第六章基因的重组与转移课件.ppt

1、外源外源DNA载体载体DNA重组分子重组分子原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞扩增或表达扩增或表达表达表达连接连接转化或转导转化或转导电穿孔或显微注射电穿孔或显微注射受体细胞受体细胞一、粘性末端的连接一、粘性末端的连接（一）同一种酶产生的黏性末端的连接（一）同一种酶产生的黏性末端的连接（二）不同种酶产生的黏性末端的连接（二）不同种酶产生的黏性末端的连接5端与端与3端并列靠近的时间太短，不容易端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。被连接酶连接。1.直接连接直接连接T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的效率很低，只有粘性末端的1%。55553333

2、-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-53-OH-PP-HO-531972年，斯坦福大学的年，斯坦福大学的P.Labban和和P.Kaiser提出。提出。（1）同聚加尾）同聚加尾 法法 DNA末端转移酶末端转移酶能在没有模板的情况下能在没有模板的情况下给给DNA的的3-OH端端加上脱氧核苷酸。加上脱氧核苷酸。原理：原理：分别给载体和插入片断加上分别给载体和插入片断加上互补的互补的核苷酸。核苷酸。加尾加尾碱基互补碱基互补缺点缺点：优点优点：能把任何能把任何片段连接片段连接起来起来不能把不能把插入片插入片段再切段再切下来。下来。非酶切位点非酶切位点用用T4 DNA连接酶连到平端连接酶连到平端DN

3、A上，然上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。后再用酶切，形成一个人工粘性末端。linker用化学合成法合成的一段用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限的特定限制性内切酶识别位点序列的制性内切酶识别位点序列的平端双链平端双链。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRI linker：linker的作用的作用缺点：缺点：1）可以用内切酶把插入片段切下来。）可以用内切酶把插入片段切下来。如果插入片段内部也有该酶位点，不能如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段切下完整的插入片段2）能给载体连接上）能给载体连接上Polylinker:1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。年康内尔大

4、学的吴瑞教授发明。5p-GATCCCGG-OH3 GGCC-p5BamHI adapter用用T4DNA连接酶连到连接酶连到DNA分子的两分子的两端，直接成为人工粘性末端。端，直接成为人工粘性末端。adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。切位点序列）。adapter的作用的作用Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5BamHI adapterP-P5p-GATCCCGG-GGCC-CCGG-GGCCCTAG-P55p-GATCCCGG-GGCC-CCGGGGCCCTAG-P5CCGGGATCCCG

5、G-OHGGCCCTAGGGCC-P5接头自我连接接头自我连接接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与影响与DNA片段的连接。片段的连接。优点：优点：连上后就能用。连上后就能用。缺点：缺点：先用小牛肠先用小牛肠碱性磷酸酶碱性磷酸酶（CIP）处理接头，）处理接头，水解掉其水解掉其5端的磷酸，防止自我连接。端的磷酸，防止自我连接。（以后再用（以后再用T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶加上磷酸。）加上磷酸。）防止自我连接防止自我连接5p-GATCCCGG-OH HO-GGCC-P P-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P5 CCGGGATCCCGG-OHHO-GG

6、CCCTAGGGCC5接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！5GATCCCGG-OH HO-GGCC5 5CCGG-OHHO-GGCCCTAG5CIP处理处理-OHHO-Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5BamHI adapterP-P 5GATCCCGG-HO-GGCC CCGG-OH-GGCCCTAG55GATCCCGG-OH3 HO-GGCC5缺口缺口缺口缺口HO-OHCIP处理处理T4 ligase虽然有缺口，但仍然能与虽然有缺口，但仍然能与DNADNA片断连接。片断连接。1.在引物的在引物的5端设计酶切

7、位点端设计酶切位点符合载体的多克隆位点；符合载体的多克隆位点；（1）设计原则）设计原则（2）带酶切位点的引物的结构）带酶切位点的引物的结构3端端1520bp与模板互补；与模板互补；5端端610bp是某个内切酶的识别序列。是某个内切酶的识别序列。（5端多余的端多余的35bp属属保护碱基保护碱基）避免与所扩增的避免与所扩增的DNADNA片断内部酶切位点重复。片断内部酶切位点重复。GCAGAATTC互补序列互补序列模板模板EcoRI位点位点5-3GCAGAATTC 互补序列互补序列5-33模板模板GCAGAATTC 互补序列互补序列 PCR产物产物5-33复性复性延伸延伸模板模板模板模板33GCTA

