食品微生物检验技术(三)课件.pptx

1、食品微生物检验技术（二）酱油种曲孢子数及发芽率的测定一、理论基础 利用发酵法酿制酱油，需要制曲，种曲是成曲的曲种，是保证成曲的关键，是酿制优质酱油的基础。种曲质量要求之一是含有足够的孢子数量，必须达到6109个/（干基计）以上，孢子旺盛，活力强，发芽率达85%以上，所以孢子数及其发芽率的测定是种曲质量控制的重要手段。测定孢子数的方法有多种，这里采用显微镜直接计数法，即将一定浓度的孢子悬浮液放在血细胞计数板的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积一定，所以可以根据在显微镜下观察到的孢子数目来计算单位体积的孢子总数。【材料准备】（1）仪器和材料：盖玻片、漩涡均匀器、血细胞计数板、电子天平、

2、显微镜。（2）培养基和试剂：95%酒精、10%稀硫酸、酱油种曲。二、酱油种曲孢子数测定【检验方法】（1）样品稀释 称取种曲1g（称准至0.002），倒入盛有玻璃珠的250mL三角瓶内、加入95%酒精5mL、无菌水20mL、10%稀硫酸10mL，在旋涡均匀器上充分振摇，使种曲孢子分散，然后用3层纱布过滤，用无菌水反复冲洗，务使滤渣不含孢子，最后稀释至500mL。（2）准备计数板 制计数装片 取洁净干燥器的雪球计数板，盖上盖玻片，用无菌滴管取1小滴孢子稀释液，滴于盖片的边缘，是滴液自行渗入计数室，不要产生气泡。用吸水纸吸干多余的稀释液，静置5min,待孢子沉降。二、酱油种曲孢子数测定（3）观察计数

3、 观察：用低倍镜或高倍镜观察。计数：使用1625规格的计数板时，只计计数室4个角上的4个中格（100个小格），如果使用2516规格计数板时，除计4个角上的4个中格外还需要计中央一个格的数目（80个小格）。每个样品观察23次，取平均值（4）计算 1625规格计数板 X=（N1/100）400104(V/m)2516规格计数板 X=(N2/80)400104(V/m)式中 X-种曲孢子数，个/g N1-100小格内孢子总数，个 N2-80小格内孢子总数，个 V-孢子稀释液体积，Ml m-样品质量，g。(5)结果报告 公式中的计数结果为报告中每克样品的孢子数。二、酱油种曲孢子数测定 【材料准备】（1

4、）仪器和材料：盖玻片、滴管、玻棒、显微镜、酒精灯、恒温培养箱、凹玻片。（2）培养基和试剂：察氏培养基、生理盐水、凡士林、种曲孢子粉。三、孢子发芽率的测定【检验方法】(1)制备孢子悬浮液 取种曲少许放入盛有25mL生理盐水和玻璃珠的三角瓶中，充分振摇15min，使孢子分散，制备孢子悬浮液。(2)制作标本 在凹玻片凹窝内滴入1滴无菌水，用无菌滴管吸取孢子悬浮液数滴加入却冷至450C的察氏培养基上，用玻棒一薄层涂片在盖玻片上，然后反盖于凹玻片的凹窝上，四周涂凡士林封固，于30320C下恒温培养35h。(3)镜检 在显微镜下观察发芽情况，标本片至少同时做2个，连续观察2次以上，取平均值。(4)计算发芽

5、率并报告 式中X-发芽率 A-发芽孢子，个 B-未发芽孢子数，个 根据计算结果取平均数，报告孢子的发芽率。三、孢子发芽率的测定100%AXAB（1）孢子悬浮液制备后要立刻制作标本片，培养时间不宜过长。（2）培养基中接入悬浮液的量，要根据视野内孢子数多少来决定，一般以每视野内1020个孢子为宜。（3）要正确区分孢子的发芽和不发芽状态。（4）孢子的发芽快慢与温度有密切关系，所以培养温度要严格控制。四、注意事项食品中金黄色葡萄球菌检验u 根据伯杰氏鉴定细菌学手册，按葡萄球菌的生理化学组成，金黄色葡萄球菌划为葡萄球菌属。葡萄球菌属分为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡

6、萄球菌(S.epidermidis)和腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)；u其中金黄色葡萄球菌对人类有致病性，通常被称为病原性球菌。金黄色葡萄球菌可引起化脓性炎症，又称为化脓性球菌。u表葡偶尔致病。一、金黄色葡萄球菌概况分类u环境分布：空气、水、灰尘及人和动物的排泄物n季节分布：多见于春夏季；n中毒食品种类多：奶、肉、蛋、鱼及其制品；剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等。分布一、金黄色葡萄球菌概况u典型的金黄色葡萄球菌为球型，显微镜下排列成葡萄串状,革兰氏阳性、无芽孢，无荚膜。u需氧或兼性厌氧，最适生长温度30-37，最适生长pH6-7。在普通营养琼脂平板上培养1824。u形成圆形、表面光

