色谱法导论.ppt课件.ppt
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1、 色谱法原理色谱法原理2.1 2.1 概述概述 色谱法也叫层析法,它是一种色谱法也叫层析法,它是一种高效能的物理分离技术,将它用于高效能的物理分离技术,将它用于分析化学并配合适当的检测手段,分析化学并配合适当的检测手段,就成为色谱分析法。就成为色谱分析法。色谱法的最早应用是用色谱法的最早应用是用于分离植物色素,其方法是:于分离植物色素,其方法是:在一玻璃管中放入碳酸钙,在一玻璃管中放入碳酸钙,将含有植物色素(植物叶的将含有植物色素(植物叶的提取液)的石油醚倒入管中。提取液)的石油醚倒入管中。此时,玻璃管的上端立即出现几此时,玻璃管的上端立即出现几种颜色的混合谱带。然后用纯石油醚种颜色的混合谱带
2、。然后用纯石油醚冲洗,随着石油醚的加入,谱带不断冲洗,随着石油醚的加入,谱带不断地向下移动,并逐渐分开成几个不同地向下移动,并逐渐分开成几个不同颜色的谱带,继续冲洗就可分别得到颜色的谱带,继续冲洗就可分别得到各种颜色的色素,并可分别进行鉴定。各种颜色的色素,并可分别进行鉴定。色谱法也由此而得名。色谱法也由此而得名。现在的色谱法早已不局限于色素现在的色谱法早已不局限于色素的分离,其方法也早已得到了极大的的分离,其方法也早已得到了极大的发展,但其分离的原理仍然是一样的。发展,但其分离的原理仍然是一样的。我们仍然叫它色谱分析法。我们仍然叫它色谱分析法。一、色谱分离一、色谱分离的的基本原理:基本原理:
3、由以上方法可知,在由以上方法可知,在色谱法中存色谱法中存在两相,一相是在两相,一相是固定不动的,我们把固定不动的,我们把它叫做它叫做固定相固定相;另一相另一相则不断流过固则不断流过固定相,我们把它定相,我们把它叫叫做做流动相流动相。色谱法色谱法的分离原理就是利用待分的分离原理就是利用待分离的各种物质在两相中的离的各种物质在两相中的分配系数分配系数、吸附性能吸附性能等等亲和能力的不同来进行分亲和能力的不同来进行分离的。离的。使用外力使含有样品的流动相(气体使用外力使含有样品的流动相(气体、液体)通过一固定于柱中或平板上、与、液体)通过一固定于柱中或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面。流动相互不
4、相溶的固定相表面。当流动相当流动相中携带的混合物流经固定相时,混合物中中携带的混合物流经固定相时,混合物中的各组分与固定相发生相互作用。的各组分与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构由于混合物中各组分在性质和结构上的差异,与固定相之间产生的作用力的上的差异,与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同,随着流动相的移动,混大小、强弱不同,随着流动相的移动,混合物在两相间经过反复多次的分配平衡,合物在两相间经过反复多次的分配平衡,使得各组分被固定相保留的时间不同,从使得各组分被固定相保留的时间不同,从而按一定次序由固定相中先后流出。与适而按一定次序由固定相中先后流出。与适当的柱后检测方
5、法结合,实现混合物中各当的柱后检测方法结合,实现混合物中各组分的分离与检测。组分的分离与检测。二、色谱分类方法:二、色谱分类方法:色谱分析法有很多种类,从色谱分析法有很多种类,从 不同的角度出发可以有不同的分类方不同的角度出发可以有不同的分类方法。法。(一)从两相的状态分类:(一)从两相的状态分类:色谱法中,流动相可以是气体,也色谱法中,流动相可以是气体,也可以是液体,由此可分为气相色谱法(可以是液体,由此可分为气相色谱法(GCGC)和液相色谱法(和液相色谱法(LCLC)。固定相既可以是。固定相既可以是固体,也可以是涂在固体上的液体,由此固体,也可以是涂在固体上的液体,由此又可将气相色谱法和液