8、GCCGG互补序列互补序列模板模板BamH I 位点位点-53-5复性复性延伸延伸模板模板模板模板33GCTAGCCGG互补序列互补序列-53-模板模板5GCTAGCCGGPCR产物产物 互补序列互补序列-53-GCAGAATTC PCR产物产物5-3GCTAGCCGGPCR产物产物-53-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位点位点BamHI位点位点AATTC PCR产物产物5-3GCTAGPCR产物产物-53-GCEcoRI BamHI两头各有一个粘性末端！两头各有一个粘性末端！（1）PCR产物两个产物两个3端一般都有一个端一般都有一个ATaq DNA聚合酶的特性：在聚合酶的特性

9、：在DNA双双链的链的3端再加上一个多余的核苷酸端再加上一个多余的核苷酸（优先加（优先加A）。）。（2）T载体的两个载体的两个3端人为地各加一个端人为地各加一个T利用利用Taq DNA聚合酶，当原料中只聚合酶，当原料中只有有dTTP时，被迫在平端载体上添加时，被迫在平端载体上添加T！AAdNTPTTdTTPTaq DNA聚合酶聚合酶载体载体PCR产物产物TATA 插入片断与载体的酶切位点互补插入片断与载体的酶切位点互补相同的粘性末端才能有效地连接。相同的粘性末端才能有效地连接。尽量避免平端连接。尽量避免平端连接。决不能进行非粘性末端连接。决不能进行非粘性末端连接。EcoRIEcoRIEcoRI

10、（2）用同尾酶切）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都产生都产生GATC4个碱基的粘性末端。个碱基的粘性末端。用双酶切用双酶切由于产生的粘性末端不同，只能以由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。固定方向连接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI（1）DNA定向插入定向插入（2）起始密码）起始密码尤其当尤其当载体上有载体上有ATG起始密码的时起始密码的时候，更要注意。候，更要注意。ATGGAATTC载体载体ATGCGGAATTCT插入片断插入片断EcoRIEcoRIATGGAATTC T重组重组但移码突变！但移码突变！（1）提高插入

11、片断的用量）提高插入片断的用量连接反应体系中，插入片断比载体多连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。倍以上。（2）用碱性磷酸酶处理载体）用碱性磷酸酶处理载体载体切口的载体切口的5磷酸被除去，不能自我连磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。接。但可以与插入片断以单链连接。53载体载体插入片断插入片断1.载体自身环化连接（能存活）载体自身环化连接（能存活）2.载体之间互相连接（能存活）载体之间互相连接（能存活）3.插入片段互相连接（不能存活）插入片段互相连接（不能存活）4.一个载体与几个插入片段重组（能存活）一个载体与几个插入片段重组（能存活）5.几个载体与一个插入片段重组（

12、能存活）几个载体与一个插入片段重组（能存活）1.目的目的增加受体菌增加受体菌细胞膜的通细胞膜的通透性。透性。一、感受态大肠杆菌的制备一、感受态大肠杆菌的制备使用丧失了使用丧失了限制体系限制体系的大肠杆菌。的大肠杆菌。如如K12系列的大肠杆菌。系列的大肠杆菌。用用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。培养大培养大肠杆菌肠杆菌OD600至至0.3-0.4On ice 5-10 min4离心离心收集菌收集菌用冰冷的用冰冷的60mMCaCl2重悬重悬4离心离心收集菌收集菌4离心离心收集菌收集菌分装、分装、-70 冻存冻存用冰冷的用冰冷的60mMCaCl2重悬重悬On

13、 ice 30 min用冰冷的用冰冷的60mMCaCl2重悬重悬（1）转化（）转化（transformation)大肠杆菌捕获大肠杆菌捕获质粒质粒DNA的过程。的过程。（2）转染（）转染（transfection)大肠杆菌捕获大肠杆菌捕获噬菌体噬菌体DNA的过程。的过程。1.外源外源DNA导入细菌的几种方法导入细菌的几种方法（3）转导（）转导（transduction)借助借助噬菌体噬菌体把外源把外源DNA导入细菌的过程。导入细菌的过程。3.转化方法转化方法 简单简单，但转化效率不高（，但转化效率不高（106-108/gDNA）。）。转化效率高（高于转化效率高（高于109/gDNA）。）。10

