《菌株的选育》PPT课件.ppt

1、 第三节第三节 抗噬菌体菌株的选育抗噬菌体菌株的选育（一）（一）噬菌体的分布噬菌体的分布 广泛存在于土壤、肥料、粪便和污水中。有广泛存在于土壤、肥料、粪便和污水中。有寄主细胞的地方，易找到其噬菌体。寄主细胞的地方，易找到其噬菌体。病人外科疮口脓液：金黄色葡萄球菌噬菌体；病人外科疮口脓液：金黄色葡萄球菌噬菌体；受细菌病害植株受细菌病害植株 细菌发酵工厂污水和土壤（情况严重时，甚细菌发酵工厂污水和土壤（情况严重时，甚至从空气中亦能分离到噬菌体）。至从空气中亦能分离到噬菌体）。（1）抗噬菌体菌株选育方法）抗噬菌体菌株选育方法 a 自然突变自然突变 以噬菌体为筛子，敏感菌株孢子自然突变以噬菌体为筛子，

2、敏感菌株孢子自然突变为抗性菌株（抗性突变频率低）。为抗性菌株（抗性突变频率低）。（二）（二）抗噬菌体菌株的选育抗噬菌体菌株的选育 b 诱发突变诱发突变 诱变处理过的敏感菌株孢子液分离在高浓度噬菌体诱变处理过的敏感菌株孢子液分离在高浓度噬菌体平板上，长出的菌落为抗性变异株；生长速度一般与正平板上，长出的菌落为抗性变异株；生长速度一般与正常菌落相近。常菌落相近。诱变后敏感菌孢子接入种子培养基，菌丝长浓后加诱变后敏感菌孢子接入种子培养基，菌丝长浓后加入高浓度噬菌体再培养几天，加入噬菌体反复感染，敏入高浓度噬菌体再培养几天，加入噬菌体反复感染，敏感菌裂解，平板分离抗性株。感菌裂解，平板分离抗性株。（2

3、）抗噬菌体菌株的特性试验）抗噬菌体菌株的特性试验 a 抗噬菌体性状稳定性试验抗噬菌体性状稳定性试验 抗性菌株分别在抗性菌株分别在孢子培养孢子培养、种子培养种子培养和和发酵发酵培养培养过程中用点滴法或双层琼脂法测定噬菌斑。过程中用点滴法或双层琼脂法测定噬菌斑。如都不出现噬菌斑，说明该菌株对此噬菌体具有如都不出现噬菌斑，说明该菌株对此噬菌体具有抗性。抗性。还可观察抗性菌株经多次传代后对还可观察抗性菌株经多次传代后对噬菌体的抗性是否稳定。噬菌体的抗性是否稳定。b 抗性菌株产量试验抗性菌株产量试验 抗噬菌体菌株生产能力不低于原敏感株。抗噬菌体菌株生产能力不低于原敏感株。一般抗性菌株与原敏感菌株在某些发

4、酵特性方一般抗性菌株与原敏感菌株在某些发酵特性方面会有些改变。因此，要考察它对碳源、氮源、通面会有些改变。因此，要考察它对碳源、氮源、通气量、无机磷添加量及其他培养条件的要求等。气量、无机磷添加量及其他培养条件的要求等。c 抗性与溶源性的区别试验抗性与溶源性的区别试验 菌株的抗噬菌体特性具有相对遗传稳定性菌株的抗噬菌体特性具有相对遗传稳定性 抗性机理：抗性机理：改变细胞壁结构阻止噬菌体吸附侵入，改变细胞壁结构阻止噬菌体吸附侵入，改变生理代谢使噬菌体不能侵染，即使侵染后也不能增改变生理代谢使噬菌体不能侵染，即使侵染后也不能增殖释放，这些菌株具有真正的抗性。殖释放，这些菌株具有真正的抗性。溶源性菌

5、株不是真正抗性菌（原噬菌体）？溶源性菌株不是真正抗性菌（原噬菌体）？（三）（三）噬菌体的防治噬菌体的防治 感染噬菌体后的表观现象：感染噬菌体后的表观现象：畸形菌丝，菌体迅速消失，畸形菌丝，菌体迅速消失，pH值上升，发酵产物停值上升，发酵产物停止积累，甚至下降等现象。止积累，甚至下降等现象。链霉素、红霉素、万古霉素、金霉素、林可霉素、谷链霉素、红霉素、万古霉素、金霉素、林可霉素、谷氨酸、丙酮丁醇、山梨糖、碱性蛋白酶发酵过程中都会遭氨酸、丙酮丁醇、山梨糖、碱性蛋白酶发酵过程中都会遭到噬菌体侵染。到噬菌体侵染。（1）正确判断）正确判断 根据发酵中出现的异常现象。根据发酵中出现的异常现象。（2）普及有

