蛋白质组学proteomicswxj课件.ppt

1、ProteomicsProteomics 蛋白质组学蛋白质组学博学至精博学至精 明德至善明德至善Proteome&Proteomics 定义定义nProteome：n1994年，由澳大利亚年，由澳大利亚Macguarie大学的大学的Wilkins等等首先提出：首先提出：“蛋白质组指蛋白质组指由一个细胞或一个组织由一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部蛋白质的基因组所表达的全部蛋白质”n“proteome”是由蛋白质一词的前几个字母是由蛋白质一词的前几个字母“prote”和基因组一词的后几个字母和基因组一词的后几个字母“ome”拼接拼接而成而成博学至精博学至精 明德至善明德至善Proteome&

2、Proteomics 定义定义nProteomics：n蛋白质组学是从整体水平细胞内蛋白质的蛋白质组学是从整体水平细胞内蛋白质的组成组成、结构结构、功能功能及其及其动态变化规律动态变化规律的科学。的科学。n研究内容包括分析蛋白质组所有组分及它们的表研究内容包括分析蛋白质组所有组分及它们的表达水平，确定各种组分的空间定位、修饰方法、达水平，确定各种组分的空间定位、修饰方法、互作机制、生物活性及相应特定功能等。互作机制、生物活性及相应特定功能等。n由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识谢等过程的整体而全面的认识 博学至精博学至

3、精 明德至善明德至善Genome&Proteome博学至精博学至精 明德至善明德至善Genomics Transcriptomics&Proteomics博学至精博学至精 明德至善明德至善Proteomics&Structural Genomics博学至精博学至精 明德至善明德至善Proteomics&Functional Genomics博学至精博学至精 明德至善明德至善特点之一 整体性博学至精博学至精 明德至善明德至善特点之二 系统性博学至精博学至精 明德至善明德至善特点之三 动态性博学至精博学至精 明德至善明德至善nStructural Proteomics n结构蛋白质组学结构蛋白质组

4、学nFunctional Proteomics n功能蛋白质组学功能蛋白质组学 分类博学至精博学至精 明德至善明德至善Structural ProteomicsnSeparationnIdentificationnPTM(post-translational modification)IdentificationnComparison&Subtraction Analysis 博学至精博学至精 明德至善明德至善Functional Proteomics nLocalizationnProtein Complex DeterminationnProtein-Protein Interaction

5、/Interaction NetworknFunction of Protein(Metabolic and Regulatory Pathway;Signal Transduction Pathway)博学至精博学至精 明德至善明德至善n 蛋白质鉴定：可以利用一维电泳和二维电泳并结合生物质谱、Western印迹、蛋白质芯片等技术，对蛋白质进行全面的鉴定研究。n 翻译后修饰的鉴定：如磷酸化、糖基化、酶原激活等过程。n 蛋白质功能确定：包括蛋白质定位研究，蛋白质活性，蛋白质相互作用，酶活性和确定酶底物，细胞因子的生物分析，配基-受体结合分析等。蛋白质组学的主要任务蛋白质组学研究思路与方法蛋白质组

6、学研究思路与方法策略、技术、工具策略、技术、工具博学至精博学至精 明德至善明德至善主要专业术语及其英文对照和缩写主要专业术语及其英文对照和缩写nIPG-IEF：固相固相pH梯度等电聚焦（梯度等电聚焦（immobilized pH gradients isoelectric focusing）nSDS-PAGE：十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电聚丙烯酰胺凝胶电泳（泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）n2-DE：双向电泳双向电泳(Two Dimensional Electrophoresis)nHPL

7、C：高效液相色谱高效液相色谱（High performance Liquid Chromatography）nMALDI-TOF MS：基质辅助激光解吸电离飞行时：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（间质谱（Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry)博学至精博学至精 明德至善明德至善n蛋白序列数据库（SWISS-PROT/TrEMBL；http:/www.expasy.ch）n基因序列数据库（Genbank，http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/EMBL；http:/w

