(ori)-T-DNA区包括：-章鱼碱合成酶基因nos-植物生长素课件.ppt

1、植物细胞工程制药植物细胞工程制药1.1.在无菌和人工控制的条件下，采用植物细胞和在无菌和人工控制的条件下，采用植物细胞和组织培养技术组织培养技术培养植物的细胞，组织，器官培养植物的细胞，组织，器官以获以获得有得有药用价值的次生代谢产物药用价值的次生代谢产物。2.2.采用植物的遗传操作技术采用植物的遗传操作技术改变植物或植物细胞改变植物或植物细胞的原有性状和功能的原有性状和功能，获得具有优良性状的植株或，获得具有优良性状的植株或植物细胞，生产有药用价值的次生代谢产物植物细胞，生产有药用价值的次生代谢产物。第一节第一节 概述概述利用组织和细胞培养技术生产药用成分利用组织和细胞培养技术生产药用成分植

2、物组织及细胞培养过程中，所产生的次生代谢植物组织及细胞培养过程中，所产生的次生代谢物常存在于细胞内，可以收获细胞进行提取，因物常存在于细胞内，可以收获细胞进行提取，因所含色素等所含色素等杂质较少杂质较少，所以提取过程相对于从原，所以提取过程相对于从原植物中植物中提取要简单提取要简单一些。一些。植物培养细胞中植物培养细胞中有效成分含量高有效成分含量高于原植物中的含于原植物中的含量量培养周期短培养周期短，有利于节约成本大规模生产，有利于节约成本大规模生产与哺乳动物细胞培养系统相比，植物表达系统具与哺乳动物细胞培养系统相比，植物表达系统具有有耗费极低耗费极低而生产蛋白复合物量大的潜力，而生产蛋白复合

3、物量大的潜力，而且植物表达系统不存在来自动物、细菌或者病而且植物表达系统不存在来自动物、细菌或者病毒病原体的毒病原体的污染污染问题。问题。植物组织（细胞）培养的次生代谢产物见表植物组织（细胞）培养的次生代谢产物见表5-15-1一、植物细胞工程发展简史一、植物细胞工程发展简史19021902年，德国年，德国HaberlandtHaberlandt提提出了出了细胞全能性学说细胞全能性学说，并进，并进行了植物叶肉细胞、髓细胞、行了植物叶肉细胞、髓细胞、腺细胞、气孔保卫细胞、表腺细胞、气孔保卫细胞、表皮细胞的培养试验皮细胞的培养试验,奠定了奠定了细胞工程的基础。细胞工程的基础。之后至之后至3030年代

4、，建立了基本年代，建立了基本的植物组织培养技术的植物组织培养技术5050年代期间，组织培养进入新的阶段年代期间，组织培养进入新的阶段培养基的设计培养基的设计生物反应器生物反应器培养动力学等培养动力学等用于次级代谢产物的用于次级代谢产物的 调控研究调控研究8080年代后，高速发展时期年代后，高速发展时期分子生物学技术改变植物遗传分子生物学技术改变植物遗传特性特性植物细胞培养技术进行有药用植物细胞培养技术进行有药用价值的天然产物的工业化生产价值的天然产物的工业化生产和直接生产次生代谢产物成为和直接生产次生代谢产物成为主流主流目前，我国处于此方面的领先目前，我国处于此方面的领先二、植物细胞的药用成分

5、二、植物细胞的药用成分市售中成药的市售中成药的25%25%来源于植物提取药物或半合成药来源于植物提取药物或半合成药物物一类为植物后含物，为细胞储液或废弃物，包括一类为植物后含物，为细胞储液或废弃物，包括生物碱生物碱、挥发油挥发油和和有机酸有机酸。一类为生理活性物质，如一类为生理活性物质，如酶酶、维生素维生素、植物激素植物激素、植物杀菌素植物杀菌素等等三、植物细胞的生物学特性三、植物细胞的生物学特性细胞的全能性细胞的全能性:一个细胞所具有的产生完整生物一个细胞所具有的产生完整生物个体的固有能力。个体的固有能力。植物干细胞植物干细胞：植物胚性细胞（：植物胚性细胞（embryogenic cells

6、embryogenic cells）即合子。即合子。分化的根茎叶中仍保留少数未分化或分化程度不分化的根茎叶中仍保留少数未分化或分化程度不高的细胞（遗留的胚性细胞）高的细胞（遗留的胚性细胞）l细胞的脱分化细胞的脱分化（dedifferentiation):dedifferentiation):特定条件特定条件下，分化细胞被诱导，基因活动模式发生变化，下，分化细胞被诱导，基因活动模式发生变化，改变原有的发育途径，失去原有的分化状态，转改变原有的发育途径，失去原有的分化状态，转变为具分生能力的胚性细胞。变为具分生能力的胚性细胞。l已分化的细胞要表现已分化的细胞要表现全能性全能性，首先要脱分化形成，首

