三薄层色谱课件.ppt
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- 薄层 色谱 课件
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1、一、一、平面色谱分类与分离原理平面色谱分类与分离原理二、二、技术参数与基本流程技术参数与基本流程三、三、薄层色谱薄层色谱四、四、纸色谱纸色谱五、五、薄层电泳薄层电泳学学 习习 内内 容容1.1.平面液相色谱仪的分类平面液相色谱仪的分类一平面液相色谱分类与分离原理一平面液相色谱分类与分离原理l 纸色谱法纸色谱法l 薄层色谱法薄层色谱法l 薄层电泳法薄层电泳法 2.2.平面液相色谱仪的分离原理平面液相色谱仪的分离原理一平面液相色谱分类与分离原理一平面液相色谱分类与分离原理 纸色谱、薄层色谱都属于纸色谱、薄层色谱都属于以液体为流动相以液体为流动相平面色谱分平面色谱分析法。但与其它色谱方法不同的是在分
2、离过程中一般析法。但与其它色谱方法不同的是在分离过程中一般不使不使用动力源用动力源。纸层析和薄层层析纸层析和薄层层析流动相的移动是依靠流动相的移动是依靠毛毛细作用细作用。将试样点在色谱滤将试样点在色谱滤纸或层析板的一端,并纸或层析板的一端,并将该端浸在作为流动相将该端浸在作为流动相的溶剂(常称之为展开的溶剂(常称之为展开剂)中,随着溶剂向上剂)中,随着溶剂向上的移动,经过试样点时的移动,经过试样点时,带动试样向上运动。,带动试样向上运动。2.2.平面液相色谱仪的分离原理平面液相色谱仪的分离原理一平面液相色谱分类与分离原理一平面液相色谱分类与分离原理纸色谱的载体:纸色谱的载体:层析滤纸,组成滤纸
3、的纤维素分子中具有很多层析滤纸,组成滤纸的纤维素分子中具有很多亲水性亲水性的羟基的羟基,当纤维素上的羟基与水结合后便形成了,当纤维素上的羟基与水结合后便形成了液液-液分液分配色谱配色谱的的固定相。固定相。纸色谱的流动相:纸色谱的流动相:即:展开剂即:展开剂 纸色谱动画纸色谱动画移动的动力:移动的动力:毛细作用。毛细作用。2.2.平面液相色谱仪的分离原理平面液相色谱仪的分离原理一平面液相色谱分类与分离原理一平面液相色谱分类与分离原理薄层色谱的载体:薄层色谱的载体:吸附材料(硅胶、氧化铝、纤维素等)均匀固化在载吸附材料(硅胶、氧化铝、纤维素等)均匀固化在载板(如:玻璃)上,形成液板(如:玻璃)上,
4、形成液-固吸附色谱的固定相。固吸附色谱的固定相。薄层色谱的流动相:薄层色谱的流动相:即:展开剂即:展开剂 薄层色谱动画薄层色谱动画1 1、2 2移动的动力:移动的动力:吸附剂颗粒间隙的毛细作用吸附剂颗粒间隙的毛细作用。2.2.平面液相色谱仪的分离原理平面液相色谱仪的分离原理一一 平面液相色谱分类与分离原平面液相色谱分类与分离原理理薄层电泳的载体:薄层电泳的载体:点有样品(蛋白质、核苷酸、多肽、糖类等)的惰性点有样品(蛋白质、核苷酸、多肽、糖类等)的惰性支持介质(纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝支持介质(纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等)。胶等)。薄层电泳的介质:薄层电泳的介