8、ww.ebi.ac.uk/）n蛋白模式数据库（Prosite；http:/www.expasy.ch/sprot/prosite.html）n蛋白质二维凝胶电泳数据库、蛋白三维结构数据库（PDB，http:/www.pdb.bnl.gov/；FSSP，http:/www.embl-ebi.ac.uk）n蛋白翻译后修饰数据库（O-GLYCBASE，http:/www.cbs.dtu.dk/databases/OGLYCBASE）蛋白质组学研究相关数据库蛋白质组学研究相关数据库博学至精博学至精 明德至善明德至善研究策略研究策略n两条互补的实验流程两条互补的实验流程n基于凝胶的工作流程基于凝胶的工作

9、流程（Gel-based workflow）n基于液相色谱的工作流程基于液相色谱的工作流程（LC-based workflow）博学至精博学至精 明德至善明德至善Classical GE&LC to Protein ID Gapelo(2010)J ProteomicsHPLC-MS博学至精博学至精 明德至善明德至善博学至精博学至精 明德至善明德至善v双向电泳（two dimensional gel electrophoresis,2D-GE）v差示电泳（differential gel electrophoresis,DIGE）v毛细管电泳 (capillary electrophoresi

10、s,CE)v高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)分子筛柱层析分子筛柱层析 反向柱层析反向柱层析v质谱分析(mass spectrometry MS)基质基质辅助激光解吸离子化辅助激光解吸离子化-飞行时间串联质谱飞行时间串联质谱(matrix-assisted laser disorption ionization-time of flight/tandem MS,MALDI-TOF/MS/MS)电喷雾离子化电喷雾离子化串联质谱串联质谱（electrospray ionization ESI-MS）v生物信息学博学至精博学至精 明

11、德至善明德至善蛋白质组学实验室所需的条件蛋白质组学实验室所需的条件博学至精博学至精 明德至善明德至善蛋白质组学研究的基本技术路线蛋白质组学研究的基本技术路线蛋白质样品的制备蛋白质样品的制备双向电泳或双向电泳或HPLC图像分析图像分析凝胶中的蛋白凝胶中的蛋白溶液中的蛋白溶液中的蛋白混合肽混合肽蛋白质质量蛋白质质量N端测序端测序肽序列质谱数据肽序列质谱数据肽指纹图肽指纹图数据搜索数据搜索新的或已知蛋白新的或已知蛋白翻译后修饰的鉴定翻译后修饰的鉴定酶解酶解博学至精博学至精 明德至善明德至善Sample Protein Preparation1.Usually the complexity of th

12、e protein and/or peptide mixture lies beyond the theoretical separation space of any separation method.2.Proteome Complexity.Genomic transcription in diversity;post-transcription processing;post-translational modification;constitution of combinatorial complex.3.It requires quite a long time for anal

13、ysis of protein complex.a)Sample recovery low through separation:more steps,less overall recovery.b)The conc.of the proteins with a range of 6-order magnitude:in tissues,protein concentrations span a dynamic range of six orders of magnitudes(for regulatory protein or TFs a few molecules per cell,for

14、 housekeeping proteins million copies per cell).So,it is difficult to detect very low concentrated proteins in the presence of highly abundant proteins.c)The complex protein samples with limited stability due to existence of enzymes and proteases,enzyme inhibitors can only partly stabilize the sampl

15、e.博学至精博学至精 明德至善明德至善4.Many parameters influence the composition of proteome between induced and inherent biological variations,such as genetic differences,gender and age of patients and cell growth conditions.This requires sample replicates.(statisticians would demand at least five replicates,in many

16、 cases three replicates can deliver highly confident results.In clinical the number of required proteins are much high).5.Membrane proteins are very difficult to solubilize,and easy to loss during sample preparation and separation by sticking to a surface or aggregation.6.Post-translational modifica