7、先要脱分化形成分生细胞，然后再分化形成胚胎发育成植株分生细胞，然后再分化形成胚胎发育成植株l脱分化条件：脱分化条件：创伤和外源激素创伤和外源激素。外植体外植体(explant)：植物体上：植物体上取出的用于培养和分离细胞取出的用于培养和分离细胞的组织或器官的组织或器官愈伤组织愈伤组织：植物的伤口或外：植物的伤口或外植体的伤口长出的细胞团，植体的伤口长出的细胞团，既是组织，又是脱分化细胞既是组织，又是脱分化细胞Callus毛状根毛状根(hairy root)：受到发：受到发根农杆菌感染后形成的根组织，根农杆菌感染后形成的根组织，易于培养，改变了植物的次生易于培养，改变了植物的次生代谢。代谢。次生

8、代谢产物次生代谢产物：保持植物的抗：保持植物的抗逆性，抗病性和抗虫性，及担逆性，抗病性和抗虫性，及担当信号分子。合成途径见表当信号分子。合成途径见表5-2毛状根毛状根第二节第二节 植物细胞的培养植物细胞的培养植物细胞培养从植物组织培养而来，植物组织培植物细胞培养从植物组织培养而来，植物组织培养主要用于形成组织和再生成植株养主要用于形成组织和再生成植株细胞培养主要生成次生代谢产物细胞培养主要生成次生代谢产物基本技术：基本技术：植物材料的准备植物材料的准备培养基制备培养基制备培养方法的选择培养方法的选择一、植物细胞的培养特点一、植物细胞的培养特点植物培养细胞四个生长时期特性植物培养细胞四个生长时期

9、特性延迟期：延迟期：细胞数恒定，高细胞数恒定，高RNARNA含量，高蛋白质合成含量，高蛋白质合成能力；能力；加速期：加速期：细胞快速生长期。干重恒定，细胞数、细胞快速生长期。干重恒定，细胞数、DNADNA和蛋白质浓度增加，有丝分裂活性、和蛋白质浓度增加，有丝分裂活性、RNARNA含量含量和蛋白质合成能力减少；和蛋白质合成能力减少；对数期：对数期：介于最大生长率和蛋白质合成完全停止介于最大生长率和蛋白质合成完全停止期之间。增加细胞鲜重、干重及期之间。增加细胞鲜重、干重及RNARNA酶活性，蛋白酶活性，蛋白质合成能力完全减退；质合成能力完全减退；稳定期：稳定期：细胞数稳定。细胞高液泡化，极度脆弱，

10、细胞数稳定。细胞高液泡化，极度脆弱，高度分化及有机化合物的高浓度。高度分化及有机化合物的高浓度。（1 1）植物细胞有独特的培养时间及特征：重量的）植物细胞有独特的培养时间及特征：重量的增加在对数期，增加在对数期，次生代谢产物在稳定期积累次生代谢产物在稳定期积累（2 2）植物细胞很少单一细胞生长，对数生长后期）植物细胞很少单一细胞生长，对数生长后期分泌量蛋白和粘多糖，分泌量蛋白和粘多糖，以非均相集合的细胞团悬以非均相集合的细胞团悬浮生长浮生长。（3 3）植物细胞好气，培养过程中）植物细胞好气，培养过程中需供气及搅拌需供气及搅拌，但细胞壁脆弱，抗剪切能力小，传统的搅拌式反但细胞壁脆弱，抗剪切能力小

11、，传统的搅拌式反应器极易损伤细胞壁应器极易损伤细胞壁二、植物细胞培养基二、植物细胞培养基植物细胞生长代谢特点：植物细胞生长代谢特点：（1 1）需大量无机盐）需大量无机盐（2 2）需多种维生素和植物生长激素）需多种维生素和植物生长激素（3 3）无机氮源，硝酸盐，铵盐为主。）无机氮源，硝酸盐，铵盐为主。（4 4）以蔗糖为碳源）以蔗糖为碳源培养基配方见表培养基配方见表5-35-3常用培养基常用培养基MSMS、N6N6、B6B6、LSLS、RM-1964RM-1964、H H、T T、B5B5、DBMIIDBMII、米勒、改良怀特、尼许等。米勒、改良怀特、尼许等。MSMS培养基培养基是目前应用最多最普

12、遍的培养基。是目前应用最多最普遍的培养基。无机无机盐的浓度较高盐的浓度较高，能保证组织培养生长所需的矿物，能保证组织培养生长所需的矿物营养。并且因为离子浓度高，在配制、贮存、消营养。并且因为离子浓度高，在配制、贮存、消毒过程中，即使有些成分略有出入，也不致影响毒过程中，即使有些成分略有出入，也不致影响培养基中的离子平衡培养基中的离子平衡。B5B5含有较低的含有较低的盐盐离子离子，这个成分可能对很多培养这个成分可能对很多培养物的生长有抑制作用物的生长有抑制作用。WhiteWhite的无机盐含量较低的无机盐含量较低，适于适于生根培养生根培养。KM-8pKM-8p主要用于原生质体培养主要用于原生质体

