乙肝病毒核酸检测实验操作流程课件.ppt

1、乙肝病毒核酸检测乙肝病毒核酸检测实验操作流程实验操作流程广西临床检验中心广西临床检验中心 唐唐 娟娟主要内容HBV-DNA的检测原理HBV-DNAHBV-DNA操作流程操作流程 HBV-DNA检测结果分析临床意义DNA 提取PCR 扩增标本采集检测原理HBV：用一对乙型肝炎病毒特性引物（Primer）和一条乙型肝炎病毒特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、四种脱氧核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩增法定量检测乙型肝炎病毒DNA原理图每产生一条DNA链，就切断一条探针每切断一条探针，就产生一个荧光信号信号强度与结合探针的DNA分子数成正比操作流程一、标本采集

2、一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入无菌的干燥玻璃管室温（2225C）放置3060 分钟血标本使用水平离心机，4000转/分离心5分钟吸取上层血清吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管 血清的采集血浆的采集用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入含EDTAEDTA或枸橼酸钠或枸橼酸钠抗凝剂的试管立即轻轻颠倒玻璃管混合510次，使抗凝剂与静脉血充分混匀510分钟后即可分离出血浆，转移至1.5ml灭菌离心管注意事项尽量吸取血清的上层液，有纤维蛋白的标本应离心去除脂类浑浊标本拒收（离心4000rpm，5min）血清血清不能使用肝素抗凝因为对PCR扩增有抑制作用，且很难在核酸提取过程中

3、完全去除血浆二.HBV-DNA的提取打开打开HBV-DNA试剂盒试剂盒取出取出DNA浓缩液、浓缩液、DNA提取液提取液（置室温融解，充分混匀）（置室温融解，充分混匀）取已灭菌的取已灭菌的1.5ml离心管并按样本唯一编号离心管并按样本唯一编号加入加入DNA浓缩液和待测样本各浓缩液和待测样本各100ul（振荡混匀）（振荡混匀）12000rpm，离心，离心10min去上清，沉淀中加入去上清，沉淀中加入20ulDNA提取液提取液（振荡混匀）（振荡混匀）（阴、阳性质控品处理方法：各取（阴、阳性质控品处理方法：各取50ul，分别加入，分别加入DNA提取液各提取液各50ul）100恒温干浴恒温干浴10min

4、12000rpm离心离心5min注意事项1.加入等体积的浓缩液后请用震荡器剧烈震荡混匀。不能用移液器混匀2.标本12000rpm离心时一定要统一离心管摆放方向。离心后应沿着沉淀存在的对侧缓缓吸去上清，枪头贴管壁顺着液面下移，防止带走不可见的沉淀物。如沉淀不明显可以保留少量液体，建议将移液器量程调至190ul一次性吸取。注意事项3.浓缩离心后若出现有“絮状悬浮物”，去上清时应一并把“絮状悬浮物”吸除，不影响实验结果。如不吸取絮状悬浮物会导致实验结果偏低。4.加入20ul的DNA提取液（DNA提取液用前充分融解混匀),并用震荡器剧烈震荡混匀20秒后,瞬时离心。5.裂解温度要确保有1001，裂解时间

5、10min1三三.PCR.PCR 扩增步骤扩增步骤取上清液取上清液2ul2ul点样点样8000rpm8000rpm离心数秒离心数秒按顺序放进扩增仪微孔中按顺序放进扩增仪微孔中编辑软件，设置循环条件编辑软件，设置循环条件保存文件，运行保存文件，运行 注意：吸取上清液中上层注意：吸取上清液中上层2ul2ul进行加样，进行加样，不要吸取到沉淀。不要吸取到沉淀。循环条件循环条件循环次数、温度循环次数、温度93 2分钟 93 45秒55 60秒10个循环93 30秒55 45秒30个循环结果分析1.2.结果读取3.3.结果报告结果的报告必须简单清楚定量测定则必须报告量的多少 1、结果高于测定方法线性范围上限，可报告多少；也可对样本稀释后再测，结果乘以稀释倍数 2、结果低于方法的测定范围下限，则报告多少即可，不能报告不能报告“0 0”或阴性或阴性临床意义1、诊断早期乙型肝炎，提高HBV检测阳性率。2、判断HBV的传染性及病毒复制情况，综合血清学指 标，为临床提供准确的实验依据。3、追踪病程，动态观察抗病毒药物治疗效果。4、研究HBV感染的动态机理及探讨与癌症发生关系。5、研究HBV分子流行病学。