[医药卫生]版无菌、微生物限度检查法课件.ppt

1、2010年版药典附录无菌年版药典附录无菌检查检查和微生和微生 物物限度限度检查检查方方法增修定内容法增修定内容 泰州药品检验所泰州药品检验所 季大伟季大伟 起草的指导思想起草的指导思想一、以科学发展观为统领，服务于资源节约一、以科学发展观为统领，服务于资源节约型社会、环境友好型社会的要求；落实科型社会、环境友好型社会的要求；落实科学监管理念，学监管理念，着力解决发展中的问题。着力解决发展中的问题。二、与时俱进，广泛吸纳先进技术与成果；二、与时俱进，广泛吸纳先进技术与成果；坚持自主与创新；积极推进药品标准化战坚持自主与创新；积极推进药品标准化战略，略，提高我国药品标准总体水平，着力提提高我国药品

2、标准总体水平，着力提升升中国药典中国药典在国际社会中的地位和作在国际社会中的地位和作用，提高综合竞争力，用，提高综合竞争力，促进医药产业的健促进医药产业的健康发展，为构建社会主义和谐社会作出贡康发展，为构建社会主义和谐社会作出贡献。献。2010版药典无菌检查法主版药典无菌检查法主要增修订内容要增修订内容国内外药典国内外药典微生物学微生物学检验检验 发展的宗旨：发展的宗旨：提高方法捡出率、保证检验结果的准提高方法捡出率、保证检验结果的准确性、可靠性。确性、可靠性。1、实验环境、设施的发展；实验环境、设施的发展；2、培养基的品种和适用性要求；培养基的品种和适用性要求；3、检验数量、检验量符合统计学

3、要求；检验数量、检验量符合统计学要求；4、检验方法和仪器的改进检验方法和仪器的改进（薄膜过滤法、全封闭过滤（薄膜过滤法、全封闭过滤培养器）培养器）5、验证试验；（验证试验；（ICH、USP、EP、BP、JP均有规定）均有规定）6、培养时间；培养时间；7、结果结果 的分析和判断等。的分析和判断等。回顾国际无菌检查法发展历史回顾国际无菌检查法发展历史 1925年年 直接接种法首先使用在英国直接接种法首先使用在英国1932年年 英国药典推荐使用无菌测试英国药典推荐使用无菌测试1936年年 美国药典第十一章首先引用单个培养基的直接接种法美国药典第十一章首先引用单个培养基的直接接种法1950年年 美国药

4、典第十六章推荐使用美国药典第十六章推荐使用FTG和和SB两种培养基分别两种培养基分别 培养需、厌气培养需、厌气 菌和真菌菌和真菌1957年年 美国美国FDA和和MILLIPORE公司介绍膜过滤法用于抗生素无菌测试公司介绍膜过滤法用于抗生素无菌测试1963年年 英国药典英国药典63版收载薄膜过滤法无菌测试版收载薄膜过滤法无菌测试1965年年 美国药典引用薄膜过滤法用于非抑菌性药品的无菌测试美国药典引用薄膜过滤法用于非抑菌性药品的无菌测试1971年年 欧洲药典第二版公布参照薄膜过滤法无菌测试欧洲药典第二版公布参照薄膜过滤法无菌测试1978年年 欧洲药典修订版发行公布推荐使用薄膜过滤法无菌测试欧洲药

5、典修订版发行公布推荐使用薄膜过滤法无菌测试1988年年 美国美国FDA规定：假如第一次无菌检查不符合规定的样品不再复试，这规定：假如第一次无菌检查不符合规定的样品不再复试，这 一批次的药品应报废。实际上排除了药品无菌阳性后再测试的机会一批次的药品应报废。实际上排除了药品无菌阳性后再测试的机会1998年年 英国药典英国药典1998无菌测试以一次检出为准，取消复试。无菌测试以一次检出为准，取消复试。2000年年 美国药典美国药典24版无菌测试以一次检出为准，取消复试。版无菌测试以一次检出为准，取消复试。检视我国历版药典无菌检查法发展历史检视我国历版药典无菌检查法发展历史 1953版版 实验环境仅要

6、求为半无菌操作箱；仅收载一种直接接种法；实验环境仅要求为半无菌操作箱；仅收载一种直接接种法；用一种培养基检查用一种培养基检查1963版版 仅一种直接接种法；用三种培养基分别培养细菌和霉菌仅一种直接接种法；用三种培养基分别培养细菌和霉菌1977版版 开始收载薄膜过滤法（简单装置），用二种培养基分别培开始收载薄膜过滤法（简单装置），用二种培养基分别培 养细菌和霉菌养细菌和霉菌1985版版 收载薄膜过滤法限于抗生素样品；用需、厌气菌培养基及收载薄膜过滤法限于抗生素样品；用需、厌气菌培养基及 霉菌培养基；要求实验环境为紫外线灭菌的无菌室。霉菌培养基；要求实验环境为紫外线灭菌的无菌室。1990版版 与与