17、tions(PTMs)like phosphorylation and glycosylation require sophisticated analysis tools like MSn,where the peptide ions generated several times fragmented.Sample Protein Preparation博学至精博学至精 明德至善明德至善蛋白质组研究的基本技术蛋白质组研究的基本技术-样品预分离样品预分离n样品的制备（预处理）样品的制备（预处理）：n组织组织n细胞细胞n细胞器（线粒体、叶绿体、细胞核）细胞器（线粒体、叶绿体、细胞核）博学至精博

18、学至精 明德至善明德至善蛋白质组研究的基本技术蛋白质组研究的基本技术-蛋白提取蛋白提取n重要性：重要性：n在制备时丢失的蛋白永远不能在后面实验中弥补在制备时丢失的蛋白永远不能在后面实验中弥补n原则：原则：n使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态 n防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀 n防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）饰（如酶性或化学性降解等）n完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白 博学至精博学至精 明德至善明德

19、至善蛋白质组研究的基本技术蛋白质组研究的基本技术-蛋白提取蛋白提取n步骤：步骤：n破碎破碎n沉淀蛋白沉淀蛋白n去除杂质去除杂质博学至精博学至精 明德至善明德至善蛋白质组研究的基本技术蛋白质组研究的基本技术-蛋白提取蛋白提取n样品制备流程样品制备流程-破碎破碎尽可能减少蛋白水解尽可能减少蛋白水解/其它形式蛋白降解原则其它形式蛋白降解原则n机械法（超声波法、高压法机械法（超声波法、高压法、机械匀浆法、机械匀浆法）n化学法（去污剂法、酶裂解法化学法（去污剂法、酶裂解法）n物理法（液氮研磨法、反复冻融法、渗透物理法（液氮研磨法、反复冻融法、渗透法法、玻璃珠破碎法、玻璃珠破碎法）博学至精博学至精 明德至

20、善明德至善蛋白质组研究的基本技术蛋白质组研究的基本技术-蛋白提取蛋白提取n样品制备流程样品制备流程-沉淀蛋白沉淀蛋白 去杂浓缩后蛋白可溶性是关键去杂浓缩后蛋白可溶性是关键 n三氯醋酸（三氯醋酸（TCA）-丙酮沉淀法丙酮沉淀法 nTCA沉淀法沉淀法 引起降解引起降解/修饰修饰 n丙酮沉淀法丙酮沉淀法 n硫酸铵沉淀法硫酸铵沉淀法 影响影响IEFn醋酸铵沉淀法醋酸铵沉淀法 步骤繁琐步骤繁琐 博学至精博学至精 明德至善明德至善2D电泳结果影响因素分析电泳结果影响因素分析博学至精博学至精 明德至善明德至善蛋白质组研究的基本技术蛋白质组研究的基本技术-蛋白提取蛋白提取n样品制备流程样品制备流程-去除杂质去

21、除杂质 关键是尽量不丢失蛋白和减少蛋白修饰关键是尽量不丢失蛋白和减少蛋白修饰 n核酸的清除核酸的清除（DNase/RNase）n多糖的清除多糖的清除（超离心（超离心、TCA沉淀等）沉淀等）n去污剂的清除去污剂的清除（丙酮沉淀法等）（丙酮沉淀法等）n盐离子和外源带电小分子的清除（透析、盐离子和外源带电小分子的清除（透析、TCA-丙酮沉淀法）丙酮沉淀法）博学至精博学至精 明德至善明德至善2D电泳结果影响因素分析电泳结果影响因素分析可能原因：样品含高丰度可能原因：样品含高丰度Pr可能原因：可能原因：TCA残留致使残留致使Pr丢失丢失博学至精博学至精 明德至善明德至善蛋白质组研究的基本技术蛋白质组研究

22、的基本技术-蛋白提取蛋白提取n样品制备注意事项：样品制备注意事项：n蛋白质水解蛋白质水解-蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂(PMSF等等)n特殊样品的制备特殊样品的制备(低丰度低丰度、强碱性蛋白质、强碱性蛋白质（核糖体）、极端分子量（核糖体）、极端分子量)n样品定量样品定量 n重复性重复性博学至精博学至精 明德至善明德至善nTwo Dimensional Gel Electrophoresis(2D-GE)nDifferential Gel Electrophoresis(DIGE)Gel Electrophoresis博学至精博学至精 明德至善明德至善Workflow for Two-Dimensi

