人K562细胞系染色体标本制备及核型初步分析课件.ppt

1、人人K562细胞系染色体标本制备细胞系染色体标本制备及核型初步分析及核型初步分析 医学遗传教研室2016.11实验目的实验目的 熟悉人类有核细胞（k562）染色体标本的制备方法制备方法。熟悉染色体核分裂相的初步分析初步分析。实验原理实验原理 染色体:见于细胞有丝分裂细胞有丝分裂过程中,通常利用有核细有核细胞（如外周血、细胞系、羊水、绒毛）胞（如外周血、细胞系、羊水、绒毛）制备染色体标本，显微镜下观察。通常情况下，通常情况下，少量外周血(0.5ml)做短期培养，至72h细胞进入增殖旺盛期，或者细胞系细胞系增殖至旺盛期，此时加入秋水仙素秋水仙素抑制细胞分裂，使其停止在中期中期以获得足够的分裂期细胞

2、。实验过程 细胞培养、收集、低渗、固定、制片、染培养、收集、低渗、固定、制片、染色色后镜下观察观察进行核型分析。以外周血为例，实验流程如上以外周血为例，实验流程如上终终止培养前止培养前2-4小小时时，加入秋水仙素，加入秋水仙素收集培养物至离心管，离心（配平，收集培养物至离心管，离心（配平，1200 rpm,6min）用吸管弃上清，加用吸管弃上清，加8ml 0.075mol/L KCl，吹打混匀，吹打混匀37，低渗，低渗20min加加1ml 固定液预固定，小心吹打，混匀固定液预固定，小心吹打，混匀1200 rpm离心离心6-8min（注意配平）（注意配平）弃上清，加弃上清，加8ml固定液，室温固

3、定固定液，室温固定20-30min1200 rpm离心离心6-8min实验步骤实验步骤留少量固定液制成细胞悬液留少量固定液制成细胞悬液(沉淀高度的沉淀高度的1-2倍倍)滴片（滴片（1-2滴至凉玻片），干燥滴至凉玻片），干燥吉姆吉姆萨萨染液染染液染5min冲洗玻片（背面）冲洗玻片（背面）风筒吹干风筒吹干镜镜下下观观察察终止培养、收集、低渗、固定滴片，吹干染色，去浮色如何使用显微镜如何使用显微镜 首先，首先，肉眼观察肉眼观察玻片上染料的痕迹玻片上染料的痕迹;然后，然后，10倍倍镜下聚焦，微移载物台，将理想的核分裂相调镜下聚焦，微移载物台，将理想的核分裂相调至视野中央；至视野中央；物镜切换为物镜切换

4、为40倍倍,再次微调至视野清晰，并选择理想的核再次微调至视野清晰，并选择理想的核分裂相调整至视野中央；挪开镜头，滴分裂相调整至视野中央；挪开镜头，滴1滴镜油；滴镜油；物镜切换为物镜切换为100倍倍,微调至清晰图像微调至清晰图像,观察记录分析；观察记录分析；使用后，关掉电源，用擦镜纸沾二甲苯脱镜油。使用后，关掉电源，用擦镜纸沾二甲苯脱镜油。K562核分裂像核分裂像 细胞染色体数目变异范围为 44 71,干系核型为亚三倍体,染色体众数为 6 2 2外周血核分裂相外周血核分裂相46，XX【标本质量不佳的原因】秋水仙素处理不当秋水仙素处理不当：浓度不够或处理时间不足，结果分裂相太少；浓度过高或处理时间

5、过长，染色体过于缩短难于分析；低渗处理不当低渗处理不当：时间过长，细胞膜往往过早破裂，染色体丢失；低渗处理不够，则染色体分散不佳，难以计数分析；离心速度不合适离心速度不合适：收集细胞时离心速度太低易丢失细胞；低渗后离心速度过高，使分裂相过早破裂，完整分裂相减少；标本固定不充分标本固定不充分：如固定液不新鲜，或甲醇、冰醋酸的质量不佳，则染色体模糊，或残留胞浆痕迹，使背景不清；玻片去污不彻底玻片去污不彻底，冷冻不够，使细胞悬液不能均匀附着以致细胞大量丢失，或染色体分散不佳。思考题 核型制备的常见材料常见材料有哪些？哪些人需要核型检查报告核型检查报告？PHA，秋水仙素，低渗液，固定液的作用？是否可通过核型初步判断个体性别？