7、85年版相同年版相同1995版版 开始要求对培养基进行灵敏度检查。开始要求对培养基进行灵敏度检查。2000版版 规定实验环境为规定实验环境为100级洁净度；检验数量从级洁净度；检验数量从2支支/瓶增加为瓶增加为 611支支/瓶；明确薄膜过滤法为首选方法包括大容量液体样品瓶；明确薄膜过滤法为首选方法包括大容量液体样品 首次引用、收载全封闭过滤技术。首次引用、收载全封闭过滤技术。对比国际无菌检查发展历史对比国际无菌检查发展历史，我我国国2000版以前药典无菌检查法因技版以前药典无菌检查法因技术和认识的不足，对术和认识的不足，对提高方法捡出提高方法捡出率、保证检验结果的准确性、可靠率、保证检验结果的

8、准确性、可靠性方面的规定性方面的规定与先进国家药典中的与先进国家药典中的要求严重脱节。要求严重脱节。2005版无菌检查法取得长足发展版无菌检查法取得长足发展 实验环境要求实验环境要求、验证试验、验证试验、延长培养延长培养时间至少为时间至少为14天、以一次检出为准，取消天、以一次检出为准，取消复试等亮点。复试等亮点。是是2005年版药典无菌检查法的大步发展，年版药典无菌检查法的大步发展，从而使从而使2005年版无菌检查法比历版无菌检年版无菌检查法比历版无菌检查法有了突破性的提高。查法有了突破性的提高。基本与国际先进基本与国际先进药典无菌检查法接轨。药典无菌检查法接轨。2010年版年版药典无菌检查

9、法的发展，主要是药典无菌检查法的发展，主要是在总结和巩固实施验证试验以来所取得经验在总结和巩固实施验证试验以来所取得经验及认识的基础上，作及认识的基础上，作两方面两方面的发展：的发展：一、附录无菌检查法（一部附录一、附录无菌检查法（一部附录 B）（二部附录（二部附录 H）（三部附录（三部附录 A A）围绕着保证实验结果的准确性、可靠性作围绕着保证实验结果的准确性、可靠性作进进一步的增、修订。一步的增、修订。二、品种各论中二、品种各论中【无菌无菌】各论化的发展各论化的发展一、附录无菌检查法中的一、附录无菌检查法中的增、修订增、修订n（一）总则部分（一）总则部分n（二）培养基部分（二）培养基部分n

10、（三）灵敏度检查部分（三）灵敏度检查部分n（四）稀释液、冲洗液部分（四）稀释液、冲洗液部分n（五）方法验证部分（五）方法验证部分n（六）薄膜过滤法部分（六）薄膜过滤法部分n（七）培养及观察部分（七）培养及观察部分n（八）（八）结果判断部分结果判断部分n（九）（九）表表1、表、表2和表和表3n （一）（一）总则部分总则部分 新增规定新增规定1、“防止污染的措施不得影响供试品中防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。微生物的检出。”2、“日常检验还需要对环境进行监控。日常检验还需要对环境进行监控。”3、“无菌检查人员必须具备微生物专业无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。知

11、识，并经过无菌技术的培训。n （二）（二）培养基部分培养基部分1、删除：删除：硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基 后括后括号号（用于培养好氧菌、厌氧菌）（用于培养好氧菌、厌氧菌）的说明的说明2、删除：删除：改良马丁培养基改良马丁培养基 后括号后括号（用（用于培养真菌）于培养真菌）的说明的说明3、删除：删除：选择性培养基项下加入适量中选择性培养基项下加入适量中和剂或表面活性剂和剂或表面活性剂“如对氨基苯甲酸如对氨基苯甲酸（用于磺胺类供试品）、聚山梨酯（用于磺胺类供试品）、聚山梨酯80（用于非水溶性供试品）或（用于非水溶性供试品）或-内酰胺酶内酰胺酶（用于（用于-内酰胺类供试品）内酰胺类供试

12、品）”等等说明。说明。修订为：修订为：在培养基灭菌或使用前加入适宜的中在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同验和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同验证试验。证试验。增订：增订：表表1 常见干扰物的中和剂或灭活方法常见干扰物的中和剂或灭活方法 (见微生物限度检查法中）见微生物限度检查法中）干扰物干扰物可选用的中和剂或灭活方法可选用的中和剂或灭活方法 戊二醛戊二醛酚类、乙醇、吸附物酚类、乙醇、吸附物醛类醛类季铵类化合物（季铵类化合物（QACs）、）、对羟基苯甲酸酯对羟基苯甲酸酯汞类制剂汞类制剂双胍类化合物双胍类化合物碘酒、洗必泰类碘酒、洗必泰类卤化物卤化物乙二胺四乙酸（乙

13、二胺四乙酸（EDTA）磺胺类磺胺类-内酰胺类抗生素内酰胺类抗生素亚硫酸氢纳亚硫酸氢纳稀释法稀释法稀释法、甘氨酸、硫代硫酸盐稀释法、甘氨酸、硫代硫酸盐卵磷脂、聚山梨酯卵磷脂、聚山梨酯亚硫酸氢纳、巯基乙酸盐、硫代硫酸盐亚硫酸氢纳、巯基乙酸盐、硫代硫酸盐卵磷脂卵磷脂聚山梨酯聚山梨酯硫代硫酸盐硫代硫酸盐镁或钙离子镁或钙离子对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸-内酰胺酶内酰胺酶表表1 常见干扰物的中和剂或灭活方法常见干扰物的中和剂或灭活方法 4、将原排列第、将原排列第 6.的的 0.5%葡萄糖肉汤培养葡萄糖肉汤培养基（用于硫酸链霉素等抗生素的无菌检基（用于硫酸链霉素等抗生素的无菌检查）查）修订排列为修订排列为第第