7、滑、不透明的菌落。可产生金黄色色素，色素为脂溶性，不溶于水，故色素只局限于菌落内。u具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。生物学特性一、金黄色葡萄球菌概况u有高度的耐盐性，可在10-15%NaCl肉汤中生长。u血平板菌落周围形成透明的溶血环。u大多数菌株分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红试验、VP试验多为阳性，不产生靛基质。触酶阳性。u血浆凝固酶：一般认为，血浆凝固阳性的金黄色葡萄球菌菌株有致病力。否则为无致病力的菌株。血浆凝固酶对热稳定，能抵抗60 30min而不被破坏，甚至100 30min后，仍能保存大部分活性。生物学特性一、金黄色葡萄球菌概况n

8、肠毒素形成条件：存放温度：温度越高，产毒时间越短（100cfu/g(mL)、21、3h）；存放地点:通风不良氧分压低易形成肠毒素；食物种类:含蛋白质丰富，水分多，同时含一定量淀粉的食物，肠毒素易生成。n污染途径：食品加工人员、炊事员或销售人员带菌，造成食品污染；食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染，产生了肠毒素，引起食物中毒；熟食制品包装不密封，运输过程中受到污染；奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时，对肉体其他部位的污染。流行病学一、金黄色葡萄球菌概况 检样 25g(或25ml)样品+225ml7.5%氯化钠肉汤 Baird-Parker 平板，血平板观察溶血报告BHI肉汤和营养琼脂

9、斜面涂片染色血浆凝固酶试验3611824h3611824h；Baird-Parker 平板 2448h3611824h二、金黄色葡萄球菌定性检测金黄色葡萄球菌细胞数量增殖361，2448h二、金黄色葡萄球菌定性检测液体样品摇匀25mL均质固体样品225ml7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤25g361818h血平板上其典型菌落呈金黄色，有时也为白色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，有溶血圈。圆形，光滑突起，湿润，直径2-3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘常为淡色（米黄色或灰白色略带灰色或黄色的白色），周围为一混浊带，在其外缘常有一透明圈。用接种针接触菌落似有黄油树胶的粘稠感。金黄色葡

10、萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽孢每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果操作规程Baird-Parker平板：l胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏:提供碳源、氮源、硫、维生素和痕量矿物元素l丙酮酸钠:生长促进剂l亚碲酸盐:对除金黄色葡萄球菌外的其他能分解卵黄菌株有毒性，并使菌落产生黑色l卵黄:提供营养和有利于观察卵磷脂环l甘氨酸和氯化锂:对金黄色葡萄球菌以外的其它菌株有抑制作用。二、金黄色葡萄球菌定性检测注意事项血浆凝固酶试验：l血浆凝固酶试验可选用人血浆或兔血浆。用人血浆出现凝固的时间短，约93.6的阳性菌在1h

11、内出现凝固。用兔血浆1h内出现凝固的阳性菌株仅达86，大部分菌株可在6h内出现凝固。l若被检菌为陈旧的培养物（超过1824h），可能造成凝固酶活性低，出现假阴性。l不能使用甘露醇氯化钠琼脂上的菌落做血浆凝固酶的实验，因所有高盐培养基都可以抑制A蛋白的产生，造成假阴性结果。l不要用力振摇试管，以免凝块振碎。l必需设阳性（标准金黄色葡萄球菌）、阴性（白色葡萄球菌）、空白（肉汤）对照。二、金黄色葡萄球菌定性检测注意事项报告检样25g（或25ml）样品+225ml稀释液，均质10倍系列稀释选择23个连续的适宜浓度的样品匀液，接种Baird-Parker 平板分别接种0.3ml，0.3ml，0.4ml

12、计数及血浆凝固酶试验361 45h48h三、金黄色葡萄球菌定量检测样品处理移1ml样品稀释同菌落总数检验选择合适稀释度接种涂布BP平板0.3ml0.3ml0.4ml0.3ml0.3ml0.3ml0.3ml0.4ml0.4ml移1ml计数及血浆凝固酶验证试验血浆计数平板三、金黄色葡萄球菌定量检测操作规程 通常情况下涂布后，将平板静置10min，如样液不易吸收，可将平板置361培养1h后，再反转平板，倒置于培养箱培养，361，4548h。注：接种前应注意保持平板的干燥(可在2050的培养箱中干燥)。并从典型菌落中任选5个菌落（小于5个全选），分别按第一法做血浆凝固酶试验。结果计算三、金黄色葡萄球菌