6、关噬菌体知识）普及有关噬菌体知识（3）选育抗噬菌体菌株）选育抗噬菌体菌株（4）消灭噬菌体）消灭噬菌体 在感染噬菌体的发酵罐排气口及下水道喷洒药剂，在感染噬菌体的发酵罐排气口及下水道喷洒药剂，防止噬菌体扩散。车间内外定期喷洒药物。常用药物有防止噬菌体扩散。车间内外定期喷洒药物。常用药物有漂白粉、甲醛、石灰水漂白粉、甲醛、石灰水等。等。种子室尽量与外界减少接触，严格执行无菌操作，种子室尽量与外界减少接触，严格执行无菌操作，检查空气中有无噬菌体存在。检查空气中有无噬菌体存在。在噬菌体感染期间，车间内定时检查噬菌体分布情在噬菌体感染期间，车间内定时检查噬菌体分布情况，采取有效措施直至消灭为止。况，采取

7、有效措施直至消灭为止。（5）收集和保存噬菌体）收集和保存噬菌体 将生产上出现噬菌体收集保藏起来用作选育抗性将生产上出现噬菌体收集保藏起来用作选育抗性菌株及研究防治措施的材料和依据。菌株及研究防治措施的材料和依据。噬菌体以预防为主，筛选抗性菌株，保持环境卫噬菌体以预防为主，筛选抗性菌株，保持环境卫生，杜绝噬菌体滋生。生，杜绝噬菌体滋生。第四节第四节 杂交育种杂交育种概念概念：将两个基因型不同的菌株接合使遗传物质重将两个基因型不同的菌株接合使遗传物质重新组合，从中分离和筛选具有新性状的菌株。新组合，从中分离和筛选具有新性状的菌株。杂交育种目的：杂交育种目的：不同菌株的遗传物质进行交换和重组，获得杂

8、种菌株；不同菌株的遗传物质进行交换和重组，获得杂种菌株；不同菌株的优良性能集中于重组体中，克服长期用诱不同菌株的优良性能集中于重组体中，克服长期用诱变剂处理造成的菌株生活能力下降等缺陷；变剂处理造成的菌株生活能力下降等缺陷；通过杂交扩大变异范围，改变产品质量和产量，甚至通过杂交扩大变异范围，改变产品质量和产量，甚至出现新品种；出现新品种；分析杂交结果，总结遗传物质转移和传递规律，促进分析杂交结果，总结遗传物质转移和传递规律，促进遗传学理论的发展。遗传学理论的发展。互补的两种营养缺互补的两种营养缺陷型菌株的混合培养中陷型菌株的混合培养中将会有不再需要两种物将会有不再需要两种物质的重组子出现。质的

9、重组子出现。据此，据此，1946年第年第一次在大肠杆菌中发现一次在大肠杆菌中发现杂交行为。杂交行为。（一）（一）细菌杂交细菌杂交细菌存在杂交行为的实验证明：细菌存在杂交行为的实验证明：实验证明，把上述两种菌株分别接种到一个特制的实验证明，把上述两种菌株分别接种到一个特制的U形管的两端培养，中间放一片烧结玻璃，培养液可流通但形管的两端培养，中间放一片烧结玻璃，培养液可流通但把细菌隔开，把细菌隔开，MM上不会出现菌落，说明细胞接触是基因上不会出现菌落，说明细胞接触是基因重组的必要条件。重组的必要条件。细菌可通过细菌可通过F因子转移、转化和转导因子转移、转化和转导等发生基因重组等发生基因重组（杂交）

10、。（杂交）。细胞接触是基因重组的必要条件细胞接触是基因重组的必要条件 放线菌杂交是在细菌杂交基础上发展起来的。放线菌杂交是在细菌杂交基础上发展起来的。基因重组过程近似基因重组过程近似细菌细菌，育种方法有许多与，育种方法有许多与霉菌霉菌相似。相似。（二）（二）放线菌杂交育种放线菌杂交育种 放线菌只有一条放线菌只有一条环状染色体环状染色体，基因重组过程类似于，基因重组过程类似于大肠杆菌，大体上有以下大肠杆菌，大体上有以下四种遗传体系四种遗传体系。1、放线菌杂交原理放线菌杂交原理 混合培养营养缺陷型，菌丝间接触、融合形成混合培养营养缺陷型，菌丝间接触、融合形成异核体异核体。异核体：异核体：在同一个细