14、4.按顺序归类培养基按顺序归类培养基1.4.均为直接用均为直接用于无菌检查的液体培养基。于无菌检查的液体培养基。n（三）（三）培养基灵敏度检查部分培养基灵敏度检查部分1、在菌液制备中，、在菌液制备中，修订修订黑曲霉的孢子悬液黑曲霉的孢子悬液制备方法：规定应使用含制备方法：规定应使用含0.05（v/v）聚山梨酯聚山梨酯80的的0.9无菌氯化钠溶液，无菌氯化钠溶液，洗洗脱脱孢子及孢子及稀释稀释孢子液，制成每孢子液，制成每1ml中含孢中含孢子数小于子数小于100 cfu的孢子悬液。的孢子悬液。删除了：删除了：（用管口带有薄的无菌棉花或纱（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）布能过滤

15、菌丝的无菌毛细吸管）吸出孢子吸出孢子悬液的操作方法悬液的操作方法2、新增加新增加稀释后的工作用菌液的保存条稀释后的工作用菌液的保存条件和保存期限：件和保存期限：菌液制备后菌液制备后“若在室温下放置，应若在室温下放置，应在在2小时内使用，若保存在小时内使用，若保存在28，可，可在在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在保存在28，在验证过的贮存期，在验证过的贮存期内使用。内使用。”n（四）（四）稀释液、冲洗液及其制备方稀释液、冲洗液及其制备方法部分法部分 原有原有 1.0.1%蛋白胨水溶液蛋白胨水溶液 2.pH7.0氯化钠氯化钠-蛋白胨缓冲液蛋白胨缓冲液新增加：新增加

16、：可根据供试品的特性，选用其他经验证可根据供试品的特性，选用其他经验证过的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液。过的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液。n（五）（五）方法验证试验部分方法验证试验部分1、验证试验用菌种及菌液制备在培养基、验证试验用菌种及菌液制备在培养基灵敏度所用菌种的基础上，灵敏度所用菌种的基础上，删除删除铜绿假铜绿假单胞菌，单胞菌，增订增订大肠埃希菌。大肠埃希菌。是因在验证试验的实践中，发现作是因在验证试验的实践中，发现作为革兰氏阴性杆菌代表的铜绿假单胞菌为革兰氏阴性杆菌代表的铜绿假单胞菌在验证试验中对大部分抗生素不敏感，在验证试验中对大部分抗生素不敏感，而大肠埃希菌对抗革兰氏阴性杆菌为主

17、而大肠埃希菌对抗革兰氏阴性杆菌为主的抗生素敏感性较好。的抗生素敏感性较好。2、验证试验中样品用量的规定：、验证试验中样品用量的规定：删除了删除了原：原：“将规定量供试品按将规定量供试品按”修订为修订为 薄膜过滤法：薄膜过滤法：“取每种培养基规定接种的供试品总量取每种培养基规定接种的供试品总量按按 薄膜过滤法过滤薄膜过滤法过滤”直接接种法：直接接种法：“接入每支培养基规定的供试品接种量接入每支培养基规定的供试品接种量”明确了验证试验所需样品量是供试品明确了验证试验所需样品量是供试品的检验量而不是供试品的检验数量。的检验量而不是供试品的检验数量。n（六）（六）供试品的无菌检查部分供试品的无菌检查部

18、分1、阳性对照用量的修订：阳性对照用量的修订：原：原：“若采用直接接种法，应增加供试品若采用直接接种法，应增加供试品1支支（或瓶）作阳性对照用。（或瓶）作阳性对照用。”修订为修订为：若采用直接接种法，应增加供试品若采用直接接种法，应增加供试品无菌检查时每个培养基容器接种的样品量作无菌检查时每个培养基容器接种的样品量作阳性对照用。阳性对照用。因若是液体制剂，应该采用薄膜过滤法，因若是液体制剂，应该采用薄膜过滤法，若是固体制剂每管接种量可能不止若是固体制剂每管接种量可能不止1支（或支（或瓶），应按验证的方法确定。瓶），应按验证的方法确定。2、薄膜过滤法中的增、修订：薄膜过滤法中的增、修订：2.1

19、新增规定：新增规定：抗生素供试品应选择低吸抗生素供试品应选择低吸附的滤器及滤膜附的滤器及滤膜2.2 新增规定：新增规定：对每片滤膜的总冲洗量不对每片滤膜的总冲洗量不得过得过1000ml2.3 新增规定：新增规定：所用冲洗量、冲洗方法同所用冲洗量、冲洗方法同验证试验验证试验 2.4 修订：修订：无菌气（喷）雾剂供试品的无菌气（喷）雾剂供试品的检验方法：检验方法：规定置至少规定置至少-20冰室冷冻冰室冷冻1小时。并小时。并新新增增开启容器后开启容器后“将供试品转移至无菌容将供试品转移至无菌容器中器中”的操作步骤。的操作步骤。2.5 修订：修订：装有药物的注射器供试品的装有药物的注射器供试品的检验方