23、onal Electrophoresis(2-DE)GE(2004)2-D Electrophoresis 博学至精博学至精 明德至善明德至善two dimensional gel electrophoresis(2D-GE)博学至精博学至精 明德至善明德至善Isoelectric Focusing Electrophoresis(IEF)IEF mainly applied for the following purposes:n1st dimensional fractionation of protein mixtures in high-resolution 2-D electroph

24、oresis nPre-fractionation of protein mixtures according to chargenFor the separation of very heterogeneous mixtures of tryptic peptides instead of strong cation exchange chromatography in MDLC-MSIPG immobilized pH gradientIPG Strip for IEFpH10.0 Cathode(-)pH 3.0Anode(+)pH103博学至精博学至精 明德至善明德至善1.IEF is

25、 performed in a pH gradient gel.2.Proteins Charged with Anion(-)or Cation(+)depend on(i)their molecular traits due to their acidic and basic groups,and(ii)the environmental pH.3.Environmental pH:in basic buffer,the acidic groups of proteins with negative charge;in acidic buffer,the basic groups with

26、 positive charge.4.Protein Isoelectric Point(pI):At a pH value,the net charge of a protein is zero.39IEF Theoretical Background 博学至精博学至精 明德至善明德至善40The Principle of Isoelectric Focusing Electrophoresis博学至精博学至精 明德至善明德至善IEF Principle1.Ampholytes to Create A pH Gradient:A Heterogeneous Mixture of Isomer

27、s of aliphatic oligoamino-oligocarboxylic acids under electricity field could align themselves due to individual molecule trait&create a pH gradient along cathode with high-pH to anode with low-pH.2.Ampholyte Properties:(i)high buffering and solubility in its pI(ii)good and regular electric conducti

28、vity at its pI(iii)absence of biological effect(iv)low molecular weight3.The Ampholyte-Gel:the ampholyte 2%(w/v),the gel 4%(T)&3%(C)4.Immobile pH Gradient Strip for Proteins Separation(IPG):(i)proteins applied to a position on the IPG strip could be charged with anion,cation and zero(ii)protein-cati

29、on moves forward cathode and stop the site where the pH value is equal to the pI of protein-cation;similarity for protein-anion to move forward anode and stop;protein-zero to be naive to move.41博学至精博学至精 明德至善明德至善42Immobilized pH Gradient PolyacrylamideThe General Structure of Immobiline(Ampholyte)博学至

30、精博学至精 明德至善明德至善博学至精博学至精 明德至善明德至善双向凝胶电泳（双向凝胶电泳（2-DE）n是是等电聚焦电泳等电聚焦电泳和和SDS-PAGE的组合的组合n即先进行等电聚焦电泳（按照即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离）分离）n然后再进行然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小）（按照分子大小）n凝胶经染色得到二维分布的蛋白质图凝胶经染色得到二维分布的蛋白质图 博学至精博学至精 明德至善明德至善蛋白质组研究的基本技术蛋白质组研究的基本技术n2D-SDS-PAGE：n样品制备样品制备n第一向第一向IPG-IEF电泳电泳nIPG平衡平衡n第二向第二向SDS-PAGE电泳电泳n染色（银染）及染

31、色（银染）及 图谱分析图谱分析n目标蛋白获取及其鉴定（目标蛋白获取及其鉴定（MC分析）分析）博学至精博学至精 明德至善明德至善博学至精博学至精 明德至善明德至善2-DEn第一向第一向IPG-IEF电泳nIEF是一种根据样品的是一种根据样品的等电点不同等电点不同而使它而使它们在们在pH梯度中相互分离的一种电泳技术梯度中相互分离的一种电泳技术n将等电点不同的蛋白质混合物加入有将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的的pH位置上，形成分离的蛋白质区带位置上