11、胞质里，存在两种遗传上不同的细胞核，在同一个细胞质里，存在两种遗传上不同的细胞核，在营养上互补。在营养上互补。菌落表型是原养型。基因型分别与亲本之一相同，无菌落表型是原养型。基因型分别与亲本之一相同，无重组体出现。没有发生遗传信息交换。重组体出现。没有发生遗传信息交换。（1）异核现象）异核现象 接合接合：异核细胞内不同基因型的细胞核在双方增殖：异核细胞内不同基因型的细胞核在双方增殖过程中，发生部分染色体转移或遗传信息交换。过程中，发生部分染色体转移或遗传信息交换。接合导致接合导致部分合子部分合子形成。形成。（2）接合现象）接合现象部分合子：部分合子：是由一个供体染色体片段与一个受体染色体的整体

12、是由一个供体染色体片段与一个受体染色体的整体相结合而形成的，但亦可能两个亲本都不完整相结合而形成的，但亦可能两个亲本都不完整 部分合子形成后，经过一次单交换，产生的杂合的染部分合子形成后，经过一次单交换，产生的杂合的染色体组，即：色体组，即：异核系异核系。异核系的菌落很小，遗传类型各不相同。能在异核系的菌落很小，遗传类型各不相同。能在MM或或SM上生长。但异核系的分生孢子影印到同样培养基上就不上生长。但异核系的分生孢子影印到同样培养基上就不能生长。能生长。（3）异核系的形成）异核系的形成 异核系不稳定，在菌落生长过程中，染色体重叠两节异核系不稳定，在菌落生长过程中，染色体重叠两节段（二体区）的

13、不同位置上发生交换后，能产生重组体孢段（二体区）的不同位置上发生交换后，能产生重组体孢子。子。异核系所产生的孢子几乎全部是单倍体，而成为一个单异核系所产生的孢子几乎全部是单倍体，而成为一个单倍的无性繁殖系。倍的无性繁殖系。但是，重组体也可由部分合子经过双交换而产生。但是，重组体也可由部分合子经过双交换而产生。（4）重组体的形成）重组体的形成 常用放线菌杂交方法：常用放线菌杂交方法：2、放线菌杂交技术放线菌杂交技术混合培养法混合培养法平板杂交法平板杂交法玻璃纸转移法玻璃纸转移法选择性平板法选择性平板法 两亲株是互补营养缺陷型，两亲株是互补营养缺陷型，两亲株混合，接种到两亲株混合，接种到CM斜面上

14、斜面上(其中一株产生孢慢时可多接一些其中一株产生孢慢时可多接一些)，孢子形成，孢子形成后制成单孢子悬浮液，然后在后制成单孢子悬浮液，然后在SM平板上分离，长出菌落平板上分离，长出菌落即为重组体。即为重组体。（1）混合培养法）混合培养法 将菌落培养在将菌落培养在非选择性培养基非选择性培养基上，形成孢子后，用上，形成孢子后，用影印培养法将菌落印至铺有试验菌孢子影印培养法将菌落印至铺有试验菌孢子(107109个个/mL)的的CM平板平板上培养至孢子形成。把形成的孢子影印到上培养至孢子形成。把形成的孢子影印到一系一系列列SM上上筛选各种重组体子代。筛选各种重组体子代。优点：优点：能迅速地大量杂交，尤其

15、是确定大量菌落与一能迅速地大量杂交，尤其是确定大量菌落与一个共同试验菌配对时的致育力更为方便。一个培养皿可排个共同试验菌配对时的致育力更为方便。一个培养皿可排列列20个菌株与一株配对菌株杂交。个菌株与一株配对菌株杂交。（2）平板杂交法）平板杂交法使用本法须备使用本法须备2条件：条件：a.直接亲本须带两个遗传标记（营养要求和抗药性），直接亲本须带两个遗传标记（营养要求和抗药性），另一个直接亲本对该药物敏感并带有另一种营养缺陷另一个直接亲本对该药物敏感并带有另一种营养缺陷型；型；b.SM是带有抗性药物的基本培养基。是带有抗性药物的基本培养基。（3）玻璃纸转移法）玻璃纸转移法 原理原理：异核体带有链