5、质:电解质溶液电解质溶液 薄层电泳动画薄层电泳动画1 1、2 2移动的动力:移动的动力:外加电场外加电场。1.1.比移值比移值 R Rf f二二 技术参数与基本流程技术参数与基本流程 用来表征斑点位置的基本参数是保留因子,通常用来表征斑点位置的基本参数是保留因子,通常称作称作比移值比移值,用,用R Rf f表示。表示。R Rf f=Ls/LLs/L。原原点点S SR RWWLsLsL L。LrLr原原点点参参比比样品样品前前沿沿同一物质在不同展开方式中得到的比移值是不相同的。同一物质在不同展开方式中得到的比移值是不相同的。2.2.高比移值高比移值 hRhRf f二二 技术参数与基本流程技术参数
6、与基本流程hRhRf f=100 R=100 Rf f3.3.相对比移值相对比移值 R Risis R Rf f 测量中一个重要的误差来源是难以确定溶剂前沿测量中一个重要的误差来源是难以确定溶剂前沿的位置,重现性较差,因此,引入相对比移值(的位置,重现性较差,因此,引入相对比移值(R R is is)。)。R R is is=R Rfs fs/R/Rfi fi =L Ls s/L/Lr r原原点点S SR RWWLsLsL L。LrLr原原点点参参比比样品样品前前沿沿二二 技术参数与基本流程技术参数与基本流程3.3.相对比移值相对比移值 R Risis 比移值应该是组分的定比移值应该是组分的定
7、性技术参数,但事实上影响性技术参数,但事实上影响平面色谱的因素很多,只有平面色谱的因素很多,只有在已知对照品随行(同时展在已知对照品随行(同时展开),并且不止一种展开剂开),并且不止一种展开剂进行展开后,被分离组分的进行展开后,被分离组分的比移值与对照品完全一致时,比移值与对照品完全一致时,才可作为定性指标之一。才可作为定性指标之一。R R is is 相对较为稳定,重相对较为稳定,重复性和可比性均优于复性和可比性均优于R R f f。4.4.平面色谱的基本流程平面色谱的基本流程二二 技术参数与基本流程技术参数与基本流程1 1)基本材料及设备)基本材料及设备 滤纸及薄层板:滤纸及薄层板:色谱用
8、纸;自制薄层板;预制板。色谱用纸;自制薄层板;预制板。涂布器:涂布器:自制薄层板需要用涂布器将固定相在玻璃自制薄层板需要用涂布器将固定相在玻璃板上涂成符合厚度要求的均匀薄层,有手工、半自动、板上涂成符合厚度要求的均匀薄层,有手工、半自动、全自动涂布器。全自动涂布器。点样器点样器:普通毛细管;微量注射器;微量定量毛细:普通毛细管;微量注射器;微量定量毛细管。管。展开室:展开室:纸色谱展开室和薄层色谱展开室纸色谱展开室和薄层色谱展开室 显色器:显色器:薄层扫描仪:薄层扫描仪:定性及定量分析用。定性及定量分析用。4.4.平面色谱的基本流程平面色谱的基本流程二二 技术参数与基本流程技术参数与基本流程1
9、 1)基本材料及设备)基本材料及设备 4.4.平面色谱的基本流程平面色谱的基本流程二二 技术参数与基本流程技术参数与基本流程2 2)纸色谱和薄层色谱操作步骤)纸色谱和薄层色谱操作步骤 薄层色谱动画薄层色谱动画二二 技术参数与基本流程技术参数与基本流程a.a.层析纸和层析板层析纸和层析板 特制的色层滤纸是按需要剪裁成的长条形(或筒型)特制的色层滤纸是按需要剪裁成的长条形(或筒型)定性滤纸。定性滤纸。层析板是用专门的涂布器把浆状的吸附剂(硅胶或氧层析板是用专门的涂布器把浆状的吸附剂(硅胶或氧化铝,化铝,200200250250目)均匀地涂在长条形玻璃板上(厚度目)均匀地涂在长条形玻璃板上(厚度0.
