Bα基因转染肝癌细胞(Hep-G2)的辐射增敏作用课件.ppt

1、 核 因 子核 因 子 a p p a B（NF-B）是近十多年来是近十多年来发现的重要转录因子，它与细发现的重要转录因子，它与细胞的增生、分化和凋亡关系密胞的增生、分化和凋亡关系密切，与肿瘤的发生、发展密切切，与肿瘤的发生、发展密切相关相关。介导肿瘤形成和转移的介导肿瘤形成和转移的癌基因受转录因子癌基因受转录因子NF-B的的调节。这些基因主要有调节。这些基因主要有Bcl-2、Bax、Bcl-x1、p53、c-myc等。等。IB（inhibitor B）是是NF-B的抑制的抑制蛋白。在稳定分子及抑制蛋白。在稳定分子及抑制NF-B与与DNA结合中发挥作用。结合中发挥作用。IB是是IB家族中对家族

2、中对NF-B抑制最强抑制最强的蛋白，的蛋白，NF-B能上调能上调IB，使使IB通过自身反馈环路来调节通过自身反馈环路来调节NF-B活性。活性。n突变型突变型IB(mIB)是是IB的突变体，它较的突变体，它较IB更为稳定，更为稳定，当其与当其与NF-B结合后，可形成结合后，可形成稳定的二聚体。稳定的二聚体。材料与方法材料与方法 l通过腺病毒载体系统通过腺病毒载体系统pAdEasy系统系统构建的构建的含目的基因的重组腺病毒质粒含目的基因的重组腺病毒质粒(pAd-mIBpAd-mIB)及对照质粒及对照质粒pAd已经经已经经过过脂质体法成功转染脂质体法成功转染293包装细胞包装细胞l并经过并经过293

3、细胞包装产生腺病毒，感细胞包装产生腺病毒，感染染293细胞的最佳细胞的最佳MOI=25l mIBmIB腺病毒感染肝癌细胞后的腺病毒感染肝癌细胞后的GFPGFP表达阳性表达阳性 mIBmIB蛋白在肝癌细胞蛋白在肝癌细胞(HepHep G2)G2)中的表达中的表达 1.Hep G2/Ad-mIB感染肝癌细胞感染肝癌细胞2.2.HepHep G2/Adv G2/Adv感染肝癌细胞感染肝癌细胞3.3.肝癌细胞肝癌细胞 1 2 3lTUNELTUNEL染色染色 HepG2/Ad-mIBHepG2/Ad-mIB细胞阳性细胞阳性 HepG2/AdvHepG2/Adv细胞阴性细胞阴性 结 果024680.00

4、10.010.11Hep G 2/Ad-m I BHep G2/AdvHep G2Radiation DoseSurviving Fraction 细胞集落形成率细胞集落形成率 各组肝癌细胞经不同剂量各组肝癌细胞经不同剂量X X射线照射后细胞存活分数射线照射后细胞存活分数 照射前后肝癌细胞照射前后肝癌细胞TUNELTUNEL染色阳性率染色阳性率(%)(%)组别组别 照射前照射前 照射后照射后 X X2 2值值 P P值值 HepHep G2/Ad-mIBa 18.2 68.3 51.13 0.01 G2/Ad-mIBa 18.2 68.3 51.13 0.01 HepHep G2/Adv 1.

5、4 11.7 8.67 0.01 G2/Adv 1.4 11.7 8.67 0.01 HepHep G2 1.6 8.9 5.36 0.05 G2 1.6 8.9 5.36 0.05 照射前后各组肝癌细胞内照射前后各组肝癌细胞内IBaIBa蛋白蛋白ODOD值值 组别组别 照射前照射前 照射后时间（照射后时间（h h）1 12 24 1 12 24 HepHep G2/Ad-mIBa 1110 881 778 760 G2/Ad-mIBa 1110 881 778 760 HepHep G2/Adv 360 250 260 230 G2/Adv 360 250 260 230 HepHep G2

6、 406 380 250 210 G2 406 380 250 210照射前IBa蛋白1.Hep G2/Ad-mIB组；2.Hep G2/Adv组；3.Hep G2组 1 2 3照射后Hep G2/Adv组1.照射后1h；2.照射后12h；3.照射后24h 1 2 3 1 2 3 1 2 3照射前后照射前后IBaIBa蛋白蛋白Western BlotWestern Blot检测检测照射后Hep G2组1.照射后1h；2.照射后12h；3.照射后24h照射后Hep G2/Ad-mIB组1.照射后1h；2.照射后12h；3.照射后24hEMSAEMSA法检测转染法检测转染mIBamIBa 6Gy

7、6Gy照射前后照射前后NF-BNF-B活性变化活性变化1照射前Hep G2；2.照射前；3.照射前Hep G2/Ad-mIBa；4.照射后1h Hep G2；5.照射后12h Hep G2/Adv；6.照射后24h Hep G2/Ad-mIBa；7.照射后1h Hep G2；8.照射后12h Hep G2/Adv；9.照射后24h Hep G2/Ad-mIBa；10.照射后1h Hep G2；11.照射后12h Hep G2/Adv；12.照射后24h Hep G2/Ad-mIBa；图3-8 照射前后各组肝癌细胞PCNA表达阳性率00.10.20.30.4Hep G2/mIkBaHep G2/

