新编文档-第十章DNA复制医学课件ppt-精品文档.ppt

1、第第 三三 篇篇 基基 因因 信信 息息 的的 传传 递递Watson and CrickM.Wilkins Rosalind FranklinDNADNARNARNA复制复制复制复制逆转录逆转录转录转录翻译翻译蛋白质蛋白质F.Crick第第 十十 章章 DNA DNA 生生 物物 合合 成成(复制复制)DNA Biosynthesis(Replication)学习目标学习目标掌握：掌握：DNADNA复制的基本规律复制的基本规律掌握：掌握：DNADNA复制有关的酶和蛋白质因子复制有关的酶和蛋白质因子理解：原核和真核理解：原核和真核DNADNA复制的过程及二者间差异复制的过程及二者间差异掌握：逆

2、转录的过程及意义掌握：逆转录的过程及意义理解：理解：DNADNA突变的分子类型及突变的分子类型及DNADNA损伤修复方式损伤修复方式 了解：了解：DNADNA的其他复制方式的其他复制方式复制复制(replication)是指遗传物质的传代，以母链是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板为模板合成子链合成子链DNA的过程。的过程。复制复制亲代亲代DNA子代子代DNA第一节第一节 复制的基本规律复制的基本规律Basic Rules of DNA Replicationv复制的方式复制的方式半保留复制半保留复制(semi-conservative replication)v双向复制双向复制(bidir

3、ectional replication)v半不连续复制半不连续复制(semi-discontinuous replication)n半保留复制半保留复制的概念的概念:AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链母链DNA 复制过程中形成的复制叉复制过程中形成的复制叉子代子代DNA n子链继承母链遗传信息的几种可能方式子链继承母链遗传信息的几种可能方式:全保留式全

4、保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 半保留复制的实验依据半保留复制的实验依据N15-DNA的细菌的细菌培养于普培养于普通培养液通培养液 第一代第一代继续培养于继续培养于普通培养液普通培养液 第二代第二代梯度离心结果梯度离心结果N14-DNAN15-DNA 对照对照（二）半保留复制的意义（二）半保留复制的意义按半保留复制方式，子代按半保留复制方式，子代DNADNA与亲代与亲代DNADNA的的碱基序列一致碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的信息，体现了遗传的保守性保守性。(一一)原核生物细胞：原核生物细胞：有一个固定的复制起始点有一个固定的复制

5、起始点 (origin)(origin)oriterA B C53oriorioriori535533553复制子复制子3(二二)真核生物：真核生物：多起始点，双向复制多起始点，双向复制复制叉复制叉3 5 3 5 解链方向解链方向3 5 3 3 5 5 半不连续复制产生的原因？半不连续复制产生的原因？三、三、DNADNA一股子链复制的方向与解链方一股子链复制的方向与解链方向相反导致向相反导致半不连续复制半不连续复制顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为这股链称为领头链领头链。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能另一股链因为复制的方向

6、与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为为随从链随从链。复制中的不连续片段称为。复制中的不连续片段称为岡崎片段岡崎片段(okazaki fragment)。领头链连续合成而随从链不连续合成，就是复制领头链连续合成而随从链不连续合成，就是复制的的半不连续性半不连续性。第二节第二节 DNADNA复制的酶学和拓扑学变化复制的酶学和拓扑学变化一、一、DNADNA复制的化学反应复制的化学反应，(dNMP)n+dNTP (dNMP)n+1+PPi 参与参与DNADNA复制的物质复制的物质 底物底物(substrate):dATP,dGTP,

7、dCTP,dTTP聚合酶聚合酶(polymerase):依赖依赖DNA的的DNA聚合酶，简写聚合酶，简写 为为 DNA-pol模板模板(template):解开成单链的解开成单链的DNA母链母链引物引物(primer):提供提供3-OH末端使末端使dNTP可以依次聚合可以依次聚合 其他的酶和蛋白质因子其他的酶和蛋白质因子二、二、DNADNA聚合酶催化脱氧核苷酸间聚合聚合酶催化脱氧核苷酸间聚合全称：依赖全称：依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶(DNA-dependent DNA polymerase)简称：简称：DNA-pol活性：活性：1、53 的聚合活性的聚合活性2、核酸外切酶活性、核酸外切酶