16、霉素敏感的等位基因，在含链霉：异核体带有链霉素敏感的等位基因，在含链霉素的素的SM上不生长。敏感性亲本和抗药性亲本因营养要求上不生长。敏感性亲本和抗药性亲本因营养要求得不到满足也不能在该得不到满足也不能在该SM上生长。而不带链霉素敏感等上生长。而不带链霉素敏感等位基因的两直接亲本的局部结合子则能在该位基因的两直接亲本的局部结合子则能在该SM上生长。上生长。在金霉素、土霉素、新霉素、红霉素和新生霉素等抗生在金霉素、土霉素、新霉素、红霉素和新生霉素等抗生素产生菌的杂交育种方面都有成功报道。素产生菌的杂交育种方面都有成功报道。刘颐屏刘颐屏等研究了金霉素链霉菌的遗传重组作用，他们从等研究了金霉素链霉菌

17、的遗传重组作用，他们从一个野生型菌株出发诱发营养缺陷型，用这些营养缺陷型菌一个野生型菌株出发诱发营养缺陷型，用这些营养缺陷型菌株进行杂交，获得了产量高于野生型菌株的重组体。对于某株进行杂交，获得了产量高于野生型菌株的重组体。对于某些重组体再进一步用诱变剂进行处理时，发现产量变异幅度些重组体再进一步用诱变剂进行处理时，发现产量变异幅度较野生型菌株大，且整个分布偏向于高产，从而育成了高产较野生型菌株大，且整个分布偏向于高产，从而育成了高产菌株。菌株。第五节第五节 原生质体融合技术原生质体融合技术 （protoplast fusion）概念概念：把两亲本细胞壁酶解，在高渗环境中释放出把两亲本细胞壁酶

18、解，在高渗环境中释放出球状体（球状体（原生质体原生质体），混合原生质体，由聚乙二），混合原生质体，由聚乙二醇醇(PEG)作助融剂，使互相凝集、融合，两亲本作助融剂，使互相凝集、融合，两亲本基因组由接触到交换，实现遗传重组。基因组由接触到交换，实现遗传重组。、不需要有已知的遗传系统。、不需要有已知的遗传系统。去除了细胞壁，亲株基因组直接融合、重组，不需要去除了细胞壁，亲株基因组直接融合、重组，不需要有已知的遗传系统。有已知的遗传系统。（一）原生质体融合的优越性（一）原生质体融合的优越性 、得到多种类型的重组子、得到多种类型的重组子 原生质体融合后两亲株的基因组之间有机会发生多次原生质体融合后两亲

19、株的基因组之间有机会发生多次交换，得到多种类型的重组子。交换，得到多种类型的重组子。参与融合的亲株数并不限于一个，可以多至三个、四参与融合的亲株数并不限于一个，可以多至三个、四个，这是一般常规杂交所达不到的。个，这是一般常规杂交所达不到的。、重组频率特别高。、重组频率特别高。因有聚乙二醇作助融剂。如天蓝色链霉菌种内重组因有聚乙二醇作助融剂。如天蓝色链霉菌种内重组频率可达到频率可达到20。、可以和其他育种方法相结合、可以和其他育种方法相结合。把由其他方法得到的优良性状通过原生质体融合再组把由其他方法得到的优良性状通过原生质体融合再组合到一个单株中。合到一个单株中。、易于提高筛选效率。、易于提高筛

20、选效率。可以用温度、药物、紫外线等处理、钝化亲株的一可以用温度、药物、紫外线等处理、钝化亲株的一方或双方，然后融合，在再生菌落中筛选重组子。这样方或双方，然后融合，在再生菌落中筛选重组子。这样可提高筛选效率。可提高筛选效率。（二）（二）原生质体融合的一般步骤原生质体融合的一般步骤原生质体融合方法：原生质体融合方法：PEG促溶、电诱导促融等。促溶、电诱导促融等。、细胞经过原生质体化与再生，常伴着基因突变，、细胞经过原生质体化与再生，常伴着基因突变，可能得到高产变异菌株。可能得到高产变异菌株。例例1：生二素链霉菌通过原生质体再生使：生二素链霉菌通过原生质体再生使螺旋霉素螺旋霉素产量提高产量提高2倍