10、150.150.5 mm0.5 mm)。干燥后即可使用。)。干燥后即可使用。4.4.平面色谱的基本流程平面色谱的基本流程二二 技术参数与基本流程技术参数与基本流程b.b.展开剂展开剂 由一种或多种溶剂按一定比例组成。如用纸层析分离由一种或多种溶剂按一定比例组成。如用纸层析分离氨基酸时,常用的展开剂组成和配比为:正丁醇:乙酸:氨基酸时,常用的展开剂组成和配比为:正丁醇:乙酸:水水 =4=4:1 1:1 1。4.4.平面色谱的基本流程平面色谱的基本流程二二 技术参数与基本流程技术参数与基本流程c.c.点样点样 用微量注射器或玻璃毛细管吸取一定量试样点在原点用微量注射器或玻璃毛细管吸取一定量试样点在
11、原点上。试样点的直径一般应小于上。试样点的直径一般应小于5mm5mm。可并排点多个试样同。可并排点多个试样同时展开。时展开。4.4.平面色谱的基本流程平面色谱的基本流程二二 技术参数与基本流程技术参数与基本流程d.d.展开、显色、检测展开、显色、检测 有些组份在紫外光照射下产生荧光,可在紫外灯下用有些组份在紫外光照射下产生荧光,可在紫外灯下用铅笔将组份斑点描绘出来。常用的显色方法有喷洒显色剂、铅笔将组份斑点描绘出来。常用的显色方法有喷洒显色剂、碘蒸气熏或氨水熏等。碘蒸气熏或氨水熏等。4.4.平面色谱的基本流程平面色谱的基本流程5.5.特点与应用特点与应用二二 技术参数与基本流程技术参数与基本流
12、程特点:特点:平板色谱简单、方便、操作费用低,可以在一块层析平板色谱简单、方便、操作费用低,可以在一块层析板上同时展开多个试样及将多条滤纸同时展开。板上同时展开多个试样及将多条滤纸同时展开。采用方形薄层板还可以方便的进行二维展开,即按一采用方形薄层板还可以方便的进行二维展开,即按一般方法展开后,改变方向和展开剂再次展开,进一步改善般方法展开后,改变方向和展开剂再次展开,进一步改善分离效果。分离效果。试样一般不需要经过预处理即可分离。试样一般不需要经过预处理即可分离。5.5.特点与应用特点与应用二二 技术参数与基本流程技术参数与基本流程缺点:缺点:重复性差,分离效率较低,不适用挥发性试样分离。重
13、复性差,分离效率较低,不适用挥发性试样分离。定性定量不便。定性定量不便。应用:应用:平板色谱法在染料、农药、医药、有机酸碱类化合物、平板色谱法在染料、农药、医药、有机酸碱类化合物、糖类化合物、氨基酸、蛋白质及中草药中有效成分的分离糖类化合物、氨基酸、蛋白质及中草药中有效成分的分离分析中经常被使用。也可以用于无机离子的分离。还经常分析中经常被使用。也可以用于无机离子的分离。还经常作为高效液相色谱的一种预试方法。作为高效液相色谱的一种预试方法。5.5.特点与应用特点与应用二二 技术参数与基本流程技术参数与基本流程应用:应用:杂质检查杂质检查方法:方法:杂质对照品法(杂质对照品法(A A)、供试品自
14、身对照法(高低浓)、供试品自身对照法(高低浓度法)(度法)(B B)、对照物质法()、对照物质法(C C)样样 对对 样样 对对 样样 对对A B C三三 薄层色谱薄层色谱1.1.概念与原理概念与原理三三 薄层色谱薄层色谱 将固定相(吸附剂或载将固定相(吸附剂或载体)涂布成一均匀薄层,点体)涂布成一均匀薄层,点样,(密闭的容器中)展开,样,(密闭的容器中)展开,斑点显色,(与对照物质)斑点显色,(与对照物质)比较进行定性和定量分析。比较进行定性和定量分析。原理:原理:组分在薄层板上组分在薄层板上多次吸附、解吸附、再吸附、多次吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的过程。通过吸附再解吸附的过程。通过吸附