13、定量检测选择合计菌落数在20-200的平板，计算典型菌落数。如果：u只有一个稀释度平板的菌落数在20CFU200CFU之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落。u最低稀释度平板的菌落数小于20CFU且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落。u某一稀释度平板的菌落数大于200CFU且有典型菌落，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落。u某一稀释度平板的菌落数大于200CFU且有典型菌落，且下一稀释度平板上有典型菌落，但不在20CFU200CFU之间，应计数该稀释度平板上的典型菌落。式（1）其中T-样品中金黄色葡萄球菌菌落数A-某一稀释度典型菌落总数B-某一稀释度凝

14、固酶阳性菌落数C-某一稀释度用于凝固酶试验的菌落数d-稀释因子三、金黄色葡萄球菌定量检测结果计算CdABT 样品稀释液10-1典型菌落数65用于做血浆凝固酶菌落数5 血浆凝固酶阳性菌落数4结果计算案例案例结果计算三、金黄色葡萄球菌定量检测2个连续稀释度的平板菌落数均在20200CFU之间，按公式2计算式（2）其中T：样品中金黄色葡萄球菌菌落数；A1：第一稀释度（低稀释倍数）典型菌落的总数；A2：第二稀释度（高稀释倍数）典型菌落的总数；B1：第一稀释度（低稀释倍数）血浆凝固酶阳性的菌落数；B2：第二稀释度（高稀释倍数）血浆凝固酶阳性的菌落数；C1:第一稀释度（低稀释倍数）用于血浆凝固酶试验的菌落

15、数；C2:第二稀释度（高稀释倍数）用于血浆凝固酶试验的菌落数；dCBACBAT1.12/221/11样品稀释液10-110-2典型菌落数18321用于做血浆凝固酶菌落数5 5血浆凝固酶阳性菌落数32结果计算案例案例霉菌和酵母菌数的测定霉菌和酵母同属于真菌。霉菌：为丝状真菌的统称。凡是在营养基质上能形成绒毛状、网状或絮状菌丝体的真菌（除少数外），统称为霉菌。按Smith分类系统，霉菌分属于真菌界的藻状菌纲、子囊菌纲和半知菌类。霉菌和酵母的概述霉菌的菌落大、疏松、干燥、不透明，有的呈绒毛状或絮状或网状等，菌体可沿培养基表面蔓延生长，由于不同的真菌孢子含有不同的色素，所以菌落可呈现红、黄、绿、青绿、

16、青灰、黑、白、灰等多种颜色。霉菌和酵母的概述酵母菌：酵母通常是单细胞，呈圆形、卵圆形、腊肠形或杆状；种类较多，目前已知有500多种。分布广，在水果、蔬菜、花蜜和植物叶子表面以及果园的土壤里。在牛奶、动物的排泄物以及空气中也有酵母存在。大多数腐生，少数寄生。食品中常见的酵母菌：腐败酵母种：啤酒酵母、红酵母、克柔氏假丝酵母等。啤酒酵母、红酵母主要引起软包装饮料发酵性腐败。克柔氏假丝酵母主要引起泡菜、酱油变质。霉菌和酵母的概述酵母菌菌落大而厚，圆形，光滑湿润，粘性，颜色单调。常见白色、土黄色、红色。霉菌和酵母的概述酵母菌：酵母通常是单细胞，呈圆形、卵圆形、腊肠形或杆状；种类较多，目前已知有500多种

17、。分布广，在水果、蔬菜、花蜜和植物叶子表面以及果园的土壤里。在牛奶、动物的排泄物以及空气中也有酵母存在。大多数腐生，少数寄生。食品中常见的酵母菌：腐败酵母种：啤酒酵母、红酵母、克柔氏假丝酵母等。啤酒酵母、红酵母主要引起软包装饮料发酵性腐败。克柔氏假丝酵母主要引起泡菜、酱油变质。霉菌和酵母的概述卫生学意义u霉菌和酵母作为评价样品卫生质量（霉变）的指示菌，并以霉菌和酵母数来判定样品被污染的程度。u霉变的食品带有令人难以接受的不良感官 性,如刺激性气味、异常颜色、酸臭味道、组织溃烂等。u食品成分物质被严重分解破坏，不仅蛋白质、脂肪和碳水化合物发生降解破坏，无机盐和微量元素也有严重的流失和破坏。u霉菌

18、和酵母产生有毒代谢产物（霉菌毒素），可引起人体不良反应和食物中毒。GB 4789.15-2016 标准解读霉菌和酵母计数食品微生物学检验食品安全国家标准GB 4789.15-2016 标准解读本标准代替GB 4789.15-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数和SN/T 2552.3-2010乳及乳制品卫生微生物学检验方法 第3部分：酵母、霉菌菌落计数前言本标准与GB 4789.15-2010相比，主要变化如下：修改了设备和材料；修改了设备和材料；修改了培养基和试剂；修改了培养基和试剂；修改了检验程序和操作步骤；修改了检验程序和操作步骤；修改了结果与报告；修改了结果与报

