电点。酸的等电点。一般一氨基一羧基的氨基酸等电点在一般一氨基一羧基的氨基酸等电点在pH pH 6 6左右，这是由于羧基的解离程度大于氨基，左右，这是由于羧基的解离程度大于氨基，故故PIPI偏酸，碱性氨基酸偏酸，碱性氨基酸pIpI在在pH 10pH 10左右，酸性左右，酸性氨基酸的氨基酸的pIpI在在pH 3pH 3左右。左右。氨基酸等电点的计算氨基酸等电点的计算pI为

16、兼性离子两边为兼性离子两边pKpK 的平均值的平均值（pKpK为表观解离常数的负对数值）为表观解离常数的负对数值）中性氨基酸：中性氨基酸：pI=(pKpI=(pK1+pK1+pK2)/2 2)/2 酸性氨基酸：酸性氨基酸：pI=(pKpI=(pK1+pK1+pKR-COO-)/2 R-COO-)/2 碱性氨基酸：碱性氨基酸：pI=(pKpI=(pK2+pK2+pKR-NH2)/2 R-NH2)/2 P15P15甘氨酸甘氨酸(Gly)滴定曲线滴定曲线pI=(pK1 11+pK2 2)/2+H+K1+H+K2氨基酸的解离常数可以用测定氨基酸的解离常数可以用测定滴定曲线的实验方法求得。滴定曲线的实验

17、方法求得。甘氨酸的滴定甘氨酸的滴定曲线：曲线：l当当1mol1mol的甘氨酸溶于水的甘氨酸溶于水时，溶液的时，溶液的pHpH约为约为6 6，此，此时甘氨酸为兼性离子状时甘氨酸为兼性离子状态态A A0 0。l若用标准若用标准NaOHNaOH滴定，已滴定，已加入的加入的NaOHNaOH摩尔数对摩尔数对pHpH作图，得滴定曲线作图，得滴定曲线B,B,在在pH9.60pH9.60处有一拐点（滴处有一拐点（滴定中点定中点)。0 H+OH-A0ABA+A0 A-0 H+OH-l A0作为酸，由作为酸，由NH3+提供提供质子，逐渐变为质子，逐渐变为A-,滴定滴定中点时有一半中点时有一半A0变为变为A-,即即

18、 A0=A-，K2=A-H+A0则则 K2=H+pK2=pH(拐点处）拐点处）pKpK2 2就是就是A A0 0 的的NHNH3 3+50%50%解离时解离时溶液的溶液的pHpH值，值，K K2 2就是此时溶就是此时溶液的液的HH+A-A0A0=A-A+ABA+A0 A-l 若用若用HCl滴定，得滴定滴定，得滴定曲线曲线A，在，在pH2.34 处处有一拐点，拐点处有一拐点，拐点处pH即为即为pK1。l R基不解离的氨基酸都基不解离的氨基酸都有类似甘氨酸有类似甘氨酸的滴定的滴定曲线。曲线。0 H+OH-A0=A+A0A+ABA+A0 A-A0=A-甘氨酸的解离：阳离子（阳离子（A A+）兼性离子

19、（兼性离子（A A0 0）阴离子（阴离子（A-）K1=A0 H+A+K2=A-H+A0K1K2=H+2A-A+等电点时：等电点时：A+=A-,因此因此 H+2=K1K2 pI=(pK1+pK2)/2 所以，甘氨酸所以，甘氨酸 pI=(2.34+9.69)/2=6.02所以所以pI=(pK1+pKR)/2谷氨酸谷氨酸 (Glu)(Glu)滴定曲线滴定曲线（两个羧基（两个羧基pK值和的一半）值和的一半）pI=(pKR+pK2)/2组氨酸组氨酸(His)(His)滴定曲线滴定曲线（两个氨基（两个氨基pK值和的一半）值和的一半）氨基酸有时被用作缓冲剂，缓冲剂是当加入酸或氨基酸有时被用作缓冲剂，缓冲剂是