6、相色谱法分为又可将气相色谱法和液相色谱法分为气气-液色谱液色谱、气气-固色谱固色谱、液液-固色谱固色谱、液液-液液色谱色谱。分类情况如下:。分类情况如下:色谱法色谱法液相色谱法液相色谱法气相色谱法气相色谱法气气-液色谱法液色谱法气气-固色谱法固色谱法液液-固色谱法固色谱法液液-液色谱法液色谱法(二)按固定相的形式分类:(二)按固定相的形式分类:按固定相的状态可分为:按固定相的状态可分为:柱色谱柱色谱:固定相装在色谱柱中;:固定相装在色谱柱中;纸色谱纸色谱:利用滤纸作载体,吸附在:利用滤纸作载体,吸附在纸上的水作固定相;纸上的水作固定相;薄层色谱薄层色谱:将固体吸附剂在玻璃板:将固体吸附剂在玻璃
7、板或塑料板上制成薄层作固定相。或塑料板上制成薄层作固定相。(三)按分离原理分类(三)按分离原理分类:可分为:可分为:吸附色谱法吸附色谱法:利用吸附剂(固定:利用吸附剂(固定相一般是固体)表面对不同组分吸相一般是固体)表面对不同组分吸附能力的差别进行分离的方法;附能力的差别进行分离的方法;分配色谱法分配色谱法:利用不同组分在两:利用不同组分在两相间的分配系数的差别进行分离的方相间的分配系数的差别进行分离的方法。法。离子交换色谱离子交换色谱:利用溶液中:利用溶液中不同离子与离子交换剂间的交换不同离子与离子交换剂间的交换能力的不同而进行分离的方法。能力的不同而进行分离的方法。空间排斥(阻)色谱法空间
8、排斥(阻)色谱法:利:利用多孔性物质对不同大小的分子用多孔性物质对不同大小的分子的排阻作用进行分离的方法。的排阻作用进行分离的方法。2.2 色谱流出曲线(色谱图)及色谱流出曲线(色谱图)及有关术语有关术语 (一)气相色谱法分离的过程:(一)气相色谱法分离的过程:分离过程(以分离分离过程(以分离A、B两组两组 分为例)为:分为例)为:混合组混合组分的分分的分离过程离过程及检测及检测器对各器对各组份在组份在不同阶不同阶段的响段的响应应024681012024681002468101202468100246810120246810(二)色谱流出曲线:(二)色谱流出曲线:从载气带着组分进入色谱柱起就从
9、载气带着组分进入色谱柱起就用检测器检测流出柱后的气体,并用用检测器检测流出柱后的气体,并用记录仪记录信号随时间变化的曲线,记录仪记录信号随时间变化的曲线,此曲线就叫色谱流出曲线此曲线就叫色谱流出曲线,当待测组,当待测组分流出色谱柱时,检测器就可检测到分流出色谱柱时,检测器就可检测到其组分的浓度,在流出曲线上表现为其组分的浓度,在流出曲线上表现为峰状,叫峰状,叫色谱峰色谱峰。如图所示为一色谱流出曲线:如图所示为一色谱流出曲线:色谱术语:色谱术语:1)基线:)基线:在实验条件下,在实验条件下,色谱柱后仅有纯流动相进入检测色谱柱后仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线称为基线。器时的流出曲线称为基线。基
10、线基线在稳定的条件下应是一条水平的在稳定的条件下应是一条水平的直线。直线。它的平直与否可反应出实它的平直与否可反应出实验条件的稳定情况。验条件的稳定情况。2 2)峰高()峰高(h h)和峰面积)和峰面积 :色谱色谱峰顶点与基线的距离叫峰高。峰顶点与基线的距离叫峰高。色谱峰色谱峰与峰底基线所围成区域的面积叫峰面与峰底基线所围成区域的面积叫峰面积。积。3 3)保留值)保留值 a.a.死时间死时间(t(t0 0):不与固定相作用的不与固定相作用的物质从进样到出现峰极大值时的时间,它物质从进样到出现峰极大值时的时间,它与色谱柱的空隙体积成正比。由于该物质与色谱柱的空隙体积成正比。由于该物质不与固定相作