13、培养，其特点是有机成分其特点是有机成分较复杂较复杂，它包括了几乎所有的单糖和维生素、呼它包括了几乎所有的单糖和维生素、呼吸代谢中的主要有机酸。吸代谢中的主要有机酸。凡是花药培养中常用的培养基凡是花药培养中常用的培养基，其成分较简单其成分较简单，且且KN0KN03 3和和(NH)(NH)2 2N0N04 4含高。含高。（一）无机盐（一）无机盐大量元素：大量元素：氮、磷、钾、钙、镁、硫等氮、磷、钾、钙、镁、硫等微量元素：微量元素：硼、锰、锌、钼、铜、钴、氯等硼、锰、锌、钼、铜、钴、氯等（二）生长因素（二）生长因素 植物生长调节剂植物生长调节剂 植物生长激素：植物生长激素：生长素生长素，细胞分裂素细

14、胞分裂素，赤霉赤霉素，脱落酸素，脱落酸，乙烯。乙烯。借生长激素调控生长分化，以及细胞培养时，借生长激素调控生长分化，以及细胞培养时，获得最大量的次生代谢产物获得最大量的次生代谢产物u生长素生长素（用来诱导细胞的分裂、愈伤组织形成和（用来诱导细胞的分裂、愈伤组织形成和根的分化）：组织培养中常用的有：根的分化）：组织培养中常用的有：吲哚乙酸吲哚乙酸 (IAA)(IAA)：第一个被发现和人工合成的：第一个被发现和人工合成的的激素的激素二氯本氧乙酸二氯本氧乙酸 (2,4-D)(2,4-D)；萘乙酸；萘乙酸 (NAA)(NAA)；吲哚；吲哚-3-3-丁酸丁酸 (IBA)(IBA)；萘氧乙酸；萘氧乙酸 (

15、NOA)(NOA)；对氯苯氧乙；对氯苯氧乙酸酸 (P-CPA)(P-CPA)NAANAA、IAAIAA、IBAIBA易引起生根，易引起生根，2,4-D2,4-D有利于愈伤有利于愈伤组织的诱导和生长组织的诱导和生长u细胞分裂素细胞分裂素主要促进细胞分裂和由愈伤组织上或主要促进细胞分裂和由愈伤组织上或器官上分化不定芽。常用的有：器官上分化不定芽。常用的有：6-6-苄基嘌呤苄基嘌呤 (BAP)(BAP)6-6-苄基腺嘌呤苄基腺嘌呤 (6-BA)(6-BA)激动素（呋喃氨基嘌呤、激动素（呋喃氨基嘌呤、KinetinKinetin、KTKT）玉米素玉米素 (zeatin(zeatin、zt)zt)异戊烯

16、氨基嘌呤异戊烯氨基嘌呤 (2-ip)(2-ip)u植物培养物的生长取决于植物培养物的生长取决于生长素生长素和和分裂素分裂素的比例：的比例：u高浓度生长素和低浓度分裂素高浓度生长素和低浓度分裂素刺激细胞刺激细胞分裂分裂 u低浓度生长素和高浓度分裂素低浓度生长素和高浓度分裂素刺激细胞刺激细胞生长生长（三）诱导子（三）诱导子(elicitor)(elicitor)：刺激植物细胞合成刺激植物细胞合成防御性次生代谢产物防御性次生代谢产物的物的物质质,可以通过改变次生代谢途径中催化酶的可以通过改变次生代谢途径中催化酶的酶活酶活力力,引起代谢通量和反应速率的改变引起代谢通量和反应速率的改变,提高次生代提高次

17、生代谢产物的产量。谢产物的产量。非生物诱导子非生物诱导子：水杨酸，茉莉酸等：水杨酸，茉莉酸等,稀土及重金稀土及重金 属盐类属盐类生物诱导子生物诱导子：微生物类，如真菌孢子，菌丝体：微生物类，如真菌孢子，菌丝体 真菌培养物滤液等真菌培养物滤液等（四）碳源（四）碳源 细胞培养过程中不进行光合作用，需提供糖细胞培养过程中不进行光合作用，需提供糖做碳源。做碳源。（五）（五）维生素：烟酸，维生素：烟酸，B1B1，B6B6（六）有机物：甘氨酸或水解络蛋白，酵母提取（六）有机物：甘氨酸或水解络蛋白，酵母提取 液等。液等。三、植物细胞生物反应器三、植物细胞生物反应器植物细胞易聚集化，比较脆弱，代谢途径和代谢植

18、物细胞易聚集化，比较脆弱，代谢途径和代谢产物累积与细胞生长关系的复杂性，选择合适产物累积与细胞生长关系的复杂性，选择合适的培养方法和反应器影像产物产量的培养方法和反应器影像产物产量细胞培养周期长，次生代谢产物含量相对较低，细胞培养周期长，次生代谢产物含量相对较低，提取困难，生物反应器技术还有待深入提取困难，生物反应器技术还有待深入各种生物反应器性能比较各种生物反应器性能比较不同类型的生物反应器各有其优缺点，而改进不同类型的生物反应器各有其优缺点，而改进的搅拌式生物反应器和气升式反应器可能更适的搅拌式生物反应器和气升式反应器可能更适合植物细胞的培养。合植物细胞的培养。一般来说，悬浮培养的细胞在干