19、告；修改了附录修改了附录A A；附录附录B B修改为第二法修改为第二法GB 4789.15-2016 标准解读本标准规定了食品中霉菌和酵母菌（本标准规定了食品中霉菌和酵母菌（moulds and yeastsmoulds and yeasts）的计数方法。）的计数方法。本标准第一法适用于各类食品中霉菌和酵母的计数；第二法适用于番本标准第一法适用于各类食品中霉菌和酵母的计数；第二法适用于番茄酱罐头、番茄汁中霉菌的计数。茄酱罐头、番茄汁中霉菌的计数。规定主题内容与适用范围1 范围解读：旧版番茄酱罐头，罐头这两个字运用解读：旧版番茄酱罐头，罐头这两个字运用的不准确。也就说是番茄酱，无论是不是罐的不准

20、确。也就说是番茄酱，无论是不是罐头，还是软包装，都是用第二法检验的。头，还是软包装，都是用第二法检验的。GB 4789.15-2016 标准解读除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2 设备和材料2.1 2.1 培养箱：培养箱：28281 2.2 1 2.2 排击式均质器及均质袋排击式均质器及均质袋 2.3 2.3 电子天平：感量电子天平：感量 0.1g 0.1g 2.4 2.4 无菌锥形瓶：容量无菌锥形瓶：容量 500mL 2.5 500mL 2.5 无菌吸管：无菌吸管：1mL1mL（具（具0.01mL0.01mL刻度）、刻度）、10mL10mL（具（具0.1mL0.1mL

21、刻度）刻度）2.6 2.6 无菌试管：无菌试管：18mm18mm180mm180mm2.7 2.7 旋窝混合器旋窝混合器 2.8 2.8 无菌平皿：直径无菌平皿：直径90mm 2.9 90mm 2.9 恒温水浴箱：恒温水浴箱：46461 1 2.10 2.10 显微镜：显微镜：1010倍倍100100倍倍 2.11 2.11 微量移液器及枪头：微量移液器及枪头：1.0mL 2.12 1.0mL 2.12 折光仪折光仪2.13 2.13 郝氏计测波片：具有标准计测室的特制玻片郝氏计测波片：具有标准计测室的特制玻片 2.14 2.14 盖玻片盖玻片 2.15 2.15 测微测微1 1器：具标准刻度

22、的玻片器：具标准刻度的玻片 2.2 2.2 旧版本均振荡式进行样品表面冲洗，均质不够。使用旋转刀均质器，可能会切断霉菌菌丝体。旧版本均振荡式进行样品表面冲洗，均质不够。使用旋转刀均质器，可能会切断霉菌菌丝体。2.6 2.6 无菌试管规格由无菌试管规格由10mm10mm75mm75mm，修改为，修改为18mm18mm18mm18mm，有利于样品稀释液混匀。，有利于样品稀释液混匀。2.7 2.7 增加漩涡混合仪，可以保证样品稀释液的混匀，减少污染机会。过去使用移液器或移液管反复吹吸样品及稀释液，会造成增加漩涡混合仪，可以保证样品稀释液的混匀，减少污染机会。过去使用移液器或移液管反复吹吸样品及稀释液

23、，会造成有害溶胶，以及增大污染风险。有害溶胶，以及增大污染风险。2.9 2.9 增加恒温水浴，准确控制倾注琼脂的温度。增加恒温水浴，准确控制倾注琼脂的温度。2.11 2.11 增加微量移液器及枪头增加微量移液器及枪头1.0mL1.0mL：包容实际工作中常用方式。：包容实际工作中常用方式。删除删除500mL500mL无菌广口瓶，原因：包括牛皮纸袋在内的包装材料实验室使用频率越来越低。无菌广口瓶，原因：包括牛皮纸袋在内的包装材料实验室使用频率越来越低。删除：冰箱和恒温振荡器：标准没有用到。删除：冰箱和恒温振荡器：标准没有用到。GB 4789.15-2016 标准解读3 培养基和试剂3.1 3.1

24、生理盐水：生理盐水：28281 1 3.2 3.2 马铃薯葡萄糖琼脂马铃薯葡萄糖琼脂 3.3 3.3 孟加拉红琼脂孟加拉红琼脂 3.4 3.4 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液3.1 3.1 增加了生理盐水：增加了生理盐水：8.5g8.5g氯化钠加入氯化钠加入1000mL1000mL蒸馏水中，搅拌至完全溶解，分装蒸馏水中，搅拌至完全溶解，分装121121灭菌灭菌15min15min3.4 3.4 增加磷酸盐缓冲液：称取增加磷酸盐缓冲液：称取34.0g34.0g的磷酸二氢钾溶于的磷酸二氢钾溶于500mL500mL蒸馏水中，用大约蒸馏水中，用大约175mL175mL的的1mol/L1mol/L氢氧化钠溶液