32、，形成分离的蛋白质区带n从而得知其等电点信息从而得知其等电点信息博学至精博学至精 明德至善明德至善IPG-IEF电泳电泳博学至精博学至精 明德至善明德至善2-DEn第二向垂直第二向垂直SDS-PAGE电泳电泳n聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有浓缩聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应效应、电荷效应、分子筛效应。SDS与蛋与蛋白质形成雪茄状带负电荷复合物，从而消白质形成雪茄状带负电荷复合物，从而消除了蛋白间的电荷及形状差异，除了蛋白间的电荷及形状差异，电泳速度电泳速度仅与分子量有关仅与分子量有关 n从而得知其分子量信息从而得知其分子量信息博学至精博学至精 明德至善明德至善

33、第二向垂直第二向垂直SDS-PAGE电泳电泳n凝胶浓度与其对应的分离范围凝胶浓度与其对应的分离范围胶浓度胶浓度 分离范围分离范围(KD)5%36-200 7.5%24-200 10%14-200 12.5%14-100 15%14-60博学至精博学至精 明德至善明德至善第二向垂直第二向垂直SDS-PAGE电泳电泳Ettan Dalt twelve电泳系统电泳系统博学至精博学至精 明德至善明德至善第二向垂直第二向垂直SDS-PAGE电泳电泳Ettan Dalt six电泳系统电泳系统博学至精博学至精 明德至善明德至善2-DE 凝胶蛋白质斑点的检测凝胶蛋白质斑点的检测n染色：染色：1）考马斯亮兰染

34、色法；）考马斯亮兰染色法；2）银染法；）银染法；3）负染法；）负染法；4）荧光染色法；）荧光染色法；5）放射性同位素标记法等）放射性同位素标记法等博学至精博学至精 明德至善明德至善n安全（安全（safety）n灵敏（灵敏（sensitivity）n简单（简单（simplicity）n特异性（特异性（specificity）n快速（快速（speed）n稳定（稳定（stability）n兼容性（兼容性（synergy）理想显色剂的7S博学至精博学至精 明德至善明德至善有机染料和银染n考马斯亮蓝考马斯亮蓝染色灵敏度为染色灵敏度为30100ng30100ng，线性范围是，线性范围是2020倍；倍；硝酸

35、银染色硝酸银染色的线性范围是的线性范围是4040倍，灵敏度是考染的倍，灵敏度是考染的100100倍。倍。n胶体考马斯亮蓝胶体考马斯亮蓝染色技术可实现染色技术可实现PAGEPAGE的无背景染色，其的无背景染色，其极限灵敏度为极限灵敏度为810ng810ng，但这种染液会对蛋白质进行修饰，但这种染液会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析的结果。而影响质谱分析的结果。n氨基黑氨基黑常用于转印至聚偏二氟乙烯（常用于转印至聚偏二氟乙烯（PVDFPVDF）和）和/或硝酸或硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色。纤维素膜上的蛋白质的染色。n银染的缺点是：对某些种类的蛋白质染色效果差，对其银染的缺点是：对某些种类的蛋白质染色

36、效果差，对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响。后的蛋白质测序和质谱分析造成影响。n这两类染色技术都可减少胶内蛋白质产量这两类染色技术都可减少胶内蛋白质产量。博学至精博学至精 明德至善明德至善 博学至精博学至精 明德至善明德至善负 染n能专门能专门提高提高PAGE胶上蛋白质的回收率胶上蛋白质的回收率，但不能用，但不能用于膜上染色。于膜上染色。n结果表现为结果表现为胶面着色而蛋白质点透明胶面着色而蛋白质点透明。n速度快（速度快（515min），蛋白质的生物活性能保持：），蛋白质的生物活性能保持：一旦用络合剂如一旦用络合剂如EDTA或或Tris/甘氨酸转移缓冲液来甘氨酸转移缓冲液来络合金属离子就可进