19、重不大于一般来说，悬浮培养的细胞在干重不大于20g/L20g/L时，以气升式反应器为宜，而当干重超过时，以气升式反应器为宜，而当干重超过20g/L20g/L时，则改进的搅拌式生物反应器优于其它类型时，则改进的搅拌式生物反应器优于其它类型的反应器的反应器我国发明的我国发明的“气升内错流气升内错流”式植物细胞培养反应式植物细胞培养反应器，能够适应植物细胞培养周期长，培养液随培器，能够适应植物细胞培养周期长，培养液随培养进程而蒸发减少的生物反应过程；可抑制气泡养进程而蒸发减少的生物反应过程；可抑制气泡的聚合，减弱气泡在液面破裂时产生的冲击力对的聚合，减弱气泡在液面破裂时产生的冲击力对细胞的损伤；可提

20、高降液区气含率，消除降液区细胞的损伤；可提高降液区气含率，消除降液区缺氧现象，并强化混合与氧传递，大大降低反应缺氧现象，并强化混合与氧传递，大大降低反应器高度。器高度。使用这种反应器培养新疆紫草细胞，培养结束时使用这种反应器培养新疆紫草细胞，培养结束时细胞量达到细胞量达到12gdw12gdwL L，紫草宁含量达到了细胞干，紫草宁含量达到了细胞干重的重的1010，是天然植株含量的，是天然植株含量的2 28 8倍倍 四、植物细胞的获得和扩大培养四、植物细胞的获得和扩大培养（一）植物细胞的获得（一）植物细胞的获得1.1.外植体直接分离外植体直接分离法法:机械切割、组织破碎直接从机械切割、组织破碎直接

21、从植物外植体中分离植物外植体中分离2.2.愈伤组织分离愈伤组织分离法：从愈伤组织制备小细胞团或法：从愈伤组织制备小细胞团或单细胞悬液单细胞悬液3.3.原生质体再生原生质体再生法：法：纤维素和果胶酶纤维素和果胶酶混合处理外混合处理外植体或愈伤组织，分离原生质体，再生培养基中植体或愈伤组织，分离原生质体，再生培养基中培养，原生质体细胞壁再生获得植物细胞培养，原生质体细胞壁再生获得植物细胞（二）植物细胞的培养方法（二）植物细胞的培养方法1.1.单细胞的培养单细胞的培养（1 1）看护培养法看护培养法（nurse culture）：在单细胞的生长：在单细胞的生长环境里加入愈伤组织同时培环境里加入愈伤组织

22、同时培养。愈伤组织提供促细胞分养。愈伤组织提供促细胞分裂的物质等，传递生物信息，裂的物质等，传递生物信息，使持续分裂增值等。使持续分裂增值等。即愈伤组织看护单细胞即愈伤组织看护单细胞（2 2）微室培养法微室培养法：单细胞接种到小室里，密封培：单细胞接种到小室里，密封培养，观测单细胞的生长发育情况养，观测单细胞的生长发育情况（3 3）平板培养法平板培养法：单细胞接种于固体培养基上，：单细胞接种于固体培养基上，获得单细胞形成的细胞系获得单细胞形成的细胞系（4 4）条件培养法条件培养法：接种于条件培养基上形成的细：接种于条件培养基上形成的细胞系。条件培养基指培养过细胞的培养基上清，胞系。条件培养基指

23、培养过细胞的培养基上清，有植物生长激素等残留，用于制备成固体培养基。有植物生长激素等残留，用于制备成固体培养基。2.2.单倍体细胞的培养单倍体细胞的培养（花药培养）：指将植物单倍（花药培养）：指将植物单倍体细胞培养成单倍体植株或纯和二倍体植株体细胞培养成单倍体植株或纯和二倍体植株一般采取花药作为单倍体细胞的培养对象一般采取花药作为单倍体细胞的培养对象用花粉在固体培养基上培养用花粉在固体培养基上培养3.3.愈伤组织培养愈伤组织培养愈伤组织既是组织又是细胞，为脱分化细胞，具愈伤组织既是组织又是细胞，为脱分化细胞，具再分化的能力，可用于次生代谢物的生产，也可再分化的能力，可用于次生代谢物的生产，也可

24、再生为植株。再生为植株。4.4.毛状根诱导和培养毛状根诱导和培养一些次生代谢产物只有在根里生长一些次生代谢产物只有在根里生长发根农杆菌感染双子夜植物，发根农杆菌感染双子夜植物，RIRI质粒诱导产生毛质粒诱导产生毛状根。状根。形态方面：形态方面：RiRi质粒诱导快速生长的、非定向性、质粒诱导快速生长的、非定向性、高分支的毛状根的形成高分支的毛状根的形成代谢方面：代谢方面：RiRi质粒转化根能合成与原植物相同或质粒转化根能合成与原植物相同或相似的次生代谢物，并且发根合成次生代谢物具相似的次生代谢物，并且发根合成次生代谢物具有遗传稳定性。有遗传稳定性。毛状根生长快速和次级代谢产物含量高，特别适毛状根