11、用,因此,其流速与流动相不与固定相作用,因此,其流速与流动相的流速相近。据的流速相近。据 t t0 0 可求出流动相平均流速可求出流动相平均流速 0tLu 柱长死时间ub.b.保留时间保留时间t tr r:试样从进样到出现试样从进样到出现峰极大值时的时间。它包括组份随流峰极大值时的时间。它包括组份随流动相通过柱子的时间动相通过柱子的时间t t0 0和组份在固定和组份在固定相中滞留的时间。相中滞留的时间。c.调整保留时间调整保留时间tr:某组份的保留某组份的保留时间扣除死时间后的保留时间,它时间扣除死时间后的保留时间,它是组份在固定相中的滞留时间。即是组份在固定相中的滞留时间。即保留时间为色谱定
12、性依据保留时间为色谱定性依据。由于同。由于同一组份的保留时间与流速有关,因一组份的保留时间与流速有关,因此此有时需用保留体积来表示保留值有时需用保留体积来表示保留值。0rrttt d.d.死体积死体积V V0 0:色谱柱管内固定相颗:色谱柱管内固定相颗粒间空隙、色谱仪管路和连接头间空隙粒间空隙、色谱仪管路和连接头间空隙和检测器间隙的总和。忽略后两项可得和检测器间隙的总和。忽略后两项可得到:到:00coVt F000cwcorTppFFTpn其中,其中,Fco为柱出口的载气流为柱出口的载气流速速(mL/min),其值为:,其值为:nF0-检测器出口流速;检测器出口流速;Tr-室温室温;Tc-柱温
13、;柱温;p0-大气压;大气压;pw-室温室温时水蒸汽压。时水蒸汽压。e.保留体积保留体积Vr:指从进样到待测:指从进样到待测物在柱后出现浓度极大点时所通过物在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。的流动相的体积。0rcoVtF f.f.调整保留体积调整保留体积 :某组份的:某组份的保留体积扣除死体积后的体积。保留体积扣除死体积后的体积。rV0rrrcoVVVtFg.相对保留值r2,1:组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比。222,111rrrrtVrtVn注意:注意:r2,1只与柱温和固定相性质有关只与柱温和固定相性质有关,而而与柱内径、柱长与柱内径、柱长L、填充情况及流动相、填充情
14、况及流动相流速无关,流速无关,因此,因此,在色谱分析中,尤其是在色谱分析中,尤其是GC中广泛用于定性的依据!中广泛用于定性的依据!具体做法:固定一个色谱峰为标准具体做法:固定一个色谱峰为标准s,然,然后再求其它峰后再求其它峰 i 对标准峰的相对保留值,对标准峰的相对保留值,此时以此时以 表示:表示:()()rst it sn 1,又称又称选择因子选择因子。h.h.区域宽度区域宽度:色谱峰的区域:色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之宽度是色谱流出曲线的重要参数之一,可用于衡量色谱柱的柱效及反一,可用于衡量色谱柱的柱效及反映色谱操作条件下的动力学因素。映色谱操作条件下的动力学因素。宽度越窄,
15、其效率越高,分离的效宽度越窄,其效率越高,分离的效果也越好。果也越好。区域宽度通常有三种表示方法:区域宽度通常有三种表示方法:标准偏差标准偏差:峰高:峰高0.607 0.607 倍处峰倍处峰宽处的一半。宽处的一半。半峰宽半峰宽W W1/21/2:峰高一半处的峰宽。:峰高一半处的峰宽。W W1/21/2=2.354=2.354 峰底宽峰底宽W W:色谱峰两侧拐点上切:色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间的距离。线与基线的交点间的距离。W=4W=4 色谱流出曲线的意义:色谱流出曲线的意义:色谱峰数色谱峰数=样品中单组份的最少个数;样品中单组份的最少个数;色谱保留值色谱保留值定性依据;定性依据;色谱峰