8、活性5 A G C T T C A G G A T A 3|3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性 5 3 外切酶活性外切酶活性?能切除突变的能切除突变的 DNA片段。片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解。核酸外切酶活性核酸外切酶活性 原核生物的原核生物的DNADNA聚合酶聚合酶 I I II II III III3 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 +5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 +-聚合速度（聚合速度（bp/min）1000-120024001500060000持续合成能力持续合成能力3-

9、2001500500000功能功能校对，切校对，切除引物，除引物，修补空隙修补空隙修复修复复制复制，DNA-polDNA-pol（109kD109kD）一条多肽链，二级结构以一条多肽链，二级结构以 螺旋螺旋为主为主功能功能：对复制中的错误进行校读，对复制和对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。修复中出现的空隙进行填补。DNA-pol Arthur KornbergA.Kornberg&R.Kornberg323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶核酸外切酶大片段大片段/Klenow fragment 604 amino acids(氨基酸氨基酸)DNA 聚合酶聚合酶

10、5 核酸外切酶核酸外切酶N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是实验室合成片段是实验室合成DNA，进行，进行分子生物学研究中常用的工具酶。分子生物学研究中常用的工具酶。功能功能是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。DNA-pol (250kD)真核生物的真核生物的DNADNA聚合酶聚合酶DNA-pol 起始引发，有引物酶活性。起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性参与低保真度的复制参与低保真度的复制 。在复制过程中起校读、修复和填补缺在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用

11、。口的作用。在线粒体在线粒体DNADNA复制中起催化作用。复制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 不同生物体各种不同生物体各种DNADNA聚合酶具有共同的特点聚合酶具有共同的特点1 1、以、以dNTPdNTP为为原料原料2 2、合成、合成DNA DNA 新链具有新链具有模板模板 依赖性，严格遵循碱基配对规律。依赖性，严格遵循碱基配对规律。3 3、新链的延长只可沿、新链的延长只可沿5 5 3 3 方向方向进行进行 。催化核苷酸以。催化核苷酸以33，55磷酸二酯键相互连接磷酸二酯键相互连接 4 4、DNA DNA 新链生成需新链生成需引物的引物的33OHO

12、H末端延伸末端延伸DNADNA链，而不能从链，而不能从头合成头合成DNADNA链链 三、复制中的分子解链伴有三、复制中的分子解链伴有DNA DNA 分子分子拓扑学变化拓扑学变化DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。解成单链，它才能起模板作用。解螺旋酶解螺旋酶(helicase)利用利用ATP供能，作用于供能，作用于氢键，使氢键，使DNA双链解开成为两条单链。双链解开成为两条单链。引物酶引物酶(primase)合成一段合成一段RNA，提供，提供3-OH作为复制的引物。作为复制的引物。单链单链DNA结合蛋白结合蛋白(single s

13、tranded DNA binding protein,SSB)在复制中维持模板处于单链状在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整态并保护单链的完整。解螺旋酶解螺旋酶SSB防止防止DNADNA缠绕，打结。缠绕，打结。1010 8 8 局部解链后局部解链后（二）（二）DNADNA拓扑异构酶改变拓扑异构酶改变DNADNA超螺旋状态、理超螺旋状态、理顺顺DNADNA链链解链过程中解链过程中DNADNA的缠绕、打结的缠绕、打结拓扑异构酶作用特点拓扑异构酶作用特点既能水解既能水解 、又能连接磷酸二酯键、又能连接磷酸二酯键拓扑异构拓扑异构酶酶切断双链中的一股，并封闭切口，不切断双链中的一股，并封闭切口

14、，不需要水解需要水解ATPATP拓扑异构拓扑异构酶酶 切断切断DNADNA分子分子两股两股链，断端通过链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。切口旋转使超螺旋松弛。利用利用ATPATP供能，连接断端，供能，连接断端，DNADNA分子进入负超螺旋状态。分子进入负超螺旋状态。n拓扑酶的作用方式：拓扑酶的作用方式：连接连接DNADNA链链3 3-OH-OH末端和相邻末端和相邻DNADNA链链5 5-P-P末端，末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的相邻的DNADNA链链连接成一条完整的链。连接成一条完整的链。四、四、DNADNA连接酶连接连接酶连接DNADNA双链中的