25、生长快速和次级代谢产物含量高，特别适用于从木本植物和难于培养的植物中得到较高含用于从木本植物和难于培养的植物中得到较高含量的次级代谢产物。量的次级代谢产物。毛状根具有如下特点：毛状根具有如下特点：激素自养激素自养，不必加外源激素；，不必加外源激素；次级代谢产物含量次级代谢产物含量高高且且稳定稳定；增殖速度增殖速度快快。用用发根农杆菌经发根农杆菌经直接注射法，外植体接种感染，直接注射法，外植体接种感染，原生质体共培养法诱导毛状根原生质体共培养法诱导毛状根发根农杆菌转化后，经筛选鉴定发根农杆菌转化后，经筛选鉴定低盐浓度下生长，培养低盐浓度下生长，培养植物细胞培养工业化存在的问题植物细胞培养工业化存

26、在的问题生长缓慢生长缓慢,通常完成一次生产周期需通常完成一次生产周期需4-54-5周周次级代谢物含量低次级代谢物含量低培养细胞不稳定等培养细胞不稳定等多数产物积累于胞内多数产物积累于胞内不耐受剪切力不耐受剪切力一般的说，只有当次级代谢产物的价格高于一般的说，只有当次级代谢产物的价格高于10001000美元美元/kg/kg时，才考虑采用植物细胞培养方法。时，才考虑采用植物细胞培养方法。第三节第三节 转基因植物转基因植物一、转基因植物的产生和发展一、转基因植物的产生和发展（一）转基因植物的基本概念（一）转基因植物的基本概念转基因植物：转基因植物：遗传修饰体遗传修饰体(genetically(gen

27、etically modified organisms,GMOs)modified organisms,GMOs)近年发展迅速近年发展迅速应用广泛应用广泛世界第一例转基因植物世界第一例转基因植物-烟草烟草19831983年在美国问世。年在美国问世。19861986年年,首批转基因植物首批转基因植物-抗虫和抗除草剂棉花进抗虫和抗除草剂棉花进入田间试验。入田间试验。19921992年中国成为世界上第一个转基因植物商品化年中国成为世界上第一个转基因植物商品化种植的国家，开创了转基因植物商品化应用的先种植的国家，开创了转基因植物商品化应用的先河；当时种植的是一种抗黄瓜花叶病毒和烟草花河；当时种植的是一

28、种抗黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒双价转基因烟草。叶病毒双价转基因烟草。（二）转基因植物的几大类型（二）转基因植物的几大类型1.1.抗除草剂抗除草剂:除草作用的酶和蛋白质基因;以除草剂为底物的酶的基因转移2.2.抗虫抗虫:从细菌中、植物组织中和动物体内分离出相关抗性基因,转入植物中3.3.抗病抗病4.4.抗逆境抗逆境:抗旱、抗寒、抗热和抗盐5.5.品质改良品质改良6.6.代谢修饰代谢修饰7.7.生产药物生产药物二、转基因植物技术原理和方法二、转基因植物技术原理和方法（一）基因获得（一）基因获得（1 1）氨基酸序列反推核酸序列，合成探针，从基）氨基酸序列反推核酸序列，合成探针，从基因组或因组或cDN

29、AcDNA文库中筛选文库中筛选利用这种方法人类首次人工合成了胰岛素基因。利用这种方法人类首次人工合成了胰岛素基因。虽然在早期采用这种方式已经成功地克隆了许多虽然在早期采用这种方式已经成功地克隆了许多基因。基因。局限性：兼并密码子局限性：兼并密码子;效率低效率低;未知基因及产物未知基因及产物分离蛋白质明确氨基酸序列推导核苷酸序列人工合成（2 2）分离蛋白，制备抗体，用抗体从）分离蛋白，制备抗体，用抗体从cDNAcDNA表达文表达文库中筛选库中筛选（3 3）根据数据库信息，利用保守区域制备）根据数据库信息，利用保守区域制备PCRPCR引引物，进行扩增物，进行扩增（4 4）以其他物种的类似基因为探针

30、，杂交分离相）以其他物种的类似基因为探针，杂交分离相应基因应基因（二）外源基因导入（二）外源基因导入1.1.载体转化系统载体转化系统 是目前植物基因工程中是目前植物基因工程中使用最多、机理最清楚、使用最多、机理最清楚、技术最成熟的、最重要的技术最成熟的、最重要的一种转化系统一种转化系统Tumor induced byTumor induced byA.tumefaciensA.tumefaciens冠瘿瘤冠瘿瘤过程：先将带有目的基因的质粒整合到农杆菌基过程：先将带有目的基因的质粒整合到农杆菌基因组中，再将此农杆菌与植物细胞共同培养因组中，再将此农杆菌与植物细胞共同培养363648h48h，转化