20、当加入酸或碱时具有抗碱时具有抗pHpH改变的溶液，缓冲剂起作用的改变的溶液，缓冲剂起作用的pHpH范范围称为缓冲范围，通常定义为围称为缓冲范围，通常定义为pK+1pK+1至至pK-1pK-1。生理生理pHpH条件下那些氨基酸具有缓冲作用？条件下那些氨基酸具有缓冲作用？2020种基本氨基酸中只有组氨酸的咪唑基的种基本氨基酸中只有组氨酸的咪唑基的pKpK最接近生理最接近生理pHpH值（游离氨基酸中为值（游离氨基酸中为6.006.00，在多，在多肽链中为肽链中为7.35 7.35），是在生理），是在生理pHpH条件下唯一具有条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸。缓冲能力的氨基酸。2 2、氨基酸的光学性质、

21、氨基酸的光学性质 构成蛋白质的构成蛋白质的2020种氨基酸在可见光区都没有种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区光吸收，但在远紫外区(220nm)(pI净电荷为负净电荷为负PrCOOHNH3+H+OH-+H+OH-PrCOO-NH2PrCOO-NH3+pHpI净电荷为正净电荷为正不处于等电状态的蛋白质分子，由于带有电荷，可采用电不处于等电状态的蛋白质分子，由于带有电荷，可采用电泳技术进行分离。泳技术进行分离。在等电点时在等电点时，蛋白质没有相同电荷间的相互排斥，蛋白质没有相同电荷间的相互排斥，最不稳定最不稳定，溶解度最小，溶解度最小，极易形成沉淀析出极易形成沉淀析出；粘；粘度、渗透压、膨

22、胀性和导电能力均为最小。度、渗透压、膨胀性和导电能力均为最小。（二）蛋白质的胶体性质（二）蛋白质的胶体性质分散系统分散系统真溶液分散相质点真溶液分散相质点悬浊液：分散相质点悬浊液：分散相质点胶体溶液胶体溶液分散相质点分散相质点 蛋白质蛋白质的分子大小范围属于胶体质点的范围，的分子大小范围属于胶体质点的范围，是一种亲水胶体是一种亲水胶体。蛋白质具有胶体的一切特性，如布朗运动、蛋白质具有胶体的一切特性，如布朗运动、丁达尔现象、电泳现象、不能透过半透膜及具丁达尔现象、电泳现象、不能透过半透膜及具有吸附能力等有吸附能力等 利用蛋白质不能透过半透膜的性质，可用利用蛋白质不能透过半透膜的性质，可用羊皮纸、

23、火棉胶、玻璃纸等来分离纯化蛋白质，羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等来分离纯化蛋白质，这个方法称这个方法称透析法透析法 蛋白质蛋白质胶体胶体的稳定因素的稳定因素（1 1）两性电解质，由于静电力的作用，分子间相）两性电解质，由于静电力的作用，分子间相互排斥，形成稳定的分散系。互排斥，形成稳定的分散系。（2 2）蛋白质周围形成水化膜，保护了蛋白质粒子。）蛋白质周围形成水化膜，保护了蛋白质粒子。蛋白质相对分子量在蛋白质相对分子量在600060001 000 0001 000 000之之间。测定分子量的主要方法有：超离心法间。测定分子量的主要方法有：超离心法（沉降分析法）、凝胶过滤法、聚丙烯酰（沉降分析法）、凝

24、胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等和化学组成法。胺凝胶电泳等和化学组成法。（三）蛋白质分子量及其确定方法（三）蛋白质分子量及其确定方法沉降速度法沉降速度法FcFbFf 蛋白质在离心场中沉降时蛋白质在离心场中沉降时:F Fc c(离心力离心力)=m mp p2（离心加速度）离心加速度）F Fb b(浮力浮力)=V Vp p2=m mp p2 F Ff f(摩擦力摩擦力)=f f=f(d f(d/dt)/dt)通过测定沉降界面的移动速度测定通过测定沉降界面的移动速度测定Mr.dx/dtMr.dx/dt为为常数常数 F Fc c-F-Fb b=F Ff f (d (d/dt)m/dt)mp p（1-1-