14、ng载载体体DNA100 L感感受态菌受态菌On ice混混合，静置合，静置10分钟分钟42C 1分钟分钟加入加入1mL LB培养基培养基37摇摇1小时小时10-100 L转化转化液涂含抗菌素液涂含抗菌素的平板的平板吸附吸附DNA摄入摄入DNALB培养受体菌至培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴冰浴15分钟，分钟，2C离心集菌离心集菌冰冷的水冰冷的水重悬菌体重悬菌体2C离离心集菌心集菌冰冷的水冰冷的水重悬菌体重悬菌体2C离离心收集菌心收集菌体体少量冰冷少量冰冷的水重悬的水重悬分装成分装成50-300 L电转仪调为电转仪调为2.5kV,25 F脉冲控制器脉冲控制器200-400 0.5 g

15、质粒质粒DNAOn ice混合混合加入加入1mLSOC培养液培养液37C中速中速震荡震荡60分钟分钟10-100 L转化液涂转化液涂含抗菌素的平板含抗菌素的平板转化转化10-100 L转转化液化液涂于含抗涂于含抗菌素的平菌素的平板板37过夜过夜 生长状态生长状态制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。必须在冰冷的条件下制备。必须在冰冷的条件下制备。要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。储存感受态菌要在储存感受态菌要在-70以下以下CaCl2处理处理使用感受态菌时必须迅速融化使用感受态菌时必须迅速融化融化后一般不能再次冻存使用。融化后

16、一般不能再次冻存使用。把重组的噬菌体把重组的噬菌体 DNA或或Cosmid质粒质粒DNA包装成具有感染能力的包装成具有感染能力的 噬菌体颗粒。噬菌体颗粒。（1）体外包装（）体外包装（in vitro packaging）（2）转导（）转导（transduction）通过受体菌细胞表面的通过受体菌细胞表面的 DNA接受器位接受器位点（点（receptor site)，使带有外源基因的，使带有外源基因的重组体重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。注入受体大肠杆菌进行扩增。cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在感染细菌后，在32下培养细菌时能够保下培

17、养细菌时能够保持溶源性。持溶源性。但当温度升高到但当温度升高到4445时，就会导致时，就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活，基因编码的阻遏蛋白失活，DNA复制、复制、外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。但由于该噬菌体的但由于该噬菌体的S基因上有一个突变，基因上有一个突变，所以细菌还不裂解。所以细菌还不裂解。cI857其它基因其它基因溶源状态（溶源状态（DNA不转录、不翻译）不转录、不翻译）DNA阻遏阻遏蛋白蛋白阻遏阻遏蛋白蛋白4445 DNA转录、翻译合成外壳蛋白转录、翻译合成外壳蛋白32 噬菌体噬菌体1外壳蛋白基因外壳蛋白基因E发生了无义突变，发生了无义突变，不不能

18、合成头部蛋白能合成头部蛋白，但能合成其它外壳，但能合成其它外壳蛋白（尾部蛋白）。蛋白（尾部蛋白）。在在cI857基因突变的基因突变的 噬菌体的基础上，噬菌体的基础上，选择两种外壳蛋白的突变型选择两种外壳蛋白的突变型 噬菌体。噬菌体。外壳蛋白基因外壳蛋白基因D发生了无义突变，发生了无义突变，不不能合成头部的包装识别蛋白能合成头部的包装识别蛋白，但能合，但能合成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋白）。成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋白）。噬菌体噬菌体2体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每 g DNA能形成能形成

19、106噬菌斑）。噬菌斑）。转化率高的菌株；转化率高的菌株；有突变的菌株（与导入的载体基因互补）；有突变的菌株（与导入的载体基因互补）；不育的菌株（不会与其他酵母接合）。不育的菌株（不会与其他酵母接合）。一、导入酵母细胞一、导入酵母细胞1.菌株选择菌株选择如：如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu2-112,his31（1）利用原生质球进行转化）利用原生质球进行转化 酵母酵母原生质体原生质体感受态感受态酶去壁酶去壁CaCl2、PEG插入外源基因插入外源基因的酵母载体的酵母载体PEG（聚乙二醇）使（聚乙二醇）使细胞壁细胞壁具有通透性，允具有通透性，允许许DNA进入。进入。CaC