15、单链缺口双链中的单链缺口POO-O-OHO5POO-O-O335DNA连接酶连接酶ATPADP5353T T4 4 DNADNA连接酶连接酶大肠杆菌大肠杆菌DNADNA连接酶连接酶DNADNA连接酶在复制中起最后连接缺口的作用。连接酶在复制中起最后连接缺口的作用。在在DNADNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。基因工程中连接目的基因和载体基因工程中连接目的基因和载体功能功能DNA生物合成过程生物合成过程The Process of DNA Replication第第 三三 节节（一）复制起始：（一）复制起始：DNA解链形成引发体解链形成引发体需要解决两个

16、问题：需要解决两个问题：1.DNA解开成单链，提供模板。解开成单链，提供模板。2.形成引发体，合成引物，提供形成引发体，合成引物，提供3-OH末端。末端。一、原核生物的一、原核生物的DNADNA生物合成生物合成E.coli复制起始点复制起始点 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245

17、串联重复序列串联重复序列 反向重复序列反向重复序列5 3 5 3 1.DNA1.DNA解链解链2.2.形成引发体形成引发体 Dna A Dna B、Dna CDNA拓扑异构酶拓扑异构酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 含有解含有解螺旋酶、螺旋酶、DnaCDnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和DNADNA复制起始复制起始区域区域的复合结构称为引发体。的复合结构称为引发体。3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短链引物是由引物酶催化合成的短链RNARNA分子。分子。引物引物3 HO5引物引物酶酶3.3.合成引物合成引物(二二)复制的延伸复制的延伸 子链延伸方向：子链延伸方向：5 5 3 3在在DN

18、A-polDNA-pol催化下，催化下，dNTPdNTP以以dNMPdNMP的方式逐个的方式逐个加入，不断形成磷酸二酯键的过程加入，不断形成磷酸二酯键的过程领头链的合成领头链的合成领头链的合成领头链的合成随从链的合成随从链的合成随从链的合成随从链的合成随从链模板随从链模板DNADNA的折叠环绕的折叠环绕阶段一阶段一阶段二阶段二阶段三阶段三阶段四阶段四复复制制过过程程简简图图（三）复制的终止过程：切除引物、填补空缺、（三）复制的终止过程：切除引物、填补空缺、连接切口连接切口5 5 5 RNA酶酶OHP5 DNA-pol dNTP5 5 PATP ADP+Pi5 5 DNA连接酶连接酶哺乳动物的哺

19、乳动物的细胞周期细胞周期DNA合成期合成期G1G2SM二、真核生物的二、真核生物的DNADNA生物合成生物合成 细胞能否分裂，决定于进入细胞能否分裂，决定于进入S期及期及M期这两个关期这两个关键点。键点。G1S及及G2M的调节，与蛋白激酶活的调节，与蛋白激酶活性有关。性有关。蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。实施调控作用。3.3.增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原(PCNA)(PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。在复制起始和延长中起关键作用。1.1.多起始点，多复制子、复制的时序性多起始点，多复制子、复制的时序性 2.2.复制的起始

20、需要复制的起始需要DNA-polDNA-pol（引物酶活性）和（引物酶活性）和polpol（解（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication(replication factor,RF)factor,RF)。（一）真核生物复制的起始与原核基本相似（一）真核生物复制的起始与原核基本相似3 5 5 3 领头链领头链3 5 3 5 亲代亲代DNA随从链随从链引物引物核小体核小体1 1、引物和冈崎片断比原核生物短、引物和冈崎片断比原核生物短2 2、核小体的解聚与重新装配、核小体的解聚与重新装配3 3、酶催化速率比原核慢，但由于是多复制子复制，总