25、）2 f f=沉降系数：单位离心力场的沉降速度叫沉降系数，沉降系数：单位离心力场的沉降速度叫沉降系数，用用s s表示。表示。s=(dx/dt)/s=(dx/dt)/2 2=m=mp p(1-)/f(1-)/f 沉降系数只与分子的大小和形状有关，当分子形沉降系数只与分子的大小和形状有关，当分子形状相似时，状相似时，s s与分子量成正比。因此与分子量成正比。因此s s常用作生物常用作生物大分子的大小表示方法大分子的大小表示方法。由于由于s s值较小，因此用值较小，因此用1 11010-13-13秒表示秒表示1 1个沉降系个沉降系数单位（数单位（Svedberg unitSvedberg unit）

26、。）。S S值与温度和溶剂值与温度和溶剂有关，所以，一个分子的沉降系数定义为摄氏有关，所以，一个分子的沉降系数定义为摄氏2020度，水溶液条件下的度，水溶液条件下的s s值为标准。值为标准。1S=11S=11010-13-13（s s）凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质。凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质。不论是天然凝胶还是人工合成的凝胶，不论是天然凝胶还是人工合成的凝胶，它们的内部都具有很细微的多孔网状结它们的内部都具有很细微的多孔网状结构。凝胶层析的机理是分子筛效应构。凝胶层析的机理是分子筛效应(又称又称分子筛层析分子筛层析)，如同过筛那样，它可以把，如同过筛那样，它可以把物质按分子大小不

27、同进行分离，但这种物质按分子大小不同进行分离，但这种“过筛过筛”与普通的过筛不一样。与普通的过筛不一样。凝胶过滤法凝胶过滤法分子筛层析的工作原理分子筛层析的工作原理 在洗脱过程中，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进人凝胶颗粒内部的多孔而小分子可以进人凝胶颗粒内部的多孔网状结构，流速缓慢，以致最后流出柱网状结构，流速缓慢，以致最后流出柱外，外，从而使样品中分子大小不同的物质从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。得到分离。A.A.小分子由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞小分子由于扩散作用进入

28、凝胶颗粒内部而被滞留，大分子被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之留，大分子被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。间迅速通过。B.(1)B.(1)蛋白质混合物上柱；蛋白质混合物上柱；(2)(2)洗脱开始，小分子扩散进入凝胶颗粒内，大洗脱开始，小分子扩散进入凝胶颗粒内，大分子则被排阻在颗粒之外，大小分子开始分开；分子则被排阻在颗粒之外，大小分子开始分开；(3)(3)小分子被滞留，大分子向下移动，大小分小分子被滞留，大分子向下移动，大小分子完全分开；子完全分开；(4)(4)大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在行进中。子尚在行进中。SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶

29、电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳vSDSSDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，可破坏蛋白质氢键和疏水作用使蛋白质变性。可破坏蛋白质氢键和疏水作用使蛋白质变性。vSDSSDS带有很多负电荷，与蛋白质结合（带有很多负电荷，与蛋白质结合（1.41.4克克SDS/1SDS/1克蛋白质）后，克蛋白质）后，SDSSDS的负电荷远远超过了蛋的负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷，蛋白质分子原有的电荷就白质分子原有的电荷，蛋白质分子原有的电荷就变得无足轻重了，所以在电场上移动的速度完全变得无足轻重了，所以在电场上移动的速度完全取决于蛋白质分子的大小。取决于蛋白质分子的大小。v

30、在在SDSSDS和巯基乙醇存在下，蛋白质和亚基的肽链和巯基乙醇存在下，蛋白质和亚基的肽链完全伸展成长棒状（完全伸展成长棒状（1.8nm1.8nm），其分子量与肽链的），其分子量与肽链的长度成比例。长度成比例。logM=a-blogM=a-bR（四）蛋白质的沉淀反应（四）蛋白质的沉淀反应 1 1、盐析法盐析法 2 2、有机溶剂沉淀法、有机溶剂沉淀法 3 3、重金属盐沉淀法、重金属盐沉淀法 4 4、生物碱试剂沉淀法、生物碱试剂沉淀法 5 5、加热变性沉淀、加热变性沉淀沉淀方法沉淀方法前两种方法可以使蛋白质不变性，后前两种方法可以使蛋白质不变性，后3 3种方法通常会使蛋种方法通常会使蛋白质变性。白质