20、法：检验方法：删除删除 原原“装上无菌针头（非包装中所装上无菌针头（非包装中所配带的）配带的）”修订为修订为“取规定量，排出注射器中的内取规定量，排出注射器中的内容物，若需要可吸入稀释液或标签所示容物，若需要可吸入稀释液或标签所示的溶剂溶解，直接过滤，的溶剂溶解，直接过滤，”没有必要将原装配好的针头取下来针头取下来 3、直接接种法中的增、修订：直接接种法中的增、修订：删除了删除了原直接接种法中原直接接种法中-内酰胺类或内酰胺类或黄胺类供试品项黄胺类供试品项。因该两类供试品的无菌检查以采因该两类供试品的无菌检查以采用薄膜过滤法加中和剂更好。用薄膜过滤法加中和剂更好。4、培养及观察中的增、修订：培

21、养及观察中的增、修订：对于培养对于培养14天后，不能从外观上判断天后，不能从外观上判断有无微生物生长时，有无微生物生长时，删除了：删除了：“或划线接种于斜面培养基上或划线接种于斜面培养基上”的规定。的规定。必然删除：必然删除：可根据斜面是否有菌生长而可根据斜面是否有菌生长而判断的规定。判断的规定。（七）结果判断部分（七）结果判断部分新增订：新增订：阳性对照管应生长良好，阴性阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。否则，试验无对照管不得有菌生长。否则，试验无效。效。强调阳性对照、阴性对照在无菌检强调阳性对照、阴性对照在无菌检查实验成立与否中的作用。查实验成立与否中的作用。n（八）（八）表表

22、1、表、表2和表和表3部分部分 表表1将表将表1第第3列的表题原列的表题原“每种培养基最少检验每种培养基最少检验数量数量”修订修订为为：“接种每种培养基所需的接种每种培养基所需的最少检验数量最少检验数量”更明确指出接种到培养基中去的检验量。更明确指出接种到培养基中去的检验量。修订了修订了表表1下的下的 注注:对供试品容器装量不够对供试品容器装量不够接种两种培养基的情况，明确规定最少检验接种两种培养基的情况，明确规定最少检验数量应加倍。数量应加倍。表表2n将表将表2原名称：原名称：“上市抽验样品（液体制剂）上市抽验样品（液体制剂）的最少检验数量的最少检验数量”修订修订为为：“液体制剂最少液体制剂

23、最少检验量及上市抽验样品的最少检验数量检验量及上市抽验样品的最少检验数量”明确液体制剂最少检验量见表明确液体制剂最少检验量见表2的第的第2列，列，供试品最少检验数量见表供试品最少检验数量见表2的第的第3列。列。修订了修订了表表2下的下的 注注:对供试品容器装量对供试品容器装量不够接种两种培养基的情况，明确规定最少不够接种两种培养基的情况，明确规定最少检验数量应加倍。检验数量应加倍。表表3 将表将表3原名称：原名称：“上市抽验样品（固体制剂）上市抽验样品（固体制剂）的最少检验量的最少检验量”修订修订为为：“固体制剂最少检固体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验数量验量及上市抽验样品的最少检验数

24、量”明确固体制剂最少检验量见表明确固体制剂最少检验量见表3第第2列；供列；供试品最少检验数量见表试品最少检验数量见表3的第的第3列。列。修订了修订了表表3下的下的 注注:对供试品容器装量不对供试品容器装量不够接种两种培养基的情况，明确规定最少检验够接种两种培养基的情况，明确规定最少检验数量应加倍。数量应加倍。n二、各论中二、各论中【无菌无菌】各论化的发各论化的发展展 举例如下：举例如下：l乙酰谷酰胺注射液、丁溴东莨菪碱注射液乙酰谷酰胺注射液、丁溴东莨菪碱注射液 无菌：取本品，经薄膜过滤法处理，用无菌：取本品，经薄膜过滤法处理，用0.1无菌蛋白胨水溶液分次冲洗（每膜无菌蛋白胨水溶液分次冲洗（每膜

25、不少于不少于100ml），以金黄色葡萄球菌为阳），以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌，依法检查（附录性对照菌，依法检查（附录H），应符），应符合规定。合规定。举例如下：举例如下：l头孢曲松钠、头孢拉定、头孢哌酮钠、头孢硫脒、头孢曲松钠、头孢拉定、头孢哌酮钠、头孢硫脒、注射用阿莫西林钠克拉维酸钾、盐酸林可霉素注射液注射用阿莫西林钠克拉维酸钾、盐酸林可霉素注射液 无菌：取本品，用适宜溶剂溶解后转移至不少于无菌：取本品，用适宜溶剂溶解后转移至不少于500ml的的0.9%无菌氯化钠溶液中，用薄膜过滤法处理无菌氯化钠溶液中，用薄膜过滤法处理后，依法检查（附录后，依法检查（附录H），应符合规定。），应符合规定。

26、l氧氟沙星氯化钠注射液氧氟沙星氯化钠注射液 无菌：取本品，经薄膜过滤法处理，用无菌：取本品，经薄膜过滤法处理，用0.1无菌蛋无菌蛋白胨水溶液分次冲洗（每膜不少于白胨水溶液分次冲洗（每膜不少于500ml）每管培养）每管培养基中加入基中加入0.1mol/L硫酸锰溶液硫酸锰溶液1ml,以大肠埃希菌为阳以大肠埃希菌为阳性对照菌，依法检查（附录性对照菌，依法检查（附录H），应符合规定。），应符合规定。微生物微生物限度检查增修定内容限度检查增修定内容 修改内容修改内容 1、培养条件、培养条件 控制菌培养温度控制菌培养温度3537修改为修改为3035(细菌、控制菌细菌、控制菌培养培养温度相同温度相同)。修改