25、调节氢氧化钠溶液调节pHpH至至7.27.20.10.1，用蒸馏水稀释至，用蒸馏水稀释至1000mL1000mL后贮存后贮存于冰箱。取贮存液于冰箱。取贮存液1.25mL1.25mL，用蒸馏水稀释至，用蒸馏水稀释至1000mL1000mL，分装于适宜容器中，分装于适宜容器中，121121高压灭菌高压灭菌15min15min。增加增加3.13.1，3.33.3两种稀释液，为方便实验室中遇到同一份样品，需做菌落总数、大两种稀释液，为方便实验室中遇到同一份样品，需做菌落总数、大肠菌群和霉菌时，多稀释液更方便，各配所需。肠菌群和霉菌时，多稀释液更方便，各配所需。GB 4789.15-2016 标准解读第

26、一法 霉菌和酵母平板计数法GB 4789.15-2016 标准解读4 检验程序检样25g（mL）样品+225mL无菌稀释液，均质选择2个-3个适宜稀释度的样品匀液，每个平皿加入1mL，每个稀释度做两个平行每皿中加入20mL-25mLPDA或孟加拉红菌落计数报告培养（281），5天10倍系列稀释符合国标 GB 4789.28-2013版对于培养时间超过48小时的培养基应倾注4毫米左右的厚度和二十毫升以上量的相应规定。GB 4789.15-2016 标准解读5 操作步骤5.1 样品的稀释5.1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品至盛有225 mL无菌稀释液（蒸馏水或生理盐水或磷酸盐缓冲液），

27、充分振摇，或用拍击式均质器拍打1min2min，制成1:10的样品匀液。5.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品至盛有 225 mL 无菌稀释液（蒸馏水或生理盐水或磷酸盐缓冲液）的适宜容器内（可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）或无菌均质袋中，充分振摇。或用拍击式均质器拍打1min2min，制成1:10的样品匀液。GB 4789.15-2016 标准解读5 操作步骤5.1.3 取1 mL 1:10样品匀液注入含有9 mL 无菌稀释液的试管中,另换一支1 mL无菌吸管反复吹吸，或在漩涡混合器上混匀，此液为1:100的样品匀液。5.1.4 按5.1.3操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液

28、。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管。5.1.5 根据对样品污染状况的估计，选择2个3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1 mL样品匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1 mL样品稀释液加入2个无菌平皿作空白对照。5.1.6 及时将20 mL 25mL冷却至46 的马铃薯-葡萄糖-琼脂或孟加拉红培养基（可放置于461恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀，置水平台面待培养基完全凝固。GB 4789.15-2016 标准解读5 操作步骤5.2 培养 待琼脂凝固后，正置平板，置28 1 培养箱中培养，观察并记录培养至第5d的结果

29、。新版本：增加了平板正置培养的规定。正置培养是避免反复观察的过程中，上下点到平板导致霉菌孢子扩散形成此生小菌落的一种手段。GB 4789.15-2016 标准解读5 操作步骤5.3菌落计数肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌落形成单位（colony forming units，CFU）表示。选取菌落数在10 CFU150CFU的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为菌落蔓延。较少菌落蔓延生长后造成的菌数增多现象。不能报告为多不可计GB 4789.15-2016 标准解读6 结果与报告6.1 结果6.1.1 计算同一稀释度的两个平

30、板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应倍数。6.1.2 若有两个稀释度平板上菌落数均在10 CFU150CFU之间，则按照GB 4789.2的相应规定进行计算。6.1.3 若所有平板上菌落数均大于150CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。6.1.4 若所有平板上菌落数均小于10CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。6.1.5 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。6.1.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在10CFU150CFU之间，其中一部分小于10CFU或大于150CF

31、U时，则以最接近10CFU或150CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算，GB 4789.15-2016 标准解读6 结果与报告6.2 报告6.2.1 菌落数按“四舍五入”原则修约，菌落数在10以内时，采用一位有效数字报告；菌落数在10100之间时，采用两位有效数字报告。6.2.2 菌落数大于或等于100时，前第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数来表示结果；也可用10的指数形式来表示，此时也按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。6.2.3 若空白对照平板上有菌落出现，则此次检测结果无效。6.2.4 称重取样以CFU/g单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告

32、，报告或分别报告霉菌和/或酵母数。案例-蜂蜜中霉菌数测定 案例-蜂蜜中霉菌数测定 2.1 2.1 培养箱：培养箱：28281 1 2.2 2.2 电子天平：感量电子天平：感量 0.1g 0.1g 2.3 2.3 装有装有225mL225mL无菌无菌蒸馏水蒸馏水的无菌锥形瓶（的无菌锥形瓶（500mL500mL）2.5 2.5 无菌吸管：无菌吸管：1mL1mL（具（具0.01mL0.01mL刻度）、刻度）、10mL10mL（具（具0.1mL0.1mL刻度）刻度）2.6 2.6 无菌试管：无菌试管：18mm18mm180mm180mm2.7 2.7 旋窝混合器旋窝混合器 2.8 2.8 无菌平皿：直

