成骨细胞的培养及骨折模型的制作课件.ppt
- 【下载声明】
1. 本站全部试题类文档,若标题没写含答案,则无答案;标题注明含答案的文档,主观题也可能无答案。请谨慎下单,一旦售出,不予退换。
2. 本站全部PPT文档均不含视频和音频,PPT中出现的音频或视频标识(或文字)仅表示流程,实际无音频或视频文件。请谨慎下单,一旦售出,不予退换。
3. 本页资料《成骨细胞的培养及骨折模型的制作课件.ppt》由用户(三亚风情)主动上传,其收益全归该用户。163文库仅提供信息存储空间,仅对该用户上传内容的表现方式做保护处理,对上传内容本身不做任何修改或编辑。 若此文所含内容侵犯了您的版权或隐私,请立即通知163文库(点击联系客服),我们立即给予删除!
4. 请根据预览情况,自愿下载本文。本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。
5. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007及以上版本和PDF阅读器,压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 细胞 培养 骨折 模型 制作 课件
- 资源描述:
-
1、成骨细胞的培养及骨折模型的制作成骨细胞的培养及骨折模型的制作l成骨细胞的培养可广泛应用于骨折及骨损伤的疾病研究中,同时为筛选新型药物和研究机制提供离体研究。l原代培养原代培养l细胞株细胞株 成骨细胞的培养及检测成骨细胞的培养及检测 原代培养原代培养l 成骨细胞的来源国内外文献报道新生动物的颅骨或胚胎颅骨为成骨细胞的常用来源。l 有不少学者尝试用新生大鼠的颅骨分离成骨细胞,结果表明所培养的成骨细胞具有典型的成骨细胞的形态特征、生物学活性及发生钙化的功能。l 有学者研究兔盖骨的成骨细胞增殖代谢及钙化的能力发现,来自兔盖骨的成骨细胞具有较高的增殖能力,但碱性磷酸酶的生成较低,而且兔盖骨来源的成骨细胞
2、在体外培养中可以形成有序的钙化结节和羟基磷灰石(HA)结晶。小鼠原代培养小鼠原代培养1.取新生取新生3d以内以内BALB/c小鼠,断颈处死后立即投入小鼠,断颈处死后立即投入75%酒精酒精中消毒中消毒5min。2.D-Hanks液漂洗后分离颅盖骨,刮除骨膜和结缔组织,液漂洗后分离颅盖骨,刮除骨膜和结缔组织,DMEM清洗颅骨骨片并剪碎清洗颅骨骨片并剪碎3.加入加入0.25%胰蛋白酶(含胰蛋白酶(含0.02EDTA),),37恒温消化恒温消化20min,吸出消化液,之后吸出消化液,之后1mg/1mlI型胶原酶型胶原酶37恒温消化恒温消化20min后离后离心(心(1000r/min,5min),弃上清
3、液),弃上清液4.加入含加入含15%血清的血清的DMEN培养基,吹打骨片(力气不要过大,培养基,吹打骨片(力气不要过大,但要吹打次数多一下,尽量使细胞从松解得骨片上脱落),将但要吹打次数多一下,尽量使细胞从松解得骨片上脱落),将细胞悬液接种于培养瓶中,置于细胞悬液接种于培养瓶中,置于37 CO2恒温孵育箱中培养恒温孵育箱中培养。传代培养步骤传代培养步骤1.弃除旧的培养液(可以吸,可以倒,倒的时候小心)弃除旧的培养液(可以吸,可以倒,倒的时候小心)2.用用PBS冲洗一遍(加冲洗一遍(加PBS清洗或换液时,不要将细胞冲刷下来)清洗或换液时,不要将细胞冲刷下来)3.用用0.25%的胰酶消化液消化的胰
4、酶消化液消化30-45s,在显微镜下观察,细部变圆,在显微镜下观察,细部变圆,间距增大时,可用手拍打瓶侧壁与底壁,会发现细胞很快悬浮。间距增大时,可用手拍打瓶侧壁与底壁,会发现细胞很快悬浮。4.加入含加入含15%的牛血清培养液终止消化的牛血清培养液终止消化5.用吸管反复细心吹打瓶底,置离心管中后,可以用用吸管反复细心吹打瓶底,置离心管中后,可以用PBS或或D-HANKS再吹打,可以反复几次,目的是将细胞尽可能的洗刷干净再吹打,可以反复几次,目的是将细胞尽可能的洗刷干净6.离心离心 大鼠成骨细胞的培养大鼠成骨细胞的培养l 将将SD SD 乳鼠置入乳鼠置入75%75%酒精中浸泡酒精中浸泡5min5
