多重不对称扩增介绍-PPT课件.ppt
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1、多重不对称PCR 黄桃生(生物芯片组)多重不对称PCR多重PCR(Multiplex PCR)不对称PCR(Asymmetric PCR)获得大量不同片段的单链DNA(SSDNA)多重PCR又称多重引物PCR或复合PCR,它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物,同时扩增出多个核酸片段的PCR反应,其反应原理,反应试剂和操作过程与一般PCR相同.1、扩增单一基因中多个片段(华法林检测)2、扩增不同基因中多个片段(HPV分型)多重PCR技术优点高效性高效性:在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物,或对有多个型别的目的基因进行分型,特别是用一滴血就可检测多种病原体。系统性系统性:多重PCR很
2、适宜于成组病原体的检测,如肝炎病毒,肠道致病性细菌,性病,无芽胞厌氧菌等同时检测。经济简便性经济简便性:多种病原体在同一反应管内同时检出,将大大的节省时间,节省试剂,节约经费开支,为临床提供更多更准确的诊断信息。多重PCR技术难点反应原理,反应试剂和操作过程与一般PCR相同.难点主要体现在前期引物设计过程中反应体系的平衡 反应体系不平衡反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增,获得大量的扩增产物,而这些扩增产物同时又是DNA聚合酶的良好抑制剂(SantaLucia,2019)。所以,随着扩增产物的大量出现,聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制住了,因此,前期处于劣势的引
3、物及其模板,这时就更加举步维艰,最终导致扩增产物量非常之小,以至于无法检测。正所谓强者更强、弱者更弱。导致不平衡的原因:1、引物特异性;2、最佳退火温度不一致;3、引物二聚体;4、模板量不同;5、引物扩增效率引物特异性如果引物与体系中其他非目的基因片段结合能力更强,那么目的基因结合引物的能力就会受到竞争,从而导致扩增效率下降。严格blast验证最佳退火温度不一致将多对引物放置入一个体系中扩增,由于进行PCR反应的退火温度相同,所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。前期引物设计时减少最佳退火温度的差异,最佳退火温度的差异不超过35为宜。引物二聚体包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构,还
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