（推荐PPT）荧光定量原理及其应用课件.ppt

1、长度30-45bp,Tm比引物至少高5。实时荧光定量PCR的基本原理优点：通用性好，价格低，在科研中使用较普遍。在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR 荧光染料，SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。实时荧光定量PCR的基本原理5端不要有G，G会有淬灭作用，影响定量。缺点：PCR反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，通常本底较高，引起假阳性。其中最主要的应用集中在以下几个方面：荧光背景信号阶段：为扩增最初的1015个循环，扩增的荧光信号被荧光背景信号

2、所掩盖，我们无法判断产物量的变化。TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的 5 末端，而淬灭剂则在 3 末端。DNA 或 RNA 的绝对定量分析：包括 病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi基因失活率的检测等。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与 3 端的淬灭剂接近而被淬灭。基因表达差异分析:例如比较 经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等)，特定基因在不同时相的表达差异以及 cDNA 芯片或差显结果的确证.目前 实时荧光 PCR 技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领

3、域。SYBR Green I 工作原理实时荧光定量PCR的应用TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的 5 末端，而淬灭剂则在 3 末端。SYBR Green I 工作原理DNA 或 RNA 的绝对定量分析：包括 病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi基因失活率的检测等。当存在模板时，环序列将与模板配对，此时分子信标成链状而非茎环状，荧光基团与淬灭剂分开，使得荧光基团发出荧光。其他定量方法优点：通用性好，价格低，在科研中使用较普遍。引物的Tm值应相似，差异不超过12.荧光扩增曲线 分为三个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。SY

4、BR Green I 工作原理在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR 荧光染料，SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。水解探针模式（Taqman）利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中纵坐标代表起始拷贝数的对数，横坐标代表 Ct 值。长度30-45bp,Tm比引物至少高5。Taqman探针设计原则G+C含量为4060%。当存在模板时，环序列将与模板配对，此时分子信标成链状而非茎环状，荧光基团与淬灭剂分开，使得荧光基团发出荧光。实时荧光定量PCR的应用

5、Taqman探针设计原则长度30-45bp,Tm比引物至少高5。引物设计原则平台期：扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图.G+C含量为4060%。荧光阈值：是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。荧光扩增曲线 分为三个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。CT值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值。为了定量和比较的方便，引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT 值。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。荧光扩增曲线 分为三个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。实时荧光定量PCR的基本原理每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图.感谢观看感谢观看