31、变性。盐析法盐析法:在蛋白质溶液中加入高浓度的中性盐，而在蛋白质溶液中加入高浓度的中性盐，而使蛋白质颗粒集聚而生成沉淀，这种现象称为使蛋白质颗粒集聚而生成沉淀，这种现象称为盐析盐析。原因：原因：高浓度的中性盐，可有效地破坏蛋白质颗粒的高浓度的中性盐，可有效地破坏蛋白质颗粒的水化层水化层。同时又抑制蛋白质的解离而减少蛋白质表面的同时又抑制蛋白质的解离而减少蛋白质表面的电荷电荷。盐析 向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出会沉淀析出 原因？原因？蛋白质脱去水化层而聚集沉淀盐析（NH4）2SO4）由于大量中性盐的加入，使水的活度降低，原来溶液中的由于大量中

32、性盐的加入，使水的活度降低，原来溶液中的大部分自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极大部分自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子间的相互作用，破坏蛋白质分子表面的水性基团与水分子间的相互作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。化层。分段盐析分段盐析：不同蛋白质析出时需要的盐浓度不同，调节不同蛋白质析出时需要的盐浓度不同，调节盐浓度以使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段盐浓度以使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出，这种方法称为分段盐析。析出，这种方法称为分段盐析。盐溶盐溶:通过提高中性盐浓度，在低离子强度溶液通过提高中性盐浓度，在低离子强度溶液中使蛋白质溶解度增加。中使蛋白质

33、溶解度增加。这是因蛋白质的荷电基团由于活度系数降低而这是因蛋白质的荷电基团由于活度系数降低而趋于稳定所致。趋于稳定所致。2.2.有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀 脱去水化层以及降低介电常数而增加带电脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用。质点间的相互作用。3.3.重金属盐沉淀重金属盐沉淀 与带负电荷蛋白质结成不溶性盐与带负电荷蛋白质结成不溶性盐4.4.生物碱试剂沉淀生物碱试剂沉淀 与带正电荷蛋白质生成不溶性盐与带正电荷蛋白质生成不溶性盐5.5.加热变性沉淀加热变性沉淀 天然结构解体，疏水基外露，破坏水化层及带天然结构解体，疏水基外露，破坏水化层及带电状态。电状态。硫酸铵对马血红蛋白的溶解

34、度的影响硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响离子强度离子强度（五）蛋白质的变性与复性（五）蛋白质的变性与复性蛋白质的变性蛋白质的变性 天然蛋白质受物理或化学因素的影响，天然蛋白质受物理或化学因素的影响，其其共价键不变，但次级键被破坏共价键不变，但次级键被破坏，分子内部原，分子内部原有的有序紧密的有的有序紧密的空间结构变空间结构变为无序而松散，致为无序而松散，致使其原有使其原有性质发生性质发生部分或全部部分或全部改变改变。变性后蛋白质的特性：生物活性减弱或丧失、理化变性后蛋白质的特性：生物活性减弱或丧失、理化性质改变、一些侧链基团暴露、生物化学性质改变。性质改变、一些侧链基团暴露、生物化学性质改变。

35、变性蛋白质特点（变性蛋白质特点（蛋白质变性的结果）蛋白质变性的结果）A.A.生物活性生物活性减弱或减弱或丧失丧失 B.B.侧链基团暴露侧链基团暴露:易与化学试剂反应易与化学试剂反应 C.C.理化性质改变理化性质改变:疏水基外露溶解度下降疏水基外露溶解度下降 分子相互凝集分子相互凝集,形成沉淀形成沉淀 D.D.生化性质改变：结构伸展易被酶解生化性质改变：结构伸展易被酶解变性的因素变性的因素 物理因素物理因素:加热、紫外线、加热、紫外线、X-X-射线、超射线、超声波等。声波等。化学因素化学因素:酸、碱、有机溶剂、蛋白变性剂酸、碱、有机溶剂、蛋白变性剂（尿素、盐酸胍）、重金属盐等。（尿素、盐酸胍）、