21、。倍。例例2：弗氏链霉菌通过再生使：弗氏链霉菌通过再生使泰乐菌素泰乐菌素生产能力提生产能力提高了高了3倍多。倍多。（三）（三）原生质体融合在微生物育种中的应用原生质体融合在微生物育种中的应用 、链霉菌经过原生质体化，再生成细胞时，常、链霉菌经过原生质体化，再生成细胞时，常引起引起质粒消除质粒消除，导致染色体或次级代谢途径变化，可能，导致染色体或次级代谢途径变化，可能出现高产变异株。出现高产变异株。质粒消除频率达质粒消除频率达1385，、种内融合还可能使抗生素合成中的限速酶得到、种内融合还可能使抗生素合成中的限速酶得到修饰而使抗生素合成的代谢途径畅通。修饰而使抗生素合成的代谢途径畅通。、有效的种

22、间融合，可能使两个产生不同抗生素有效的种间融合，可能使两个产生不同抗生素菌株的调节基因和结构基因重组在一起，诱发菌株的调节基因和结构基因重组在一起，诱发“沉默基沉默基因因”的表达，产生新物质。种间融合还可能使两个产生的表达，产生新物质。种间融合还可能使两个产生不同抗生素菌株的结构基因重组而产生杂种抗生素。不同抗生素菌株的结构基因重组而产生杂种抗生素。第六节第六节 DNADNA重组技术重组技术 （DNA recombination）概念：概念：按人的意志，将供体遗传信息在体外与载按人的意志，将供体遗传信息在体外与载体相接成重组体相接成重组DNA分子，然后转入受体细胞中，分子，然后转入受体细胞中，

23、使其在受体中表达和遗传。使其在受体中表达和遗传。工业应用举例工业应用举例：1.将血红蛋白基因引入将血红蛋白基因引入顶头孢霉菌顶头孢霉菌中，限氧条件下中，限氧条件下头孢头孢菌素菌素C的产量提高了的产量提高了5倍；倍；2.将麦迪霉素产生菌的将麦迪霉素产生菌的4-羟基酰化酶基因克隆到羟基酰化酶基因克隆到生二素生二素链霉菌链霉菌内，可直接产生酰化螺旋霉素。内，可直接产生酰化螺旋霉素。医药应用举例：医药应用举例：、人胰岛素、干扰素、人白细胞介素、人促红细胞、人胰岛素、干扰素、人白细胞介素、人促红细胞生成素生成素(EPO)、重组链激酶和集落生长因子等。、重组链激酶和集落生长因子等。、基因工程抗体基因工程抗

24、体，极大地拓展了抗体的功能及其临，极大地拓展了抗体的功能及其临床应用范围，可用于肿瘤、病毒病治疗等。床应用范围，可用于肿瘤、病毒病治疗等。、转基因动物转基因动物，生产一些需要量大或，生产一些需要量大或Pr复杂需要翻复杂需要翻译后修饰的重组蛋白译后修饰的重组蛋白.DNA重组在育种方面的优势重组在育种方面的优势：、增加生物合成基因量，增加抗生素产量；、增加生物合成基因量，增加抗生素产量；、导入强启动子或抗性基因增加抗生素产量；、导入强启动子或抗性基因增加抗生素产量；、把两种不同的生物合成基因在体外重组后导入受体、把两种不同的生物合成基因在体外重组后导入受体内产生内产生杂交抗生素杂交抗生素；、激活沉

25、默基因激活沉默基因，产生新的生物活性物质或提高抗生，产生新的生物活性物质或提高抗生素产量；素产量；、把、把异源基因异源基因克隆到宿主中表达，改变生产工艺。克隆到宿主中表达，改变生产工艺。（一）（一）DNA重组技术基本过程重组技术基本过程 工程菌在保存、发酵过程中不稳定，成为制约工程菌在保存、发酵过程中不稳定，成为制约基因工程转变为生产力的关键之一。基因工程转变为生产力的关键之一。（二）（二）工程菌的稳定性工程菌的稳定性q外在表现：外在表现：得不到表达产物、或达不到要求产量。得不到表达产物、或达不到要求产量。q本质本质：质粒不稳定；表达产物不稳定。：质粒不稳定；表达产物不稳定。q内在表现内在表现

26、：质粒丢失；重组质粒：质粒丢失；重组质粒DNA片段脱落。片段脱落。1、工程菌不稳定性的表现工程菌不稳定性的表现质粒丢失：质粒丢失：由环境因素或生理、遗传学原因，质粒从宿主中由环境因素或生理、遗传学原因，质粒从宿主中丢失，丢失率因环境、宿主、质粒结构而有不同。丢失，丢失率因环境、宿主、质粒结构而有不同。重组质粒上一部分片段脱落：重组质粒上一部分片段脱落：表现为质粒变小或某些遗传信息发生变化甚至丧失。表现为质粒变小或某些遗传信息发生变化甚至丧失。表达产物不稳定：表达产物不稳定：人干扰素工程菌在表达干扰素时，随着培养时间的人干扰素工程菌在表达干扰素时，随着培养时间的延长，干扰素活性反而下降。延长，干