21、、酶催化速率比原核慢，但由于是多复制子复制，总体速度并不慢体速度并不慢（二）真核生物复制的延长发生（二）真核生物复制的延长发生DNADNA聚合酶聚合酶/转换转换（三）端粒酶参与解决染色体末端复制问题（三）端粒酶参与解决染色体末端复制问题n切除引物的两种机制切除引物的两种机制5 3 3 5 5 3 3 5+5 3 3 3 3 5 5 端粒端粒(telomere)指真核生物染色体线性指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。分子末端的结构。n端粒的功能：端粒的功能：维持染色体的稳定性维持染色体的稳定性维持维持DNA复制的完整性复制的完整性n端粒的结构特点：端粒的结构特点：由末端单链由末端单链DNA

22、序列和蛋白质构成。序列和蛋白质构成。末端末端DNA序列是多次重复的富含序列是多次重复的富含G、T碱基碱基的短序列。的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG端粒酶端粒酶(telomerase)端粒酶端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)端粒酶协同蛋白端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1,hTP1)端粒酶逆转录酶端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTRT)组成组成 端粒酶催化端区端粒酶催化端区TGTG链的合成链的合成 5TTTTGGGGTT TTG-OH 3

23、 CAAAACCCCAAAA 端粒酶 G C G A 3A A 5 结合、聚合、杂交结合、聚合、杂交 5TTTTGGGGTTTT Gggg t t t t g 3 CAAAACCCCAAAAC G A G A 3 5 TTTT 移位移位 G G G g G g G g 5TTTT t t t t g 3 CAAAACCCCAAAAC G A G A 3 5 终止终止 5TTTTGGGGTTTTG g g g t t t t g g g g t t t t g-OH 35TTTTGGGG TTTTG g g g t t t t g g g g t t t t g-OH 33 5TTTTGGGG

24、TTTTG g g g t t t t g g g g t t 3 HO-g g g g t t DNA pol5TTTTGGGG TTTTG g g g t t t t g g g g t t 3AAAACCCCAAAACCCC AAAA g g g g t t1.遵守严格的碱基配对规律；遵守严格的碱基配对规律；2.聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；3.复制出错时复制出错时DNA-pol的及时校读功能。的及时校读功能。DNA复制的保真性：复制的保真性：逆转录和其他复制方式逆转录和其他复制方式第四节第四节逆转录酶逆转录酶(reverse transcrip

25、tase)(reverse transcriptase)逆转录逆转录(reverse transcription)(reverse transcription)逆转录酶逆转录酶一、逆转录病毒和逆转录酶一、逆转录病毒和逆转录酶 TeminBaltimore Peyton Rous 1966 Nobel prize winner for his discovery of tumour inducing viruses（1911）1970,Temin and Baltimore The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1975Rous逆转录病毒细胞内的逆转

26、录现象逆转录病毒细胞内的逆转录现象RNA 模板模板逆转录酶逆转录酶DNA-RNA 杂杂化双链化双链RNA酶酶H单链单链DNA逆转录酶逆转录酶双链双链DNA(cDNA)逆转录酶逆转录酶 A AA A T T T TAAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T分子生物学研究可应用逆分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法的基因的重要方法之一，此法称为称为cDNA法。法。以以mRNA为模板，经逆转为模板，经逆转录合成的与录合成的与mRNA碱基序列互碱基序列互补的补的DNA链。链。试管内合成试管内合成cDNAc

27、DNAcDNA complementary DNA 二、逆转录研究的意义二、逆转录研究的意义 逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。中的重大发现。逆转录现象说明：至少在某些生物，逆转录现象说明：至少在某些生物，RNARNA同样同样兼有遗传信息传代与表达功能。兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了对逆转录病毒的研究，拓宽了2020世纪初已注世纪初已注意到的病毒致癌理论。意到的病毒致癌理论。滚环复制滚环复制(rolling circle replication)(rolling circle replication)三、滚环复制和

28、三、滚环复制和D D环复制环复制 是某些低等生物的复制形式，如是某些低等生物的复制形式，如 X174和和M13噬菌体等。噬菌体等。3-OH5-P5 5 5 3 3 3 3 5滚环复制滚环复制5 5 3 3 5 dNTPDNA-pol D环复制环复制(D-loop replication)是线粒体是线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。的复制形式。DNA损伤（突变）与修复损伤（突变）与修复DNA Damage(Mutation)&Repair第五节第五节 DNA突变具体指个别突变具体指个别dNMP残基以至片段残基以至片段DNA在构成、复制或表型功能的异常变化，