36、重金属盐等。蛋白质变性的应用蛋白质变性的应用三氯乙酸抑制酶活性，三氯乙酸抑制酶活性，消毒及灭菌，消毒及灭菌，制作豆腐，制作豆腐，卷发卷发(烫发烫发)防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件，疫苗等）的必要条件，。蛋白质的变性蛋白质的变性蛋白质复性蛋白质复性 去除变性因素后，蛋白质仍可恢复其原有的构去除变性因素后，蛋白质仍可恢复其原有的构象和功能，称为复性。象和功能，称为复性。（六）蛋白质的紫外吸收与呈色反应（六）蛋白质的紫外吸收与呈色反应1 1、蛋白质的紫外吸收、蛋白质的紫外吸收 在在280nm280nm波长处有特征光吸收。蛋白质的波长

37、处有特征光吸收。蛋白质的ODOD280280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。量测定。蛋白质质量浓度蛋白质质量浓度/（mg/mlmg/ml）=1.55A=1.55A1cm 1cm -0.76A 0.76A1cm1cm280 280 260260测定范围：测定范围：0.10.10.5mg/ml0.5mg/ml2 2、蛋白质的呈色反应、蛋白质的呈色反应 氨基酸与水化茚三酮氨基酸与水化茚三酮(苯丙环三酮戊烃苯丙环三酮戊烃)作用时，产生蓝紫色反应。作用时，产生蓝紫色反应。茚三酮反应茚三酮反应(Ninhydrin Reaction)(Ninhydrin Re

38、action)蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用呈现紫红蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用呈现紫红色，称双缩脲反应。凡分子中含有两个以上色，称双缩脲反应。凡分子中含有两个以上COCONHNH肽键的化合物都呈此反应。肽键的化合物都呈此反应。双缩脲反应双缩脲反应(Biuret Reaction)(Biuret Reaction)在碱性溶液（在碱性溶液（NaOHNaOH）中，双缩脲（）中，双缩脲（H2NOCH2NOCNHNHCONH2CONH2）能与铜离子（）能与铜离子（Cu2+Cu2+）作用，形成紫红色）作用，形成紫红色络合物络合物 Cu2+(硷性溶液硷性溶液)由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的由

39、于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，因此也能与铜离子在碱性溶液中发生双缩肽键，因此也能与铜离子在碱性溶液中发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合故可用双缩脲法测定蛋白质的含量。定范围内符合故可用双缩脲法测定蛋白质的含量。双缩脲反应是肽和蛋白质所具有的，而为氨基酸双缩脲反应是肽和蛋白质所具有的，而为氨基酸所没有的一种颜色反应。所没有的一种颜色反应。一般分子中含有两个氨一般分子中含有两个氨基甲酪基（即肽键：基甲酪基（即肽键：-CO-NH-CO-NH-）的化合物与碱性铜）的化合物与碱性铜溶液作用，就会形成紫色或蓝紫色络合物。

40、溶液作用，就会形成紫色或蓝紫色络合物。六、蛋白质的分类六、蛋白质的分类按形状可分为按形状可分为按分子组成分为按分子组成分为球状蛋白质球状蛋白质纤维状蛋白质纤维状蛋白质简单蛋白质简单蛋白质结合蛋白质结合蛋白质（一）简单蛋白质（一）简单蛋白质 简单蛋白质完全水解的产物为简单蛋白质完全水解的产物为 氨基酸，氨基酸，不含其它物质。不含其它物质。（二）结合蛋白质（二）结合蛋白质结合蛋白质蛋白质非蛋白质组分（辅基）结合蛋白质蛋白质非蛋白质组分（辅基）糖蛋白（糖蛋白（glycoproteinglycoprotein）脂蛋白（脂蛋白（lipoproteinlipoprotein）色蛋白（色蛋白（chromop

41、roteinchromoprotein）核蛋白核蛋白(nucleoprotein)(nucleoprotein)磷蛋白磷蛋白(phosphoprotein)(phosphoprotein)金属蛋白（金属蛋白（metalloproteinmetalloprotein）七、蛋白质的分离提纯七、蛋白质的分离提纯 （一）选材及预处理（一）选材及预处理1.1.选材选材主要原则是原料易得，蛋白含量高。蛋白质的主要来源包主要原则是原料易得，蛋白含量高。蛋白质的主要来源包括动物、植物和微生物。微生物因为容易培养而常用。括动物、植物和微生物。微生物因为容易培养而常用。2.2.细胞破碎细胞破碎如目的蛋白在细胞内，