27、理由修改理由 此此温度适于所有中温菌生长，温度适于所有中温菌生长，一些高温菌在该温度下也一些高温菌在该温度下也可以生长可以生长。增修订内容增修订内容 2、结果报告、结果报告 特殊品种可以最小包装特殊品种可以最小包装单单位报告位报告 特殊品种包括特殊品种包括 药典药典规定规定微量包装微量包装药品的检验量药品的检验量可以酌可以酌减。减。还还有一些有一些贵重贵重药品也应考虑药品也应考虑检验量。检验量。3、检验量增修订内容、检验量增修订内容 中药膜剂检验量中药膜剂检验量50 cm2 修改为修改为100cm2。沙门菌检验量沙门菌检验量修改为修改为检验量为检验量为20 g或或20ml并注明（其中并注明（其

28、中10 g用于阳性对照）。用于阳性对照）。4、供试液的制备增修订内容、供试液的制备增修订内容 供试品检查时使用表面活性剂应证明供试品检查时使用表面活性剂应证明其对微生物其对微生物生长和存活无影响生长和存活无影响修改为修改为无无毒性毒性。供试液的制备供试液的制备若需若需（水浴）（水浴）（删除水（删除水浴两字）浴两字）加温加温时，可采用时，可采用其他经验证其他经验证的的方法，但应均匀加热，且温度不方法，但应均匀加热，且温度不应超过应超过45。新增贴剂供试液制备新增贴剂供试液制备 取规定量供试品，去掉贴剂的保护层，取规定量供试品，去掉贴剂的保护层，放置在无菌玻璃或塑料片上，粘贴面朝上。放置在无菌玻璃

29、或塑料片上，粘贴面朝上。用适宜的无菌多孔材料（如无菌纱布）覆用适宜的无菌多孔材料（如无菌纱布）覆盖贴剂的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起。盖贴剂的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起。然后将其置于适宜体积并含有灭活剂（如然后将其置于适宜体积并含有灭活剂（如聚山梨酯聚山梨酯8080或卵磷脂）的稀释剂中，用力或卵磷脂）的稀释剂中，用力振荡至少振荡至少3030分钟，或以其他方法制备成供分钟，或以其他方法制备成供试液。试液。具抑菌活性的供试品增修订内容具抑菌活性的供试品增修订内容 删除删除应应消除供试液的抑菌活性消除供试液的抑菌活性修改为修改为当供当供试品具有抑菌活性时，应尽量选择操作简试品具有抑菌活性时，应尽量选择

30、操作简便、快速的方法，应避免损伤供试品中污便、快速的方法，应避免损伤供试品中污染的微生物。在供试品溶液性状允许的情染的微生物。在供试品溶液性状允许的情况下，应尽量选用况下，应尽量选用薄膜过滤法。薄膜过滤法。离心沉淀集菌法离心沉淀集菌法 两次离心两次离心修改修改为为一次离心；一次离心；500转转/分离分离心，不超过心，不超过3分钟，取全部上清液用于检分钟，取全部上清液用于检查。查。影响因素影响因素 供试品供试品 污染菌特性污染菌特性 适用范围适用范围 仅使用于微生物限度检查供试液的制备。仅使用于微生物限度检查供试液的制备。尽量避免使用，不可使用快速离心。尽量避免使用，不可使用快速离心。细菌细菌、

31、霉菌及酵母菌计数增修订内容、霉菌及酵母菌计数增修订内容新增新增计数培养基的适用性检查计数培养基的适用性检查 菌种菌种 大肠埃希菌（大肠埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B）44102 金黄色葡萄球菌（金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B）26 003 枯草芽孢杆菌（枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CMCC（B）63 501 白色念珠菌（白色念珠菌（Candida albicans）CMCC（F）98 001 黑曲霉（黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC（F）98 003 增加了增加了菌悬液的制备及保存条件。

32、菌悬液的制备及保存条件。菌悬液制备后在室温下放置应在菌悬液制备后在室温下放置应在2小时内使用，若保存在小时内使用，若保存在28可以可以在在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在可保存在 28，在验证过的贮存，在验证过的贮存期内使用，每株试验菌平行制备期内使用，每株试验菌平行制备2个个平皿，混匀，凝固，按规定条件培养平皿，混匀，凝固，按规定条件培养计数，同时用相应的对照培养基替代计数，同时用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。被检培养基进行上述试验。增加了增加了对照培养。对照培养。2.新新增增常见干扰物的中和剂常见干扰物的中和剂和和灭活灭活方法方法 参见参见 表