29、在构成、复制或表型功能的异常变化，也称为也称为DNA损伤损伤(DNA damage)。从分子水平来看，突变就是从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基分子上碱基的改变。的改变。（一）突变是进化、分化的分子基础（一）突变是进化、分化的分子基础（二）只有基因型改变的突变形成（二）只有基因型改变的突变形成DNADNA的多态性的多态性（三）致死性的突变可导致个体、细胞的死亡（三）致死性的突变可导致个体、细胞的死亡 （四）突变是某些疾病的发病基础（四）突变是某些疾病的发病基础一、突变在生物界普遍存在一、突变在生物界普遍存在(一一)物理因素：辐射物理因素：辐射 UV嘧啶二聚体嘧啶二聚体二、多种化学或物理因

30、素可诱发突变二、多种化学或物理因素可诱发突变(二二)化学因素：化学因素：化学诱变剂化学诱变剂(一一)错配错配 HbsHbs：Glu Val,Glu Val,镰形红细胞贫血镰形红细胞贫血三、引起突变的分子改变类型有多种三、引起突变的分子改变类型有多种镰形红细胞贫血病人镰形红细胞贫血病人Hb(HbS)亚基亚基N-val his leu thr pro val glu C 肽链肽链CAC GTG基因基因正常成人正常成人Hb(HbA)亚基亚基N-val his leu thr pro glu glu C 肽链肽链CTC GAG基因基因（二）插入、缺失（二）插入、缺失0 0-Thalassemia(-T

31、halassemia(地中海贫血地中海贫血)0 0 Thalassemia ThalassemiaLeporeLepore血红蛋白症血红蛋白症（三）重组或重排常可引起遗传、肿瘤等疾病（三）重组或重排常可引起遗传、肿瘤等疾病框移突变框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。缺失或插入都可导致缺失或插入都可导致框移突变框移突变谷谷 酪酪 蛋蛋 丝丝5 G C A G U A C A U G U C 丙丙 缬缬 组组 缬缬正常正常5 G A G U A C A U G U C 缺失缺失C四、四、DNA损伤的

32、修复有多种类型损伤的修复有多种类型修复修复(repairing)是对已发生分子改变的补是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。偿措施，使其回复为原有的天然状态。错配修复错配修复(mismatch repair)直接修复直接修复(direct repair)光修复光修复(light repairing)切除修复切除修复(excision repairing)重组修复重组修复(recombination repairing)SOS修复修复 n修复的主要类型：修复的主要类型：UVPotolyase（光修复酶）（光修复酶）300-600nm（一）直接修复系统利用酶简单地逆转（一）直接修

33、复系统利用酶简单地逆转DNADNA损伤损伤 这是细胞内最重要和有效的修复方式。这是细胞内最重要和有效的修复方式。其过程包括去除损伤的其过程包括去除损伤的DNA，填补空隙和连接。，填补空隙和连接。主要由主要由DNA-pol和连接酶完成。和连接酶完成。UvrAUvrBUvrCOHPDNA聚合酶聚合酶OHPDNA连接酶连接酶ATPnE.coli的切的切除修复机制除修复机制人着色性干皮病：人着色性干皮病：Xeroderma pigmentosis,XP（三）重组修复（三）重组修复(四四)SOS)SOS 修复修复 SOS基因基因紫外线紫外线激活激活Rec ALex A阻遏蛋白阻遏蛋白 与与DNA 损伤修复有损伤修复有关的酶和蛋白质关的酶和蛋白质基因基因表达表达Lex A阻遏蛋白阻遏蛋白操纵序列操纵序列DNA列表比较原核生物与真核生物列表比较原核生物与真核生物DNADNA复制的异同复制的异同与与DNADNA复制有关的主要酶和蛋白因子有哪些，功能如何复制有关的主要酶和蛋白因子有哪些，功能如何DNADNA半不连续复制产生的原因半不连续复制产生的原因思考题思考题