15、系数不等实现组分的分离。系数不等实现组分的分离。2.2.载板载板三三 薄层色谱薄层色谱 载板是支持吸附剂的材料。载板是支持吸附剂的材料。要求:要求:光滑平整耐腐蚀,洗净后不附水珠,常用玻璃板光滑平整耐腐蚀,洗净后不附水珠,常用玻璃板 预制板有:铝和塑料预制板有:铝和塑料 扫描用:长度为扫描用:长度为1010、1515、20cm20cm,宽度,宽度5 5、1010、20cm20cm3.3.吸附剂吸附剂硅胶、改性硅胶硅胶、改性硅胶为使用最广泛的薄层材料为使用最广泛的薄层材料 氧化铝氧化铝有碱性、中性、酸性有碱性、中性、酸性 硅藻土硅藻土为化学中性吸附剂为化学中性吸附剂 纤维素纤维素、改性纤维素、改
16、性纤维素多糖类多糖类 聚酰胺聚酰胺为特殊类型有机薄层材料,对能形成氢键物为特殊类型有机薄层材料,对能形成氢键物 质有特别的选择性。质有特别的选择性。4.4.添加剂和粘合剂添加剂和粘合剂三三 薄层色谱薄层色谱 (1 1)添加剂)添加剂:荧光指示剂:荧光指示剂:在在254nm254nm紫外光下发蓝色荧光的有钠荧紫外光下发蓝色荧光的有钠荧光素、硫化镉、阴极绿等。在光素、硫化镉、阴极绿等。在366nm366nm有荧光的指示剂如彩有荧光的指示剂如彩蓝等。蓝等。(2 2)粘合剂:)粘合剂:无机黏结剂:无机黏结剂:煅煅石膏(硫酸钙),无机黏结剂的优点石膏(硫酸钙),无机黏结剂的优点是:耐高温,耐酸碱,但涂铺
17、薄板动作要快,否则匀浆易是:耐高温,耐酸碱,但涂铺薄板动作要快,否则匀浆易凝固。薄层强度差。凝固。薄层强度差。有机黏结剂:羧甲基纤维素钠、淀粉、聚乙烯醇、高有机黏结剂:羧甲基纤维素钠、淀粉、聚乙烯醇、高分子聚合物等。其特点是薄层强度高、使用方便,但不能分子聚合物等。其特点是薄层强度高、使用方便,但不能用浓硫酸作显色剂。用浓硫酸作显色剂。5.5.硅胶板常用符号硅胶板常用符号三三 薄层色谱薄层色谱 G G以石膏作粘合剂;以石膏作粘合剂;H H 没有黏结剂;没有黏结剂;P P制制备用;备用;WW水可湿性的;水可湿性的;F F254254,F F366366荧光指示剂激发荧光指示剂激发波长;波长;F
18、F254s254s抗酸性荧光指示剂;抗酸性荧光指示剂;4040,6060平均孔径;平均孔径;RPRP反相;反相;RP-8RP-8,RP-18RP-18C C8 8,C C1818烷基改性;烷基改性;CHIRCHIR手性固定相。手性固定相。如:如:GFGF254254:为用石膏作粘合剂,:为用石膏作粘合剂,254nm254nm荧光硅胶荧光硅胶板。板。6.6.薄层板的制作与活化薄层板的制作与活化三三 薄层色谱薄层色谱 薄层板涂铺要求:薄层板涂铺要求:均匀、平整、无气泡引起的凹坑均匀、平整、无气泡引起的凹坑和龟裂,厚度和龟裂,厚度0.2-0.3 mm0.2-0.3 mm。例:硅胶板(粒度。例:硅胶板
19、(粒度10 10 40 40 umum)硅胶硅胶G G将硅胶置研钵中,加入少量水,研磨均将硅胶置研钵中,加入少量水,研磨均匀,至无结块和气泡,再加入比例量的水匀,至无结块和气泡,再加入比例量的水(硅胶硅胶HH水一水一般为般为13)13),迅速研磨均匀,立即涂铺(硅胶,迅速研磨均匀,立即涂铺(硅胶HH水水=1212;氧化铝;氧化铝水水=11.5-2=11.5-2)。)。硅胶或硅胶硅胶或硅胶G G 以以CMCCMC为黏合剂。配制为黏合剂。配制0.2%0.2%0.7%CMC0.7%CMC水溶液,放置过夜,使悬浮的纤维沉降,取水溶液,放置过夜,使悬浮的纤维沉降,取上层用来配制吸附剂匀浆。上层用来配制吸
20、附剂匀浆。6.6.薄层板的制作与活化薄层板的制作与活化三三 薄层色谱薄层色谱 反相薄层板反相薄层板以不同链长的正构烷烃为固定液以不同链长的正构烷烃为固定液,配制成适当浓度的溶液配制成适当浓度的溶液(如:如:5%5%硅酮油乙醚溶液硅酮油乙醚溶液),),浸渍浸渍硅胶板。硅胶板。薄层板活化薄层板活化涂布后的薄层先在室温下阴干,在涂布后的薄层先在室温下阴干,在使用前置适当温度烘烤一定时间进行活化,然后置干燥使用前置适当温度烘烤一定时间进行活化,然后置干燥器中备用。器中备用。不同薄层活化条件略有不同,如:不同薄层活化条件略有不同,如:硅硅 胶胶 110 1 h110 1 h 氧化铝氧化铝 110 30