16、高或面积色谱峰高或面积定量依据;定量依据;色谱保留值或区域宽度色谱保留值或区域宽度色谱柱分色谱柱分离效能评价指标;离效能评价指标;色谱峰间距色谱峰间距固定相或流动相选择固定相或流动相选择是否合适的依据。是否合适的依据。2.3 色谱法基本原理色谱法基本原理 色谱分析的目的是将样品中各组色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离,组分要达到完全分离,分彼此分离,组分要达到完全分离,两峰间的距离必须足够远,两峰间的两峰间的距离必须足够远,两峰间的距离是由组分在两相间的距离是由组分在两相间的分配系数分配系数决决定的,即与定的,即与色谱过程的热力学性质色谱过程的热力学性质有有关。关。但当两峰间虽有一定距离,
17、如果但当两峰间虽有一定距离,如果每个峰都很宽,以致彼此重叠,还是每个峰都很宽,以致彼此重叠,还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的,在色谱柱中传质和扩散行为决定的,即与色谱过程的动力学性质有关。因即与色谱过程的动力学性质有关。因此,此,要从热力学和动力学两方面来研要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。究色谱行为。一、描述分配过程的参数一、描述分配过程的参数 1 1、分配系数、分配系数(K)(K):如前所述,如前所述,分配色谱的分离是基于分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多样品组分在固定相和流动相之间反复多次地分配过
18、程次地分配过程,而吸附色谱的分离是基而吸附色谱的分离是基于反复多次地吸附一脱附过程于反复多次地吸附一脱附过程。这种分。这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述,而描述这种分配的参数称为来描述,而描述这种分配的参数称为分分配系数配系数。它是指在一定温度和压力下,组它是指在一定温度和压力下,组分在固定相和流动相之间分配达平衡时分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值,即的浓度之比值,即 smccK 溶质在固定相中的浓度溶质在流动相中的浓度 K K 只与固定相和温度有关,与两相只与固定相和温度有关,与两相体积、柱管特性和所用仪器无关。体积、柱管特性和所用
19、仪器无关。分配系数分配系数 K Kn 样品一定时,样品一定时,K K 主要取决于固定主要取决于固定相性质,相性质,在一定温度下,组分的分配在一定温度下,组分的分配系数系数 K K 越大,出峰越慢越大,出峰越慢;每个组份在;每个组份在各种固定相上的分配系数各种固定相上的分配系数K K不同;不同;选择选择适宜的固定相可改善分离效果;适宜的固定相可改善分离效果;n 试样中的各组分具有不同的试样中的各组分具有不同的K K值值是分离的基础;是分离的基础;某组分的某组分的K K=0=0时,时,即不被固定相保留,最先流出。即不被固定相保留,最先流出。在一定条件下,各种物质的在一定条件下,各种物质的K K是不
20、是不同的。同的。K K较小的组分较小的组分在色谱分析中每次在色谱分析中每次分配后在流动相中的浓度较大,因此分配后在流动相中的浓度较大,因此较早流出色谱柱较早流出色谱柱;K K较大的组分较大的组分每次分每次分配后在流动相中浓度较小,因此配后在流动相中浓度较小,因此较晚较晚流出色谱柱。流出色谱柱。当分配次数足够多时,就能将具当分配次数足够多时,就能将具有不同有不同K K的组分分开。所以,我们可以的组分分开。所以,我们可以认为,认为,色谱法是利用不同的物质具有色谱法是利用不同的物质具有不同的不同的K K值而进行分离的。值而进行分离的。而而K K的不同的不同则是由于各组分在固定相中的则是由于各组分在固