33、径无菌平皿：直径90mm 90mm 2.9 2.9 恒温水浴箱：恒温水浴箱：46461 1 25g101移1ml225ml均质102PDA或虎红冷却正置103461保温各移9ml空白生理盐水各1ml各1ml各1ml各1ml边倒边摇匀案例-蜂蜜中霉菌数测定移1ml蜂蜜空无菌试管样品处理视频稀释接种视频约20mL-25mLn菌落计数应于培养后的72 h进行第一次观察。培养过程中观察平板时，动作稍重，生长快速的霉菌孢子就会在培养基内扩散，导致二次污染，结果异常。n一般以第五天的读数为最终计数。案例-蜂蜜中霉菌数测定1700031000空白长菌检测结果无效5000002701011030000案例-蜂

34、蜜中霉菌数测定菌落计数原始结果记录表培养基的选择在霉菌和酵母计数中，主要使用以下几种选择性培养基：马铃薯-葡萄糖-琼脂配有计算（PDA）：霉菌和酵母在PDA培养基上生长良好。用PDA做平板计数时，必须加入抗菌素以抑制细菌。孟加拉红（虎红）培养基：该培养基中的孟加拉红和抗菌素具有抑制细菌的作用。孟加拉红还可以抑制霉菌菌落的蔓延生长。在菌落背面由孟加拉红产生的红色有助于霉菌和酵母菌落的计数 注意事项GB 4789.15-2016 标准解读第二法 霉菌直接镜检计数法番茄酱罐头霉菌计数常用郝氏霉菌计测法 检样的制备：取定量检样，加蒸馏水稀释至折光指数为1.34471.3460（即浓度为7.98.8），

35、备用。显微镜标准视野的校正：将显微镜按放大率90125倍调节标准视野，使其直径为1.382mm。涂片：洗净郝氏计测玻片，将制好标准液，用玻璃棒均匀的摊布于计测室，以备观察。注意事项番茄酱罐头霉菌计数常用郝氏霉菌计测法 观察：将制好之载玻片放于显微镜标准视野下进行霉菌观察，一般每一检样观察50个视野，同一检样应由两人进行观察。结果与计算：在标准视野下，发现有霉菌菌丝其长度超过标准视野（1.382mm）的1/6或三根菌丝总长度超过标准视野的1/6（即测微器的一格）时即为阳性（+），否则为阴性（-），按100个视野计，其中发现有霉菌菌丝体存在的视野数，即为霉菌的视野百分数。注意事项食品中沙门氏菌检验

36、u1885年由Salmon氏等在猪霍乱流行时分离出猪霍乱沙门菌，故定名为沙门菌属。u 沙门菌属是肠杆菌科中最重要的病原菌。它是一群抗原结构、生化特性相似的革兰氏阴性杆菌。目前已发现的沙氏菌有2500多个血清型和变种。u虽然沙门菌血清型很多，但多数国家从人体、动物和食品中分离出沙门菌仅约4050 个血清型。而在一个国家中的一定时期只约有10个血清型是比较常见的。分类：伤寒沙门菌(伤寒、副伤寒)-传染病防治法中规定报告的乙类传染病。非伤寒沙门菌-食品安全标准的检测的主要对象。一、沙门氏菌概况分类u沙门菌广泛存在于自然环境中。u通过沙门菌病患者或健康带菌的人和动物的排泄物污染环境和食品。u易于污染的

37、高危食物：畜禽肉类、蛋、奶及其制品。u沙门菌在肉类中不分解蛋白质，不产生靛 基质，所以当食品污染了沙门菌后，通常没有感官性状的改变。一、沙门氏菌概况分布病原菌常见食品潜伏期病程症状沙门氏菌肉乳蛋68h37d恶心呕吐腹痛发热冷汗头痛u革兰氏阴性杆菌，无芽胞，一般无荚膜。u除鸡瘟沙门菌（S.pullorum)和鸡沙门菌(S.gallinarum)外均有动力。为周身鞭毛，并多数有菌毛。u 大小13um0.51um。一、沙门氏菌概况生物学特性u营养需求不高，需氧或兼性厌氧。普通营 养培养基上均能生长，能够利用柠檬酸盐作为碳源。u在普通肠道选择性平板上基本上形成无色菌落。菌落中等大小，半透明，表面光滑，