8、AdvHepG2阳性率(%)照射后照射前 讨讨 论论 HepHep G2/Ad-mIB G2/Ad-mIB组照射前未见组照射前未见NF-BNF-B活化，照射后活化，照射后1 1，1212，2424h h 亦未见其活化，亦未见其活化，说明由于转染说明由于转染mIBmIB后细胞内持续表达，后细胞内持续表达，高活性的高活性的IBIB已几乎完全覆盖了已几乎完全覆盖了NF-BNF-B活活性；而性；而HepHep G2/Adv G2/Adv组及组及HepHep G2 G2组照射前组照射前NF-NF-BB见轻度活化，说明细胞属于基本正常的见轻度活化，说明细胞属于基本正常的代谢状况，照射后代谢状况，照射后1

9、1h h 二组二组NF-BNF-B活性均明活性均明显增加，与放射线的诱导有关；照射后显增加，与放射线的诱导有关；照射后1212h h、24h 24h 两组活性较之照射后两组活性较之照射后1 1h h有所减弱似乎不有所减弱似乎不能与能与IBIB蛋白表达对应解释蛋白表达对应解释 lPCNA(PCNA(增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原)与细胞周期及细胞增殖状态有明显关与细胞周期及细胞增殖状态有明显关系，系，G G0 0/G/G1 1期细胞无明显的期细胞无明显的PCNAPCNA表达，表达，G G1 1晚期合成增加，晚期合成增加，S S期达期达高峰。组织分化低，恶性程度高，细胞增殖率高，高峰。组织分化低，恶

10、性程度高，细胞增殖率高，PCNAPCNA阳性率阳性率显著增高。此蛋白是聚合酶显著增高。此蛋白是聚合酶相关蛋白，在相关蛋白，在S S期早期，期早期，PCNAPCNA呈呈散在颗粒状分布在细胞核内，在散在颗粒状分布在细胞核内，在DNADNA合成后期，细胞核内可见合成后期，细胞核内可见大量的大量的PCNAPCNA分布。本实验通过检测照射前后肝癌细胞分布。本实验通过检测照射前后肝癌细胞PCNAPCNA表达表达率发现：率发现：照射前照射前HepHep G2/Ad-mIB G2/Ad-mIB组组PCNAPCNA阳性率为阳性率为20%20%，低，低于于HepHep G2/Adv G2/Adv组（组（35%35

11、%）及）及HepHep G2 G2组（组（38%38%），与），与HepHep G2/Adv G2/Adv组组比较比较,差别有显著性差别有显著性(X X2 2=5.64,P0.05)=5.64,P0.05)，与与HepHep G2 G2组比较，差组比较，差别有非常显著性别有非常显著性(X X2 2=7.86=7.86，P0.01)P0.05)P0.05)。Hep G2/AdvHep G2/Adv组、组、HepHep G 2 G 2组照射后与照组照射后与照射前相比较射前相比较PCNAPCNA阳性率差别有显著性阳性率差别有显著性(P0.05)P0.05)，；，；HepHep G2/Ad-mIBG2

12、/Ad-mIB组组PCNAPCNA阳性率在照射后明显减少阳性率在照射后明显减少(P0.01)P0.01)，此此结果与文献报告相符。结果与文献报告相符。NF-NF-BB、IBIB与与PCNAPCNA是否存在分子生物是否存在分子生物学联系目前尚不清楚，从本实验结果分析可能学联系目前尚不清楚，从本实验结果分析可能存在一定关系。由于存在一定关系。由于Wt p53Wt p53对对DNADNA损伤剂诱导损伤剂诱导的肿瘤细胞凋亡是必不可少的的肿瘤细胞凋亡是必不可少的9191 ，NF-BNF-B在在p53p53介导的细胞死亡中有极其重要的地位介导的细胞死亡中有极其重要的地位3131，8888，而，而p53p5

13、3和和PCNAPCNA又都参与细胞的增殖过程和又都参与细胞的增殖过程和细胞周期调控。因此细胞周期调控。因此PCNAPCNA可能借可能借p53p53作为桥梁作为桥梁与与NF-BNF-B形成相关联系。形成相关联系。l结论结论：1 1腺病毒载体腺病毒载体AdEasyAdEasy 系统易于构建含目的基因系统易于构建含目的基因的腺病毒质粒，其腺病毒颗粒有很高的感染率，的腺病毒质粒，其腺病毒颗粒有很高的感染率，目的基因在此系统中可以高效表达。目的基因在此系统中可以高效表达。2 2mIBmIB基因可以诱导基因可以诱导HepHep G 2 G 2细胞凋亡。细胞凋亡。3 3mIBmIB基因转染可以增加基因转染可以增加HepHep G 2 G 2细胞的放细胞的放射敏感性，这种作用主要是通过细胞凋亡途径射敏感性，这种作用主要是通过细胞凋亡途径产生的，推测其机理可能与外源性产生的，推测其机理可能与外源性mIBmIB基因基因表达产物封闭表达产物封闭NF-BNF-B活性及活性及PCNAPCNA蛋白降解有关。蛋白降解有关。Thanks