5、min。于超净。于超净 台台上取顶骨上取顶骨,放入放入PBS PBS 皿中皿中,刮除附着组织刮除附着组织,待骨质发待骨质发 白、透亮白、透亮,再放入再放入PBS PBS 小瓶反复冲洗小瓶反复冲洗,换液换液3 3 次次,以以0.1%II0.1%II型胶原酶消化型胶原酶消化30min 30min 后吸弃酶液后吸弃酶液,再以再以PBS PBS 冲洗冲洗3 3 次次 ,加入,加入0.1%II0.1%II型胶原酶型胶原酶,将骨剪成将骨剪成1mm2 1mm2 大小大小,放置放置15min 15min 后加入与酶液等量的含后加入与酶液等量的含15 15%小牛血清的小牛血清的DMEM DMEM 培养基培养基,
6、吸取上清液吸取上清液,以以1 000r/1 000r/min min 离心离心10min,10min,将下层液接种于将下层液接种于50ml 50ml 培养瓶培养瓶,离离心液去上清后接种于心液去上清后接种于25ml 25ml 培养瓶培养瓶,分别加入上述分别加入上述培养基培养基,置入置入37 37、5%CO2 5%CO2、饱和湿度培养箱内。、饱和湿度培养箱内。每每2 2 日换液日换液1 1 次次,待细胞长满后待细胞长满后,用用0.25%0.25%胰蛋白胰蛋白酶消化酶消化,按按12 12 比例传代。比例传代。l 1.1.成骨细胞的取材:成骨细胞的取材:新生新生SDSD大鼠的乳鼠大鼠的乳鼠 新生新生2
7、4h-72h24h-72h的乳鼠的乳鼠l 2.2.将去除血管及结缔组织的骨片放置在将去除血管及结缔组织的骨片放置在1mlPBS1mlPBS液体中(液体中(PBSPBS不要放太不要放太多,否则延长剪碎时间),用剪刀剪成多,否则延长剪碎时间),用剪刀剪成1 1*1mm1mm的组织快,越小越好(的组织快,越小越好(越小越能消化完全),一只乳鼠的头盖骨加胰酶越小越能消化完全),一只乳鼠的头盖骨加胰酶2ml2ml,3737水浴中消水浴中消化化30min30min(目的是消化掉附着骨片上的结缔组织),离心去酶,加入(目的是消化掉附着骨片上的结缔组织),离心去酶,加入2ml2ml胶原酶胶原酶2 2,水浴中继
8、续消化,水浴中继续消化1h1h(中间间隔晃动,使消化下来的胶原(中间间隔晃动,使消化下来的胶原离开团块溶于液体中)。如此消化下来的混悬液可能比较稠,可以加离开团块溶于液体中)。如此消化下来的混悬液可能比较稠,可以加适量的适量的PBSPBS,尽量让胶原溶于液体中,否则不利于离心细胞沉降到离,尽量让胶原溶于液体中,否则不利于离心细胞沉降到离心管的底壁。心管的底壁。l 3.3.培养基问题:低糖的培养基问题:低糖的DMEMDMEM培养基培养基 4.4.培养瓶培养瓶 培养瓶在接种前,使用培养瓶在接种前,使用1%1%多聚赖氨酸快速包被(具体方多聚赖氨酸快速包被(具体方法:每个法:每个50ml50ml培养瓶
9、加培养瓶加3-4ml1%3-4ml1%多聚赖氨酸,尽量是底壁均铺满液体多聚赖氨酸,尽量是底壁均铺满液体,拧上盖子,放置,拧上盖子,放置30min30min,倒掉,倒掉1%1%多聚赖氨酸液体,用去离子水或多聚赖氨酸液体,用去离子水或PBSPBS液冲洗两遍),液冲洗两遍),包被的培养瓶,细胞很容易贴壁包被的培养瓶,细胞很容易贴壁 。注意问题注意问题大鼠成骨细胞成骨细胞的鉴定成骨细胞的鉴定形态学观察形态学观察碱性磷酸酶染色碱性磷酸酶染色(alkaline(alkaline phosphatasephosphatase,ALP)ALP)钙化结节染色钙化结节染色 细胞株细胞株 lMC3T3-E1(小鼠胚
展开阅读全文