33、表1常见干扰物的中和剂或灭常见干扰物的中和剂或灭活方法活方法干扰物干扰物可选用的中和剂或灭活方法可选用的中和剂或灭活方法 戊二醛戊二醛酚类、乙醇、吸附物酚类、乙醇、吸附物醛类醛类季铵类化合物（季铵类化合物（QACs）、）、对羟基苯甲酸酯对羟基苯甲酸酯汞类制剂汞类制剂双胍类化合物双胍类化合物碘酒、洗必泰类碘酒、洗必泰类卤化物卤化物乙二胺四乙酸（乙二胺四乙酸（EDTA）磺胺类磺胺类-内酰胺类抗生素内酰胺类抗生素亚硫酸氢纳亚硫酸氢纳稀释法稀释法稀释法、甘氨酸、硫代硫酸盐稀释法、甘氨酸、硫代硫酸盐卵磷脂、聚山梨酯卵磷脂、聚山梨酯亚硫酸氢纳、巯基乙酸盐、硫代硫酸盐亚硫酸氢纳、巯基乙酸盐、硫代硫酸盐卵磷脂

34、卵磷脂聚山梨酯聚山梨酯硫代硫酸盐硫代硫酸盐镁或钙离子镁或钙离子对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸-内酰胺酶内酰胺酶表表1 常见干扰物的中和剂或灭活方法常见干扰物的中和剂或灭活方法 6、供试品检查增修订内容、供试品检查增修订内容 平皿法平皿法 删去删去采用平皿法进行菌数采用平皿法进行菌数测定时，连续测定时，连续23个稀释级的供试个稀释级的供试液。液。修改为修改为按计数方法的验证试验确认按计数方法的验证试验确认的程序进行供试液制备。的程序进行供试液制备。培养时间培养时间修改内容修改内容 除另有规定外，细菌培养除另有规定外，细菌培养48小时小时改为改为3天天，霉菌、酵母菌培养，霉菌、酵母菌培养72小时小时改为

35、改为 5天天，必要时，可适必要时，可适当延长培养时间至当延长培养时间至7天进行菌落计天进行菌落计数并报告数并报告。菌数报告规则菌数报告规则增修订内容增修订内容 若同稀释级两个平板的菌落平均若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于数不小于15，则两个平板的菌落数，则两个平板的菌落数不能相差不能相差1倍或以上。倍或以上。细菌细菌、酵母菌和、酵母菌和霉菌霉菌平均平均菌落数菌落数在在30300、30100之间之间的稀释级的稀释级修改为修改为选取菌落数选取菌落数小于小于300cfu（细（细菌）菌）和和100cfu（霉菌）的（霉菌）的稀释级稀释级作作为菌数报告的依据。为菌数报告的依据。薄膜过滤法增修订内容薄膜

36、过滤法增修订内容 新增内容新增内容 采用其它直径的滤膜，冲采用其它直径的滤膜，冲洗量应相应的进行调整洗量应相应的进行调整（如（如使用膜使用膜直径增大冲洗液量也应相应增加，直径增大冲洗液量也应相应增加，可保证冲洗液覆盖整个滤膜）。可保证冲洗液覆盖整个滤膜）。删去删去每片滤膜的总过滤量不宜过大，每片滤膜的总过滤量不宜过大，修改为修改为总冲洗量不得超过总冲洗量不得超过1000ml。7、控制菌检查增修订、控制菌检查增修订增加控制菌检查用培养基的适用性增加控制菌检查用培养基的适用性检查检查；检查项目包括检查项目包括促生长、促生长、抑制及指示能抑制及指示能力检查，参照表力检查，参照表2 新增培养基新增培养

37、基适用性检查适用性检查方法方法液体液体培养基培养基促生长能力检查促生长能力检查。固体固体培养基培养基促生长能力检查促生长能力检查。培养基抑制能力检查培养基抑制能力检查。液体液体培养基培养基指示能力检查指示能力检查。固体固体培养基培养基指示能力检查。指示能力检查。试验结果与对照培养基比较试验结果与对照培养基比较控制菌检查用培养基的适用性检查控制菌检查用培养基的适用性检查控制菌检查用培养基的促生长、抑制及指示能力检查控制菌检查用培养基的促生长、抑制及指示能力检查控制菌检查控制菌检查 培养基培养基 特性特性 试验菌株试验菌株大肠埃希菌大肠埃希菌 胆盐乳糖胆盐乳糖 促生长能力促生长能力 大肠埃希菌大肠

38、埃希菌 抑制能力抑制能力 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 MUG 促生长能力促生长能力+指示能力指示能力 大肠埃希菌大肠埃希菌 曙红亚甲蓝曙红亚甲蓝 或麦康凯或麦康凯 促生长能力促生长能力+指示能力指示能力 大肠埃希菌大肠埃希菌大肠菌群大肠菌群 乳糖胆盐乳糖胆盐 促生长能力促生长能力 大肠埃希菌大肠埃希菌 抑制能力抑制能力 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 乳糖发酵乳糖发酵 促生长能力促生长能力+指示能力指示能力 大肠埃希菌大肠埃希菌 曙红亚甲蓝曙红亚甲蓝 或麦康凯或麦康凯 促生长能力促生长能力+指示能力指示能力 大肠大肠埃希菌埃希菌 沙门菌沙门菌 营养肉汤营养肉汤 促生长能力促生长能力 乙型付伤寒