42、需要进行细胞破碎，使蛋白释放出如目的蛋白在细胞内，需要进行细胞破碎，使蛋白释放出来。动物细胞可用匀浆器、组织捣碎机、超声波、丙酮来。动物细胞可用匀浆器、组织捣碎机、超声波、丙酮干粉等方法破碎。植物可用石英砂研磨或纤维素酶处理。干粉等方法破碎。植物可用石英砂研磨或纤维素酶处理。微生物的细胞壁是一个大分子，破碎较难。有超声振荡、微生物的细胞壁是一个大分子，破碎较难。有超声振荡、研磨、高压、溶菌酶、细胞自溶等方法。研磨、高压、溶菌酶、细胞自溶等方法。（二）粗提（二）粗提主要目的是除去糖、脂类、核酸及大部分杂蛋白，并将蛋白浓缩。主要目的是除去糖、脂类、核酸及大部分杂蛋白，并将蛋白浓缩。常用以下方法：常

43、用以下方法：1.沉淀法沉淀法核酸沉淀剂：核酸沉淀剂：MnCl2、硫酸鱼精蛋白、链霉素、核酸酶等、硫酸鱼精蛋白、链霉素、核酸酶等蛋白沉淀剂：醋酸铅、单宁酸、蛋白沉淀剂：醋酸铅、单宁酸、SDS等，也可除多糖，沉淀后应等，也可除多糖，沉淀后应迅速盐析除去沉淀剂，以免目的蛋白变性。迅速盐析除去沉淀剂，以免目的蛋白变性。选择变性：用加热、调节选择变性：用加热、调节pH或变性剂选择性地变性杂蛋白。如或变性剂选择性地变性杂蛋白。如提取胰蛋白酶或细胞色素提取胰蛋白酶或细胞色素C时，因其稳定性高，可用时，因其稳定性高，可用2.5三三氯乙酸处理，使杂蛋白变性沉淀。氯乙酸处理，使杂蛋白变性沉淀。2.分级法分级法常用

44、盐析或有机溶剂分级沉淀蛋白。常用盐析或有机溶剂分级沉淀蛋白。3.除盐和浓缩除盐和浓缩盐析后样品中含大量盐类，应透析除去。也可用分子筛，如盐析后样品中含大量盐类，应透析除去。也可用分子筛，如Saphadex G25层析除盐。如样品过稀，可用反透析、冻干、层析除盐。如样品过稀，可用反透析、冻干、超滤等方法浓缩。超滤等方法浓缩。（三）精制（三）精制以上方法得到的制剂可供工业应用。如需高纯样品，应精以上方法得到的制剂可供工业应用。如需高纯样品，应精制。常用方法有各种层析、电泳、等电聚焦、结晶等。制。常用方法有各种层析、电泳、等电聚焦、结晶等。蛋白结晶不等于无杂质，但变性蛋白不能结晶，所以可蛋白结晶不等

45、于无杂质，但变性蛋白不能结晶，所以可说明其具有生物活性。说明其具有生物活性。赖氨酸赖氨酸pI=9.74pI=9.74谷氨酸谷氨酸pI=3.22pI=3.22在在PH=6 PH=6 的缓冲液中电性如何？的缓冲液中电性如何？(一一)名词解释名词解释1 1、核酸的变性、核酸的变性 2 2、DNADNA的熔解温度（的熔解温度（TmTm）（二）填空题（二）填空题 1 1核酸的基本结构单位是核酸的基本结构单位是_，基本结构单位之间通过基本结构单位之间通过_，键连接键连接 2 2维持维持DNADNA双螺旋结构稳定的主要因素是双螺旋结构稳定的主要因素是_，其次，大量存在，其次，大量存在于于DNADNA分子中的弱作用力如分子中的弱作用力如_，_和和_也起一定作用。也起一定作用。（三）选择题（三）选择题1 1与与DNADNA片段片段TAGATAGA互补的互补的DNADNA片段为：片段为：A AAGAT BAGAT BATCT CATCT CTCTA DTCTA DUAUAUAUA（四）（四）简答简答 1 1、简述、简述DNADNA双螺旋模型要点双螺旋模型要点