31、植物细胞，然后分离洗涤去菌后通过组，转化植物细胞，然后分离洗涤去菌后通过组织培养获得转基因植物或形成织培养获得转基因植物或形成冠瘿瘤冠瘿瘤和发状根等和发状根等组织，这些组织也就是一种天然的选择标记。组织，这些组织也就是一种天然的选择标记。(1)(1)根癌农杆菌根癌农杆菌转化系统。转化系统。含有含有TiTi质粒，感染质粒，感染双子叶植物双子叶植物时，质粒中时，质粒中DNADNA整合到植物的染色体上，并随染色体一起复制。整合到植物的染色体上，并随染色体一起复制。随后随后T-DNAT-DNA携带的基因在植物中表达出相应的蛋白携带的基因在植物中表达出相应的蛋白质。质。TiTi质粒是约质粒是约160-2

32、40kb160-240kb的环状的环状DNADNA分子。分子。TiTi质粒具有两个区域，质粒具有两个区域，T-DNAT-DNA和和毒性区域毒性区域(vir)(vir)还具有冠瘿碱代谢还具有冠瘿碱代谢(opine catabolism)(opine catabolism)、复制原、复制原点点(ori)(ori)。T-DNAT-DNA区包括：区包括：章鱼碱合成酶基因章鱼碱合成酶基因nosnos植物生长素生物合成酶基因植物生长素生物合成酶基因Tm1,Tm2Tm1,Tm2植物分裂素生物合成酶基因植物分裂素生物合成酶基因tmrtmrT-DNAT-DNA区编码的基因区编码的基因第一类是编码冠瘿碱合成酶及分

33、解代谢基因。第一类是编码冠瘿碱合成酶及分解代谢基因。第二类是致瘤基因第二类是致瘤基因l生长素基因（生长素基因（AuxAux）。即肿瘤细胞茎芽产生）。即肿瘤细胞茎芽产生TmsTms基基因（因（tumour morphology shoottumour morphology shoot）Aux-lAux-l（Tm-1Tm-1），编码色氨酸单加氧酶），编码色氨酸单加氧酶,将色氨酸转变成将色氨酸转变成吲哚乙酰胺吲哚乙酰胺IAMIAM Aux-2 Aux-2（Tm-2Tm-2），编码吲哚乙酰胺水解酶，将），编码吲哚乙酰胺水解酶，将IAMIAM转变转变成乙酸吲哚成乙酸吲哚IAAIAA。l细胞分裂素基因（细

34、胞分裂素基因（cytcyt），突变将引起易生根特性。），突变将引起易生根特性。故称为故称为TmrTmr（tumour morphology roottumour morphology root）基因）基因由于由于TmsTms和和TmrTmr基因的表达，使转化植物细胞内激基因的表达，使转化植物细胞内激素平衡紊乱，冠瘿瘤细胞无限生长，形成激素自素平衡紊乱，冠瘿瘤细胞无限生长，形成激素自主性特性，引起癌变。主性特性，引起癌变。T-DNAT-DNA:农杆菌侵染植物细胞时，从农杆菌侵染植物细胞时，从TiTi质粒上切割质粒上切割下来转移到植物细胞的一段下来转移到植物细胞的一段DNADNA，称为转移，称为转

35、移DNADNA。该该DNADNA片段上的基因与肿瘤的形成有关片段上的基因与肿瘤的形成有关直接参与转移并整合的，仅是直接参与转移并整合的，仅是T-DNAT-DNA两端与其它序列两端与其它序列交界处的交界处的25bp25bp不完全直接重复，为右界不完全直接重复，为右界(right right border,RB)border,RB)和左界和左界(left border,LBleft border,LB)。T-DNAT-DNA区域内区域内的所有基因与转移无关，将致瘤基因全部缺失即卸甲的所有基因与转移无关，将致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)(disarmed)后，将其它序列插入到这个区域，形

36、成的后，将其它序列插入到这个区域，形成的T-DNAT-DNA仍可将仍可将RBRB至至LBLB内的序列转移并整合到植物基因内的序列转移并整合到植物基因组。组。VirVir基因基因:区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同，同，TiTi质粒可以被分成四种类型：质粒可以被分成四种类型：章鱼碱型章鱼碱型(octopine)(octopine)胭脂碱型胭脂碱型(nopaline)(nopaline)农杆碱型（农杆碱型（agropineagropine）农杆菌素碱型（农杆菌素碱型（agrocinopine

37、agrocinopine）或称琥珀碱型）或称琥珀碱型(succinamopine)(succinamopine)为了使为了使TiTi质粒成为有效的外源基因导入载体，必质粒成为有效的外源基因导入载体，必须对野生型须对野生型TiTi质粒进行改造质粒进行改造去除致瘤基因，及冠瘿碱合成基因，保留左右边去除致瘤基因，及冠瘿碱合成基因，保留左右边界，及毒性区域界，及毒性区域增加选择标记（如：大观霉素）和报告基因增加选择标记（如：大观霉素）和报告基因增加大肠杆菌复制起始子，构建植物细胞增加大肠杆菌复制起始子，构建植物细胞-大肠杆大肠杆菌穿梭质粒菌穿梭质粒目前有目前有共整合载体系统共整合载体系统和和双元载体系