39、沙门菌乙型付伤寒沙门菌 四硫磺酸钠亮绿四硫磺酸钠亮绿 促生长能力促生长能力 乙型付伤寒沙门菌乙型付伤寒沙门菌 抑制能力抑制能力 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 胆盐硫乳琼脂或沙门、胆盐硫乳琼脂或沙门、志贺氏属琼脂培养基志贺氏属琼脂培养基 促生长能力促生长能力+指示能力指示能力 乙型付伤寒沙门菌乙型付伤寒沙门菌 曙红亚甲蓝琼脂曙红亚甲蓝琼脂 或麦康凯琼脂或麦康凯琼脂 培养基培养基 促生长能力促生长能力+指示能力指示能力 乙型付伤寒沙门菌乙型付伤寒沙门菌 三糖铁琼脂三糖铁琼脂 培养基培养基 指示能力指示能力 乙型付伤寒沙门菌乙型付伤寒沙门菌铜绿假单铜绿假单 胆盐乳糖胆盐乳糖 促生长能力促生长能力 铜

40、绿假单胞菌铜绿假单胞菌胞菌胞菌 抑制能力抑制能力 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 溴化十六烷基三溴化十六烷基三 促生长能力促生长能力 铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌 甲铵琼脂甲铵琼脂 抑制能力抑制能力 大肠埃希菌大肠埃希菌 绿脓菌素测定绿脓菌素测定 用培养基用培养基 促生长能力促生长能力+指示能力指示能力 铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌金黄色葡金黄色葡 亚碲酸盐肉汤亚碲酸盐肉汤 促生长能力促生长能力 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 萄球菌萄球菌 抑制能力抑制能力 大肠埃希菌大肠埃希菌 卵黄氯化钠琼脂促生长能力卵黄氯化钠琼脂促生长能力+指示能力指示能力 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 或甘露醇盐琼脂或甘露醇盐琼脂

41、 抑制能力抑制能力 大肠埃希菌大肠埃希菌梭菌梭菌 梭菌增菌培养基梭菌增菌培养基 促生长能力促生长能力 生孢梭菌生孢梭菌 哥伦比亚琼脂哥伦比亚琼脂 促生长能力促生长能力 生孢梭菌生孢梭菌 白色念白色念 沙氏葡萄糖肉汤沙氏葡萄糖肉汤 促生长能力促生长能力 白色念珠菌白色念珠菌珠菌珠菌 沙氏葡萄糖琼脂沙氏葡萄糖琼脂 促生长能力促生长能力+指示能力指示能力 白色念珠菌白色念珠菌 念珠菌显色培养基念珠菌显色培养基 促生长能力促生长能力+指示能力指示能力 白色念珠菌白色念珠菌 吐温吐温80玉米琼脂玉米琼脂 促生长能力促生长能力+指示能力指示能力 白色念珠菌白色念珠菌控制控制菌检查法增修订内容菌检查法增修订

42、内容疑似疑似致病菌的确证致病菌的确证微生物控制菌检查中没有规定进一步微生物控制菌检查中没有规定进一步确证疑似致病菌的方法确证疑似致病菌的方法。选择。选择已被认可已被认可的菌种的菌种鉴定方法。如鉴定方法。如伯杰氏细菌鉴定伯杰氏细菌鉴定手手。控制控制菌检查方法验证菌检查方法验证 删去删去阴性菌阴性菌对照组。对照组。大肠大肠菌群菌群检查用胆盐乳糖培检查用胆盐乳糖培养基养基改为改为乳糖胆盐。乳糖胆盐。改改梭菌检查用梭菌检查用庖肉培养基为庖肉培养基为梭菌增菌梭菌增菌培养基。培养基。改改梭菌梭菌培养时间培养时间7296小时小时为为48小时小时。增加增加了白色念珠菌检验方法了白色念珠菌检验方法 增菌培养增菌

43、培养 沙氏葡萄糖沙氏葡萄糖肉汤培养基。肉汤培养基。分离培养分离培养 划线接种于沙氏葡萄糖琼脂划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基平板上。平板上。鉴定试验鉴定试验 典型菌落典型菌落 沙氏葡萄糖琼脂培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基 菌落菌落呈乳白色偶见淡黄色，表面光滑呈乳白色偶见淡黄色，表面光滑有浓有浓 酵母气味，时间稍久酵母气味，时间稍久则菌落增大，则菌落增大，颜颜色变色变 深、质地深、质地变硬或有皱摺。变硬或有皱摺。念珠念珠菌显菌显色培养基色培养基 菌落呈绿色菌落呈绿色或翠绿色或翠绿色菌落生长。菌落生长。确认试验确认试验取取1%吐温吐温80-玉米琼脂玉米琼脂 培养基培养基培养物进行染色，镜检培养物进

44、行染色，镜检及芽管及芽管 试验试验。结果判断结果判断非革非革兰阳性菌兰阳性菌，显微镜下未见厚，显微镜下未见厚膜孢子膜孢子、假假菌丝、菌丝、芽管判未检出芽管判未检出白色念珠菌。白色念珠菌。新新增微生物限度检查法指导原增微生物限度检查法指导原则则一、抑菌剂效力检查法指导原则一、抑菌剂效力检查法指导原则二、药品微生物检验替代方法二、药品微生物检验替代方法验证验证指指 导导原则原则三、微生物限度检查法应用指导原三、微生物限度检查法应用指导原则则四、药品微生物实验室规范指导原四、药品微生物实验室规范指导原则则 一、抑抑菌剂效力检查法指导原则菌剂效力检查法指导原则 指导指导原则原则的目的的目的 是是为测定