21、定相中的溶解度溶解度(对气(对气-液色谱)或液色谱)或吸附能力吸附能力(对气(对气-固色谱)不同而造成的。固色谱)不同而造成的。2.2.分配比分配比k k:在一定温度和压力下,组份在两相在一定温度和压力下,组份在两相间的间的分配达平衡时分配达平衡时,分配在固定相和分配在固定相和流动相中的质量比流动相中的质量比,称为分配比称为分配比。它它反映了组分在柱中的迁移速率反映了组分在柱中的迁移速率。又称又称保留因子保留因子。也叫也叫容量因子容量因子或或容量比容量比。n其中其中V Vm m V V0 0,V Vs s为固定相体积为固定相体积smmms sm mcVkcV组 分 在 固 定 相 中 的 质
22、量组 分 在 流 动 相 中 的 质 量 分配比分配比 k k 的求算:的求算:k k也等于组分也等于组分的校正保留时间与死时间的比值的校正保留时间与死时间的比值:0Rtkt 因此,因此,k k可通过实验测得。由此也可可通过实验测得。由此也可知道,知道,k k可表示出组分在柱中停留时间的可表示出组分在柱中停留时间的长短。长短。k k越大,停留时间也就越长。越大,停留时间也就越长。称为相比率,它也是反映色谱柱称为相比率,它也是反映色谱柱柱型特点的参数。对填充柱,柱型特点的参数。对填充柱,=6=6 3535;对毛细管柱,;对毛细管柱,=60=60 600600。/sssmmmmscm VVKkkc
23、m VV 3.3.K K 与与 k k 的关系:的关系:4.4.选择因子选择因子 :色谱柱对:色谱柱对A A、B B两组分两组分的选择因子的选择因子 定义如下:定义如下:()()rBBrAAtBkKtAkKA A为先流出的组分,为先流出的组分,B B 为后流出的组分。为后流出的组分。注意:注意:K K 或或 k k 反映的是某一组分在两反映的是某一组分在两相间的分配;相间的分配;而而 是反映两组分间的分是反映两组分间的分离情况!离情况!当两组分当两组分 K K 或或 k k 相同时,相同时,=1=1 时,两组分不能分开;当两组分时,两组分不能分开;当两组分 K K 或或 k k 相差越大时,相
24、差越大时,越大,分离得越好。也就越大,分离得越好。也就是说是说,两组分在两相间的分配系数不同,两组分在两相间的分配系数不同,是色谱分离的先决条件。是色谱分离的先决条件。和和 k k 是计算色谱柱分离效能的重要是计算色谱柱分离效能的重要参数!参数!二、塔板理论二、塔板理论 塔板理论塔板理论是描述色谱柱中组分是描述色谱柱中组分在两相间的分配状况及评价色谱柱在两相间的分配状况及评价色谱柱的分离效能的一种半经验式的理论的分离效能的一种半经验式的理论。塔板理论将一根色谱柱当作一个。塔板理论将一根色谱柱当作一个由许多塔板组成的精馏塔,用塔板由许多塔板组成的精馏塔,用塔板概念来描述组分在柱中的分配行为概念来
25、描述组分在柱中的分配行为。塔板是从精馏中借用的,是一种塔板是从精馏中借用的,是一种半经验理论,但半经验理论,但它成功地解释了色谱它成功地解释了色谱流出曲线呈正态分布。流出曲线呈正态分布。塔板理论假定:塔板理论假定:1 1)在柱内一小段长度)在柱内一小段长度H H内,组分内,组分可以在两相间迅速达到平衡可以在两相间迅速达到平衡。这一小这一小段柱长称为理论塔板高度段柱长称为理论塔板高度H H;2 2)流动相进入色谱柱不是连续进)流动相进入色谱柱不是连续进行的,而是脉动式,每次进入一个塔行的,而是脉动式,每次进入一个塔板体积;板体积;3 3)所有组分开始时存在于第)所有组分开始时存在于第号塔板上,而
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