38、统双元载体系统共整合载体共整合载体：载体的：载体的T-DNAT-DNA区与区与TiTi质粒质粒VirVir区连锁，区连锁，又称之为顺式载体（又称之为顺式载体（cis-vectorcis-vector）。）。特点：由两个质粒（特点：由两个质粒（E.coliE.coli质粒和质粒和TiTi质粒）重质粒）重组而成，分子量较大；组而成，分子量较大；共合体的形成频率与两个质粒的重组频率有关共合体的形成频率与两个质粒的重组频率有关,相对较低；相对较低；必须用必须用SouthernSouthern杂交或杂交或PCRPCR对大的共整合体质粒对大的共整合体质粒进行检测；进行检测；构建时比较困难。构建时比较困难。

39、共整合载体和农杆菌共整合载体和农杆菌质粒重组过程质粒重组过程土壤农杆菌土壤农杆菌-植物植物DNADNA转移体系步骤转移体系步骤植物敏感细胞和土壤农杆菌相互作用植物敏感细胞和土壤农杆菌相互作用土壤农杆菌的毒性区基因被激活土壤农杆菌的毒性区基因被激活T-DNAT-DNA的切割和的切割和T T复合物生成复合物生成T T复合物由土壤农杆菌经植物细胞膜进入植物细复合物由土壤农杆菌经植物细胞膜进入植物细胞胞T-DNAT-DNA整合到植物染色体上整合到植物染色体上双元载体系统双元载体系统：由两个分别含：由两个分别含T-DNAT-DNA和和VirVir区的相区的相容性突变容性突变TiTi质粒构成的双质粒系统质

40、粒构成的双质粒系统,又因为其又因为其T-T-DNADNA与与VirVir基因在两个独立的质粒上，通过反式激基因在两个独立的质粒上，通过反式激活活T-DNAT-DNA转移转移,故称之为反式载体（故称之为反式载体（trans trans vectervecter）.包括两个包括两个TiTi质粒，即微型质粒，即微型TiTi质粒和辅助质粒和辅助TiTi质粒。质粒。（2 2）发根农杆菌介导转化）发根农杆菌介导转化RiRi质粒为根诱导质粒。质粒为根诱导质粒。RiRi质粒的结构与质粒的结构与TiTi质粒很相似，分为质粒很相似，分为T T区、区、virvir区、区、oriori区区等。等。T T区与区与TiT

41、i质粒的质粒的T-DNAT-DNA十分相似：十分相似：T T区的左右边界序列，含有区的左右边界序列，含有25bp25bp的重复序列。的重复序列。TL-DNATL-DNA区。该区中含有与毛状根形成有关的区。该区中含有与毛状根形成有关的rolArolA、B B、C C、D D基因群。基因群。TR-DNATR-DNA区。该区中含有与农杆碱合成有关的基因（区。该区中含有与农杆碱合成有关的基因（agsags）和生长素合成有关的基因（和生长素合成有关的基因（tms1tms1、tms2tms2）。）。agsags基因在转基因在转化的初期起着重要的作用，是不定根产生的关键化的初期起着重要的作用，是不定根产生的

42、关键和和TiTi质粒相比，质粒相比，RiRi质粒转化有许多优点：质粒转化有许多优点：RiRi质粒可以不经质粒可以不经“解除武装解除武装”进行转化，并且进行转化，并且转化产生的发根能够再生植株；转化产生的发根能够再生植株；发状根是一个单细胞克隆，可以避免嵌合体；发状根是一个单细胞克隆，可以避免嵌合体；RiRi质粒和质粒和TiTi质粒可以配合使用，建立双元载体质粒可以配合使用，建立双元载体系统，拓展了两种质粒应用范围；系统，拓展了两种质粒应用范围；发根适用于进行离体培养，很多植物的发根在发根适用于进行离体培养，很多植物的发根在离体培养条件下都有原植物次生代谢产物合成能离体培养条件下都有原植物次生代

43、谢产物合成能力。力。(3)(3)植物病毒载体植物病毒载体病毒载体只要与植物细胞共培养就可以较高地感病毒载体只要与植物细胞共培养就可以较高地感染植物细胞；且外源基因能在植物细胞中快速复染植物细胞；且外源基因能在植物细胞中快速复制和高水平表达。制和高水平表达。但病毒载体的容量有限但病毒载体的容量有限,不能包装大片段不能包装大片段,寄主范寄主范围窄围窄,复制稳定性差复制稳定性差,转录和复制机理复杂。转录和复制机理复杂。目前目前,用的较多的是用的较多的是花椰菜花斑病病毒花椰菜花斑病病毒(CaMV)(CaMV)和烟和烟草花叶病毒草花叶病毒(TMV)(TMV)。需要注意的是其他病毒侵染植株后可能会跟所用需

44、要注意的是其他病毒侵染植株后可能会跟所用的载体病毒之间发生信息交换的载体病毒之间发生信息交换,进而导致载体病毒进而导致载体病毒重新获得其致病能力重新获得其致病能力Promoters used for expression in transgenic plants35S,cauliflower mosaic virus 35S promoter CaMV 35S is a strong promoter that is active in essentially all dicot plant tissues.CaMV is a circular dsDNA genome virus2.2.基因