45、灭菌、非灭菌制剂中抑菌剂的活为测定灭菌、非灭菌制剂中抑菌剂的活性，以评价最终产品的抑菌效力及生产企业在性，以评价最终产品的抑菌效力及生产企业在制剂研发阶段抑菌剂的确定提供指导。制剂研发阶段抑菌剂的确定提供指导。为为防止药品由于微生物污染而引起变质，防止药品由于微生物污染而引起变质，对服用者造成不良反应对服用者造成不良反应，在，在药品生产过程中加药品生产过程中加入一定剂量入一定剂量的抑菌剂。的抑菌剂。抑菌剂抑菌剂不能用于替代药品生产的不能用于替代药品生产的GMP管理，管理，不能作为非灭菌制剂降低微生物污染的唯一途不能作为非灭菌制剂降低微生物污染的唯一途径，也不能作为控制多剂量包装制剂灭菌前的径，

46、也不能作为控制多剂量包装制剂灭菌前的生物负载的手段。生物负载的手段。使使用范围及原则用范围及原则 使使用范围用范围 如果药物本身不具有如果药物本身不具有充分的抗菌活性，应根据制剂特充分的抗菌活性，应根据制剂特性添加适宜的抑菌剂，以防止制性添加适宜的抑菌剂，以防止制剂在正常贮藏和使用过程中可能剂在正常贮藏和使用过程中可能发生的微生物污染和繁殖发生的微生物污染和繁殖，对患，对患者造成伤害。者造成伤害。使使用原则用原则 所有所有抑菌剂都具有一定的毒性，添抑菌剂都具有一定的毒性，添加抑菌剂时应注意以下原则加抑菌剂时应注意以下原则:抑抑菌剂的用量应为最低有效菌剂的用量应为最低有效量。量。具具有抗菌活性的

47、有抗菌活性的制剂应制剂应确认其抗菌确认其抗菌效力。效力。应验证最终容器中的抑菌剂效力应验证最终容器中的抑菌剂效力在效期内不因贮藏条件而降低。在效期内不因贮藏条件而降低。本试验方法和抑菌剂抑菌效力判本试验方法和抑菌剂抑菌效力判断标准用于包装未启开的成品制剂。断标准用于包装未启开的成品制剂。抑抑菌剂抑菌效力的测定菌剂抑菌效力的测定 供试品的分类供试品的分类 分为四类，但对于一些抗酸性制分为四类，但对于一些抗酸性制剂和含活生物制剂应考虑会降低剂和含活生物制剂应考虑会降低有益菌的生物活性。见表有益菌的生物活性。见表1 表表1 产品分类产品分类 类别类别 药品药品 1 类类 注射剂、注射剂、其他非肠道制

48、剂，其他非肠道制剂，包括包括 乳剂、耳用制剂、无菌鼻用制剂及眼乳剂、耳用制剂、无菌鼻用制剂及眼 用制剂用制剂 2 类类 局部给药制剂、非灭菌鼻用制剂及用于局部给药制剂、非灭菌鼻用制剂及用于 黏膜的乳剂黏膜的乳剂 3 类类 口服非固体制剂（非抗酸制剂）口服非固体制剂（非抗酸制剂）4 类类 非固体抗酸制剂非固体抗酸制剂 培培养基养基 培培养基的制备养基的制备 胰酪胨大豆肉汤琼脂培养基胰酪胨大豆肉汤琼脂培养基 胰酪胨大豆肉汤培养基胰酪胨大豆肉汤培养基 沙氏葡萄糖肉汤培养基沙氏葡萄糖肉汤培养基 培培养基的适用性检查养基的适用性检查 同控制同控制菌培养基菌培养基 的的适用性检查适用性检查抑菌剂效力测定方

49、法抑菌剂效力测定方法 菌种菌种 菌液制备菌液制备 菌种菌种 同培养基适用性检查，制剂中常见同培养基适用性检查，制剂中常见的污的污 染微生物也可作为试验菌。染微生物也可作为试验菌。菌液制备菌液制备 制成每制成每1ml含菌数约为含菌数约为108cfu的菌悬液。的菌悬液。供试品接种供试品接种影响因素给予指导影响因素给予指导 容器的材质、形状、体积、封口方式及容器的材质、形状、体积、封口方式及容器的容器的PH等分别给予了指导等分别给予了指导。接种菌量接种菌量 接种菌液的体积不得超接种菌液的体积不得超过供试品体积的过供试品体积的0.5%1%。放置放置 2025，避光贮存，贮存避光贮存，贮存温度的变化应尽

50、可能控制在最小范围，温度的变化应尽可能控制在最小范围，并防止被污染。并防止被污染。存活菌数测定存活菌数测定 采用经验证的方法进行试验，采用经验证的方法进行试验，计算计算1ml(g)供试品各试验菌所得供试品各试验菌所得的菌数及各间隔时间的菌数，并的菌数及各间隔时间的菌数，并换算成换算成lg值。值。结果判断结果判断 结果符合表结果符合表3要求要求，可判断该产品抑可判断该产品抑菌效力符合规定。菌效力符合规定。表表3 抑菌剂抑菌效力判断标准抑菌剂抑菌效力判断标准 1 类类 供供 试试 品品 细菌细菌 7天菌数下降不少于天菌数下降不少于1.0 lg，14天菌数下降不少于天菌数下降不少于 3.0lg,14