20、l2使使细胞膜细胞膜具有通透性，允许具有通透性，允许DNA进入。进入。转化转化 酵母酵母0.1mol/L LiCl处理处理插入外源基因的酵母载体插入外源基因的酵母载体感受态感受态40%PEG 4000叶盘法转化植物细胞 Leaf dish transformation 由由Horsch等于等于1985年发展起来的一种转化年发展起来的一种转化方法方法叶盘法操作程序：叶盘法操作程序：叶片表面除菌叶片表面除菌 打孔器制备圆形叶片，即打孔器制备圆形叶片，即叶盘叶盘 叶盘于农杆菌液浸泡数秒钟叶盘于农杆菌液浸泡数秒钟 叶盘平铺培养平皿滤纸培养叶盘平铺培养平皿滤纸培养2天天 筛选筛选长芽培养基长芽培养基进行

21、筛选与再生培养进行筛选与再生培养 生根培养基生根培养基上诱导幼芽生根上诱导幼芽生根 小植株移栽在土壤中小植株移栽在土壤中植物原生质体植物原生质体的再生程序的再生程序化学方法化学方法：多聚物介导法多聚物介导法脂质体介导法脂质体介导法生物方法生物方法：花粉管通道法花粉管通道法原理：细胞生物学研究证明，细胞膜的磷脂双分子层可视为原理：细胞生物学研究证明，细胞膜的磷脂双分子层可视为一种电容，其静膜电位（一种电容，其静膜电位（VmVm）约为）约为l00mVl00mV，导电性很差。当，导电性很差。当把细胞置于外加电场中时，会使膜电位升高，双分子层两端把细胞置于外加电场中时，会使膜电位升高，双分子层两端电压

22、形成差势，随着外加电场电压升高，细胞膜被压缩变薄，电压形成差势，随着外加电场电压升高，细胞膜被压缩变薄，当膜电压升到一定数值时，膜被击穿。当膜电压升到一定数值时，膜被击穿。可逆击穿：击穿小孔可在一定时间内复原。可逆击穿：击穿小孔可在一定时间内复原。不可逆击穿：击穿小孔不可修复，处理细胞成活率低。不可逆击穿：击穿小孔不可修复，处理细胞成活率低。植物细胞植物细胞原生质体原生质体纤维素酶纤维素酶和果胶酶和果胶酶DNA混合入电混合入电击缓冲液击缓冲液1-2kV,3-25 F电击电击愈伤组织愈伤组织幼苗幼苗分化分化又称高速微型子弹射击法又称高速微型子弹射击法（High-velocity micropro

23、jectiles)DNA1.2 m钨弹头钨弹头吸附吸附特制手枪特制手枪射击植物射击植物装入装入基因枪法（gene gun）基因枪法的特点：基因枪法的特点：（2）受体广泛。）受体广泛。（3）操作简单。）操作简单。（1）转化效率高。）转化效率高。脂类包埋脂类包埋DNA，通过细胞通过细胞膜进入细膜进入细胞。胞。病毒颗粒转染法病毒颗粒转染法磷酸钙转导法磷酸钙转导法脂质体介导法脂质体介导法电穿孔法电穿孔法显微注射技术显微注射技术（1）原理：）原理：磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法依据不同的细胞类型，平皿上最多依据不同的细胞类型，平皿上最多能有能有10%的细胞能吸收的细胞能吸收DNA沉淀。沉淀。不需要载体。不需要

24、载体。二乙氨乙基（二乙氨乙基（diethyl-aminoehtyl，DEAE）葡）葡萄糖能促进哺乳动物细胞摄入外源萄糖能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。葡聚糖葡聚糖葡聚糖葡聚糖+DNA吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNADNA可可以进入到细胞核里。以进入到细胞核里。DEAE-dextran细胞细胞外源外源DNA预处理预处理摄入摄入DEAE-dextran外源外源DNA细胞细胞混合混合DEAE-dextran对细胞有毒对细胞有毒!脂质体有商业试剂盒（如脂质体有商业试剂盒（如Life Technologies）。）。脂类包埋脂类包埋DNA，通过细胞膜进入细胞。，通过细胞膜进入细胞。