38、边缘整齐或呈锯齿状。u不分解乳糖，大部分菌株产H2S，发酵葡萄糖产酸不产气。u最适培养温度为37，最适pH7.27.6。u耐受胆盐，在粪便、土壤、食品、水中可生存5个月至二年之久。一、沙门氏菌概况培养与生化特性非如上述的各种反应检样(或)挑取可疑菌落选择性平板筛选非沙门氏菌H2S+靛基质-尿素-KCN-赖氨酸+H2S+靛基质+尿素-KCN-赖氨酸+H2S-靛基质-尿素-KCN-赖氨酸+/-甘露醇+、山梨醇+ONPG-沙门氏菌血清学试验报告生化鉴定试剂盒或全自动生化鉴定系统前增菌法 25g+225mlBPW1ml+10ml421，18h24h1ml+10ml36 1，18h24hTSI，靛基质,

39、尿素(pH7.2),KCN,赖氨酸，营养琼脂二、沙门氏菌检测二、沙门氏菌检测液体样品摇匀25mL均质固体样品225mlBPW25gTTBSC1ml1ml使受损伤的沙门菌细胞恢复到稳定的生理状态沙门菌细胞数量增殖361818h421，1824h361，1824hSC TTB亚硒酸盐抑菌；胱氨酸促生长亚硒酸盐抑菌；胱氨酸促生长四硫酸钠和煌绿抑菌四硫酸钠和煌绿抑菌适合伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌生长适合伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌生长适合其他沙门菌生长，适合其他沙门菌生长，二、沙门氏菌检测BSBS(或)(或)361，1824h361，1824h361，4048h361，4048h沙门氏菌在BS菌落特

40、征沙门氏菌在HE菌落特征沙门氏菌在XLD菌落特征沙门氏菌在显色培养基菌落特征菌落为黑色有金属光泽、棕褐色菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变的菌落，周围培养基不变蓝绿色或蓝色，多数菌落中心蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑为黄色，中心黑色或几乎全黑色色菌落呈粉红色，带或不带黑色中菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的的黑色中心，

41、或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑心中心或不带黑心中心按照显色培养基的说明进行判定按照显色培养基的说明进行判定葡萄糖+H2S乳糖+H2S乳糖+H2S葡萄糖+H2SSCTTB二、沙门氏菌检测若分解硫化氢则产生黑色若分解硫化氢则产生黑色FeS沉淀，若分解糖类产气则可见气泡或裂缝沉淀，若分解糖类产气则可见气泡或裂缝只有斜面和底层均产酸，且赖氨酸脱羧酶阴性者才可排除为沙门菌的可能性只有斜面和底层均产酸，且赖氨酸脱羧酶阴性者才可排除为沙门菌的可能性其余情况既可能是也可能不是沙门氏菌属的细菌其余情况既可能是也可能不是沙门氏菌属的细菌二、沙门氏菌检测生化鉴定系统

42、7.将反应结果将反应结果输入数据库软输入数据库软件中得到生化件中得到生化谱代码谱代码8.软件自动查询报软件自动查询报告最符合的菌名告最符合的菌名6.根据标准色卡判读反应结果根据标准色卡判读反应结果反应序号 硫化氢（H2S）靛基质pH7.2尿素氰化钾（KCN）赖氨酸脱羧酶结果判断A1+典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常，可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门氏菌。A2+补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。A3+/-补做邻硝基酚-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）。ONPG阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳

43、性，甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。注：+阳性；阴性；+/阳性或阴性二、沙门氏菌检测u结果报告：综合以上生化试验结果，报告25g（mL）样品中检出或未检出沙门氏菌。u前增菌：缓冲蛋白胨水（BPW）肉汤是基础增菌培养基，不含任何抑制成分，有利于受损伤的沙门菌复苏。鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。u增菌：四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB）含有胆盐，抑制革兰氏阳性球菌和部分大肠埃希氏菌的生长，而伤寒与付伤寒沙门菌仍能生长。u亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）可对伤寒及其他沙门菌作选择性增菌，亚硒酸与蛋白胨中的含硫氨基酸结合，形成亚硒酸和硫的复合物，影响细菌硫代谢，从而抑制大肠埃希氏菌

44、、肠球菌和变形杆菌的增殖。三、注意事项u平板分离：l主要杂菌为大肠埃希氏菌，而两者区别在于是否发酵乳糖，故加入乳糖、酸碱指示剂两个指针来判断可疑菌落；l伤寒杆菌及其他沙门菌能利用葡萄糖将亚硫酸铋还原成硫酸铋，形成黑色菌落周围绕有黑色和棕色的环，对光观察可见有金属光泽。l HE琼脂可抑制某些肠道致病菌和革兰氏阳性菌的生长，但对革兰氏阴性的肠道致病菌则无抑制作用。XLD琼脂作为大肠埃希氏菌的抑制剂，而不影响沙门菌属和志贺菌属的生长。沙门菌显色培养基利用沙门菌特异性酶与显色基团的特有反应，使色原游离出来，沙门菌在培养基上呈紫色或紫红色。而大肠杆菌等其他肠道杆菌呈蓝绿色。三、注意事项食品生产环境的卫生