45、直接导入基因直接导入农杆菌载体转化系统对单子叶植物的局限性农杆菌载体转化系统对单子叶植物的局限性（1 1）DNADNA直接吸收到植物细胞直接吸收到植物细胞 制备原生质体，制备原生质体，电穿孔法电穿孔法 PEGPEG等介导基因转化等介导基因转化（2 2）显微注射法）显微注射法显微注射，是利用显微注射仪将外源显微注射，是利用显微注射仪将外源DNADNA直接直接注入受体细胞质或细胞核中。显微注射的一个注入受体细胞质或细胞核中。显微注射的一个重要问题是必须把受体细胞进行固定。重要问题是必须把受体细胞进行固定。不需要去除细胞壁不需要去除细胞壁成本高成本高细胞存活率低细胞存活率低（3 3）脂质体介导基因转

46、化）脂质体介导基因转化脂质体法是用脂类化学包裹脂质体法是用脂类化学包裹DNADNA成球体，通过成球体，通过植物原生质体的吞噬或融合作用把内含物转入植物原生质体的吞噬或融合作用把内含物转入受体细胞。受体细胞。优点优点,包括可保护包括可保护DNADNA在导入细胞之前免受核酸在导入细胞之前免受核酸酶的降解作用酶的降解作用,降低了对细胞的毒性效应降低了对细胞的毒性效应,适用适用的植物种类广泛的植物种类广泛,重复性高重复性高,包装在脂质体内的包装在脂质体内的DNADNA可稳定地贮藏等。可稳定地贮藏等。（4 4）粒子介导）粒子介导DNADNA转移转移基因枪法基因枪法（gene gungene gun）是依

47、赖高速的金属微粒将）是依赖高速的金属微粒将外源基因导入活细胞的一种转化技术。外源基因导入活细胞的一种转化技术。其基本原理是将外源其基本原理是将外源DNADNA包被在微小的金粒或钨粒包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下微粒被高速射入受体表面，然后在高压的作用下微粒被高速射入受体细胞或组织。微粒上的细胞或组织。微粒上的DNADNA进入细胞后整合到植物进入细胞后整合到植物染色体上得到表达，从而实现基因转化。染色体上得到表达，从而实现基因转化。是继农杆菌介导法之后的第二大基因转化法。是继农杆菌介导法之后的第二大基因转化法。在禾本科作物上应用较广泛在禾本科作物上应用较广泛基因枪法转化的优点有：

48、基因枪法转化的优点有：无宿主限制无宿主限制：农杆菌介导法只对双子叶植物敏感，：农杆菌介导法只对双子叶植物敏感，限制了它的应用范围。而基因枪没有物种限制。限制了它的应用范围。而基因枪没有物种限制。靶受体类型广泛靶受体类型广泛：可以是原生质体，叶片，悬浮：可以是原生质体，叶片，悬浮细胞，茎或根切段，种子胚，愈伤组织，花粉等。细胞，茎或根切段，种子胚，愈伤组织，花粉等。操作简单快速操作简单快速但该方法转化率低，外源但该方法转化率低，外源DNADNA整合机理不清楚。应整合机理不清楚。应该说该技术只处在研究阶段，尚未成熟。该说该技术只处在研究阶段，尚未成熟。3.3.种质转化系统法种质转化系统法 种质转化

49、系统种质转化系统是以植物自身的生殖系统种质细是以植物自身的生殖系统种质细胞为受体进行的转化，如花粉浸泡外源胞为受体进行的转化，如花粉浸泡外源DNADNA、DNADNA注射受粉后的子房等；注射受粉后的子房等；花粉管通道法花粉管通道法：利用植物在受精和胚发育初期接：利用植物在受精和胚发育初期接受外源受外源DNADNA的敏感性的敏感性 1.1.外源外源DNADNA转化花粉转化花粉 2.2.自花授粉后，下柱头，外源自花授粉后，下柱头，外源DNADNA滴在柱头，沿滴在柱头，沿花粉管道进入胚囊，转化受精前后的卵细胞花粉管道进入胚囊，转化受精前后的卵细胞常用植物基因转化方法特点比较常用植物基因转化方法特点比

50、较转化方法转化方法 农杆菌法农杆菌法 PEG法法电击法电击法微针注射法微针注射法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法受体材料受体材料 完整细胞完整细胞原生质原生质体体原生质原生质体体原生质体原生质体完整细胞完整细胞卵细胞卵细胞宿主范围宿主范围 有有无无无无无无无无有性繁殖植物有性繁殖植物组培条件组培条件 简单简单复杂复杂复杂复杂复杂复杂简单简单无无嵌合体比嵌合体比例例有有无无无无无无多多无无操作复杂操作复杂性性简单简单简单简单复杂复杂复杂复杂复杂复杂简单简单设备要求设备要求 便宜便宜便宜便宜昂贵昂贵昂贵昂贵昂贵昂贵便宜便宜工作效率工作效率 高高低低低低低低高高低低单子叶植单子叶植物应用物应