37、行提取来转移蛋白质。络合金属离子就可进行提取来转移蛋白质。n它主要适用于蛋白质显色、完整蛋白质的胶上被它主要适用于蛋白质显色、完整蛋白质的胶上被动提取以及质谱分析。动提取以及质谱分析。n该技术主要包括金属盐染料、锌咪唑染料等的该技术主要包括金属盐染料、锌咪唑染料等的使用。使用。博学至精博学至精 明德至善明德至善胶体扩散染料n主要用于主要用于高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和和PVDF膜上的蛋白质膜上的蛋白质，不用于胶内染色。，不用于胶内染色。n最好的胶体金染色的灵敏度与最好的胶体金染色的灵敏度与PAGE胶内的胶内的银染类似。银染类似。n这种技术主要包括这种技术主要包

38、括丽春红、印度墨水染料、丽春红、印度墨水染料、胶体金染料胶体金染料等。等。博学至精博学至精 明德至善明德至善有机荧光团染料n包括共价结合和非共价结合的荧光团染料两类。后者最为包括共价结合和非共价结合的荧光团染料两类。后者最为常用，其典型代表是已经商品化的常用，其典型代表是已经商品化的SYPRO Red、Orange、Ruby等荧光染料。等荧光染料。n这三种染料可对这三种染料可对SDS-PAGE胶内蛋白质进行一步染色，约胶内蛋白质进行一步染色，约3060min完成，灵敏度为完成，灵敏度为210ng。染色后的凝胶用标准的。染色后的凝胶用标准的实验室实验室300nm紫外透射仪进行照像保存，其线性范围

39、为紫外透射仪进行照像保存，其线性范围为3个个数量级。数量级。n这三种染料的电泳染色结果与在酵母中通过这三种染料的电泳染色结果与在酵母中通过SAGE所获得所获得的基因表达水平的动态范围相匹配。的基因表达水平的动态范围相匹配。n在在Tris/甘氨酸转印缓冲液中染色后，蛋白质可被转印至膜甘氨酸转印缓冲液中染色后，蛋白质可被转印至膜上并进行免疫染色或上并进行免疫染色或Edman测序来鉴定蛋白质。测序来鉴定蛋白质。博学至精博学至精 明德至善明德至善博学至精博学至精 明德至善明德至善金属螯合染料n这是一类与现代蛋白质组学研究相兼容的、这是一类与现代蛋白质组学研究相兼容的、相对较新的蛋白质显色试剂，其设计专

40、门与相对较新的蛋白质显色试剂，其设计专门与常用微量化学表征过程兼容。它们不包含戊常用微量化学表征过程兼容。它们不包含戊二醛、甲醛或二醛、甲醛或Tween-20等，很容易和集成化等，很容易和集成化蛋白质组学平台（包括自动化凝胶染色仪、蛋白质组学平台（包括自动化凝胶染色仪、图像分析工作站、机器人剪切仪器、蛋白质图像分析工作站、机器人剪切仪器、蛋白质酶解工作站和质谱仪等）相结合。酶解工作站和质谱仪等）相结合。n其中其中SYPRO Ruby也是一种基于钌的金属发也是一种基于钌的金属发光染料。光染料。博学至精博学至精 明德至善明德至善 灵敏度 20pg博学至精博学至精 明德至善明德至善2DE重复性重复性

41、The same protocol and sample,however not the same resultsRec:similar;cir:different 博学至精博学至精 明德至善明德至善DIGE&Proteins Labeled with CyDyes1.Proteins labeled with CyDyes:with dyes cyanine(Cy2 blue,Cy3 red,Cy5 green),the dyes cannot influence protein property as well as its molecular weight much.2.The Mixe

42、d Run on 2-DE:the mixed ratio at 1:1,run on the same 2-DE,the same kind of proteins with different dyes from different samples can co-migrate.3.The Mixed Gel Scanned:with laser scanner to scan the mixed ran gel at different wavelengths according to CyDye4.The Result Read out:the position and the col

43、or of the protein spots on DIGE image,the position to represent the protein ID,the color,according to standard color calibrator to infer each dye the proportion to the dye mix,to represent the relative amount of the same kind of protein among different samples.64博学至精博学至精 明德至善明德至善650C x 30 minGE(2004