45、检测q新风带入的尘粒和微生物；q作业人员发尘和散菌；q建筑围护结构、设施的产尘；q设备及产品生产过程的产尘。洁净室污染源一、洁净区污染一、洁净区污染对洁净区的空间、操作人员和设备（工作台面）都必须进行检查，以确保分析结果的质量不受这些环境因素的影响。有卫生生产环境要求的洁净生产区宜包括易腐性食品、即食半成品或成品的最后冷却或包装前的存放、前处理场所；不能最终灭菌的原料前处理、产品灌封、成型场所，产品最终灭菌后的暴露环境；内包装材料准备室和内包装室以及为食品生产、改进食品特性或保存性的加工处理场所和检验室等。监测项目和区域u 包括沉降菌和浮游菌，只是捕捉时的形态差异 u 沉降菌指落在地面或物体表

46、面的灰尘中携带的细菌；u 浮游菌指在空气中漂浮的尘埃所携带的细菌。u 见相关国家标准 沉降菌 GB/T 16294-2010 浮游菌 GB/T 16293-2010一、洁净区污染空间微生物四、洁净间浮游菌的检测（Airborne Microbe）本标准规定了医药工业洁净室和洁净区中浮游菌测试条件、测试方法。本标准适用于医药工业洁净室和洁净区，无菌室或无菌区域（包括洁净工作台）的浮游菌的测定和环境的验证。二、洁净间浮游菌的检测（Airborne Microbe）采样点的布置n采样点位置可以同悬浮粒子测试点。n工作区测点位置离地0.81.5m左右（略高于工作面）。n送风口测点位置离开送风面30cm

47、左右。n可在关键设备或关键工作活动范围处增加测点。二、洁净间浮游菌的检测（Airborne Microbe）采样注意事项采样注意事项n对于单向流或送风口，采样器采样管口朝向应正对气流方向；对于非单向流，采样管口向上。对于单向流或送风口，采样器采样管口朝向应正对气流方向；对于非单向流，采样管口向上。n布置采样点时，至少应离开尘粒较集中的回风口布置采样点时，至少应离开尘粒较集中的回风口1m1m以上以上n采样时，测试人员应站在采样口的下风侧采样时，测试人员应站在采样口的下风侧,并尽量少走动并尽量少走动n采取一切措施防止采样过程的污染和其他可能对样本的污染。采取一切措施防止采样过程的污染和其他可能对样

48、本的污染。二、洁净间浮游菌的检测（Airborne Microbe）采样点的布置 测试步骤u 测试前仪器、培养皿表面必须严格消毒。u 采样器进入被测房间前先用消毒房间的消毒剂灭菌，用消毒剂擦净培养皿的外表面。u 采样前，先用消毒剂消毒采样器的顶盖、转盘以及罩子的内外面，采样结束，再用消毒剂轻轻喷射罩子的内壁和转盘。u 采样口及采样管，使用前必须高温灭菌。如用消毒剂对消毒时，应将管中的残留液倒掉并晾干。u 采样者应穿戴与被测洁净区域相应的工作服，在转盘上放入或调换培养皿前，双手用消毒剂消毒。u 狭缝式采样器的采样程序：开动真空泵抽气，使仪器中的残余消毒剂蒸发，时间不少于5min，并调好流量、转盘

49、转速。关闭真空泵，放入培养皿，盖上盖子后调节采样器缝隙高度。置采样口于采样点后，依次开启采样器、真空泵，转动定时器，根据采样量设定采样时间。二、洁净间浮游菌的检测（Airborne Microbe）大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）n酪蛋白胰酶消化物 15g 提供氮源、维生素和生长因子n大豆粉木瓜蛋白酶消化物 5g 提供氮源、维生素和生长因子n氯化钠 5g 调节渗透压n琼脂 15g 凝固剂n纯化水 1000mL3035 48h 二、洁净间浮游菌的检测（Airborne Microbe）最小采样量洁净度级别采样量（L/次）100级100010000级500100000级100300000级100二、

50、洁净间浮游菌的检测（Airborne Microbe）每个测点的浮游菌平均浓度的计算二、洁净间浮游菌的检测（Airborne Microbe）示例1：某测点采样量为400L，菌落数为1，则：示例2：某测点采样量为2m3，菌落数为3，则：采样量菌落数个浮游菌平均浓度)3/(m表面菌附在人体表皮或设备表面的微生物三、洁净间沉降菌的检测（Settling Microbe）测试步骤u 测试前仪器、培养皿表面必须严格消毒。u 采样器进入被测房间前先用消毒房间的消毒剂灭菌，用消毒剂擦净培养皿的外表面。u 采样前，先用消毒剂消毒采样器的顶盖、转盘以及罩子的内外面，采样结束，再用消毒剂轻轻喷射罩子的内壁和转盘