21、min110 30 min 薄层板的涂布薄层板的涂布7.7.展开剂(流动相)展开剂(流动相)三三 薄层色谱薄层色谱(1 1)对展开剂的要求:)对展开剂的要求:能够溶解待测组分能够溶解待测组分 能使待测组分与杂质分开能使待测组分与杂质分开 使待测组分使待测组分R Rf f值在值在0.20.20.80.8 不能与组分及吸附剂发生化学反应不能与组分及吸附剂发生化学反应 展开后斑点圆而集中。展开后斑点圆而集中。(2 2)展开剂)展开剂 极性强的溶剂洗脱能力强。常用溶剂的极性强弱顺极性强的溶剂洗脱能力强。常用溶剂的极性强弱顺序:水酸吡啶甲醇乙醇正丙醇丙酮乙酸序:水酸吡啶甲醇乙醇正丙醇丙酮乙酸乙酯二氯甲烷
22、甲苯苯三氯乙烷四氯化碳乙酯二氯甲烷甲苯苯三氯乙烷四氯化碳 环己烷环己烷 石油醚。石油醚。7.7.展开剂(流动相)展开剂(流动相)三三 薄层色谱薄层色谱(2 2)展开剂)展开剂 在硅胶吸附薄层上,展开时,往往先用单一的低极在硅胶吸附薄层上,展开时,往往先用单一的低极性溶剂展开,然后再按溶剂洗脱顺序依次更换极性较大性溶剂展开,然后再按溶剂洗脱顺序依次更换极性较大的溶剂进行试验。若的溶剂进行试验。若R Rf f 值太小,则加入一定量极性强的值太小,则加入一定量极性强的溶剂,如乙醇、丙酮等;如果溶剂,如乙醇、丙酮等;如果R Rf f 值太大,则加入适量极值太大,则加入适量极性弱的溶剂(如:环己烷、石油
23、醚等),以降低极性。性弱的溶剂(如:环己烷、石油醚等),以降低极性。可加入一定比例的酸或碱,使斑点集中。可加入一定比例的酸或碱,使斑点集中。当用单一溶剂不能分离时,可用两种以上的多元展当用单一溶剂不能分离时,可用两种以上的多元展开剂,并不断改变多元展开剂的组成和比例。开剂,并不断改变多元展开剂的组成和比例。7.7.展开剂(流动相)展开剂(流动相)三三 薄层色谱薄层色谱(3 3)选择展开剂的点滴试验法)选择展开剂的点滴试验法 将要被分离的物质的溶液间隔地点在薄层将要被分离的物质的溶液间隔地点在薄层板上,待溶剂挥发干后,用吸满不同展开剂的板上,待溶剂挥发干后,用吸满不同展开剂的毛细管点到不同样品点
24、的中心,借毛细作用,毛细管点到不同样品点的中心,借毛细作用,展开剂从圆心向外扩展,这样就出现了不同的展开剂从圆心向外扩展,这样就出现了不同的圆心色谱,经过比较可以找到最合适的展开剂圆心色谱,经过比较可以找到最合适的展开剂及吸附剂。及吸附剂。7.7.展开剂(流动相)展开剂(流动相)三三 薄层色谱薄层色谱(3 3)选择展开剂)选择展开剂 选择何种极性的展开剂,必须考虑分离物质的极性及选择何种极性的展开剂,必须考虑分离物质的极性及吸附剂的活性,也就是说,要考虑被分离物质的极性、吸吸附剂的活性,也就是说,要考虑被分离物质的极性、吸附剂的活性及附剂的活性及展开剂的极性这三者之间的关系。展开剂的极性这三者
25、之间的关系。非极性非极性极性活性极性被分离物质吸附剂展开剂BA例如:非极性物质例如:非极性物质B B,选用吸附剂的活性为选用吸附剂的活性为级,展开剂应为级,展开剂应为非极性的。非极性的。8.8.点样点样三三 薄层色谱薄层色谱样品溶液的制备:样品溶液的制备:纯品的溶解纯品的溶解(用于对照定性):将纯品直接溶于(用于对照定性):将纯品直接溶于单一或混合溶剂中,并稀释至一定浓度即可点样;单一或混合溶剂中,并稀释至一定浓度即可点样;样品的提取及净化样品的提取及净化:对生物样品(动植物组织、:对生物样品(动植物组织、体液等)中某些成分的分离测定时,首先要将样品中体液等)中某些成分的分离测定时,首先要将样
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