44、)2-D ElectrophoresisLysine Labeling(minimal labeling)1.In practice 400 pmol of dye is added to 50ug of protein.2.In this way only 3-5%of the proteins will receive a tag(95-97%remain unlabeled)3.Labeling reaction:no IPG buffer,no reductant,pH 8.5,37,30 min with dye,the epsilon-amino side group of lys

45、ine is labeled with dye.博学至精博学至精 明德至善明德至善66Cysteine Labeling(saturation labeling)1.The high sensitivity,down to 1000 human cells(around 2.5 ug protein)could provide good 2-DE 2.Labeling reaction:no IPG buffer;TCEP reductant pH 8.0,37,1h;dye added pH 8.0,37 30 min;the thio group of cysteine labeled w

46、ith dyes(Cy3 or Cy5).博学至精博学至精 明德至善明德至善67Workflow for 2-DE of Proteins Labeled with CyDyes博学至精博学至精 明德至善明德至善68Workflow for DIGE of Proteins Labeled with CyDyesGE(2004)2-D Electrophoresis博学至精博学至精 明德至善明德至善69Proteins Labeled with CyDyesMix Labeled Proteins 2-DELaser Scanner with Different WavelengthsIndi

47、vidual&Overlap Image Analysis(Protein Spot Location&Color)Identification of Protein ID&Abundance1st IEF(pI)2nd SDS-PAGE(Mw)博学至精博学至精 明德至善明德至善Example for DIGE Images Scanned with Difference WavelengthProteomics in Practice p6970博学至精博学至精 明德至善明德至善2-DE 凝胶蛋白质斑点的检测凝胶蛋白质斑点的检测n图像扫描和分析图像扫描和分析Image Scanner II博

48、学至精博学至精 明德至善明德至善2-DE 凝胶蛋白质斑点的检测凝胶蛋白质斑点的检测n全自动斑点切取系统（全自动斑点切取系统（Ettan Spot Picker）博学至精博学至精 明德至善明德至善v质谱原理：质谱原理：样本分子离子化后,根据不同离子间质荷比(m/e)差异,分离样本,确定分子量2-DE 凝胶蛋白质斑点的检测凝胶蛋白质斑点的检测博学至精博学至精 明德至善明德至善Principle for Mass Spectrometry74Schematic of Quadrupole TOF Hybrid AnalyzerWestermeier(2008)Proteomics in Practi

49、ce博学至精博学至精 明德至善明德至善电喷雾质谱电喷雾质谱博学至精博学至精 明德至善明德至善n样品溶于固定的底样品溶于固定的底物中形成晶体，用物中形成晶体，用激光脉冲使其离子激光脉冲使其离子化化，离子被加速后，离子被加速后通过飞行管时分离，通过飞行管时分离，所有离子均可被检所有离子均可被检测，常用来测测，常用来测蛋白蛋白质质、多肽、核酸和多肽、核酸和多糖等生物大分子多糖等生物大分子MALDI-TOF MS博学至精博学至精 明德至善明德至善n通过质谱分析，可以获得分析样品的通过质谱分析，可以获得分析样品的分子量、分子分子量、分子式、分子中同位素构成和分子结构式、分子中同位素构成和分子结构等多方面

50、的信息等多方面的信息SARS病毒病毒N蛋白整体分子量蛋白整体分子量 博学至精博学至精 明德至善明德至善n蛋白质经过酶解成肽段后，获得所有肽段的蛋白质经过酶解成肽段后，获得所有肽段的分子质量，形成一个特异的肽质量指纹图谱分子质量，形成一个特异的肽质量指纹图谱（peptide mass fingerprinting，PMF），通），通过数据库搜索与比对，便可确定待分析蛋白过数据库搜索与比对，便可确定待分析蛋白质分子的性质质分子的性质。Peptide Mass Fingerprinting(PMF)博学至精博学至精 明德至善明德至善Peptide Mass Fingerprinting(PMF)博学