27、扰素活性反而下降。影响工程菌稳定性的因素：影响工程菌稳定性的因素：（1）质粒结构）质粒结构：质粒稳定区受到影响，重组质粒上有质粒稳定区受到影响，重组质粒上有重复序列，或与宿主染色体有部分同源等。重复序列，或与宿主染色体有部分同源等。（2）宿主：）宿主：质粒中有同源序列，宿主的比生长速率、质粒中有同源序列，宿主的比生长速率、宿主中重组基因的完整性、重组时有关基因的变异等。宿主中重组基因的完整性、重组时有关基因的变异等。（3）环境因素：）环境因素：高温、去垢剂、某些药物高温、去垢剂、某些药物(如利福平如利福平)、染料及胸腺嘧啶饥饿、紫外线辐射等都会引起质粒的丢失。染料及胸腺嘧啶饥饿、紫外线辐射等都

28、会引起质粒的丢失。（1）组建合适载体）组建合适载体 构建质粒时，构建质粒时，插入一段特殊的插入一段特殊的DNA片段或基因，片段或基因，使使宿主细胞分裂时，质粒能够较稳定地遗传到子代细胞中。宿主细胞分裂时，质粒能够较稳定地遗传到子代细胞中。（2）选择适当宿主）选择适当宿主 在选择宿主时，须确定其遗传特点。重组质粒在大肠在选择宿主时，须确定其遗传特点。重组质粒在大肠杆菌中较稳定，而在枯草杆菌和酵母中较不稳定。杆菌中较稳定，而在枯草杆菌和酵母中较不稳定。2、解决工程菌不稳定的对策解决工程菌不稳定的对策（3）施加选择压力）施加选择压力 a 抗生素添加法抗生素添加法 通常在重组质粒上含抗药性基因。转入不

29、耐药的宿主通常在重组质粒上含抗药性基因。转入不耐药的宿主后，工程菌获得了抗药性。发酵时，培养基中加入抗生素，后，工程菌获得了抗药性。发酵时，培养基中加入抗生素，可阻止丢失质粒的非生产菌生长。可阻止丢失质粒的非生产菌生长。b 抗生素依赖变异法抗生素依赖变异法 诱变使宿主成为某抗生素的依赖性突变株，而重组诱变使宿主成为某抗生素的依赖性突变株，而重组质粒上含有该抗生素的非依赖性基因。发酵生产时，不向质粒上含有该抗生素的非依赖性基因。发酵生产时，不向培养基中加抗生素就能起到消除重组质粒不稳定的影响培养基中加抗生素就能起到消除重组质粒不稳定的影响。c、营养缺陷型法、营养缺陷型法 诱变使宿主成为营养缺陷型

30、，将相关基因插入到重诱变使宿主成为营养缺陷型，将相关基因插入到重组质粒中，选择基础培养基使失去重组质粒的细胞不能组质粒中，选择基础培养基使失去重组质粒的细胞不能存活，而只有含重组质粒的细胞才能生长。存活，而只有含重组质粒的细胞才能生长。（4）控制基因过量表达）控制基因过量表达 外源基因表达水平越高，重组质粒越不稳定，如果外源基因表达水平越高，重组质粒越不稳定，如果外源基因的表达受到抑制，则重组质粒不可能丢失。外源基因的表达受到抑制，则重组质粒不可能丢失。可采取可采取两阶段培养法两阶段培养法。A 一些温度敏感型质粒，低温时质粒拷贝数少，温度一些温度敏感型质粒，低温时质粒拷贝数少，温度升高时质粒大

31、量复制，拷贝数剧增。发酵前期控制温度使升高时质粒大量复制，拷贝数剧增。发酵前期控制温度使基因不过量表达，质粒稳定遗传，后期提高温度使基因高基因不过量表达，质粒稳定遗传，后期提高温度使基因高效表达。效表达。B 也可用诱导型启动子。即在构建表达质粒时，使用也可用诱导型启动子。即在构建表达质粒时，使用可诱导的操纵子，选择培养条件使启动子受阻遏可诱导的操纵子，选择培养条件使启动子受阻遏(抑制抑制)至至一定时期，使质粒稳定地遗传，然后通过去阻遏使质粒高一定时期，使质粒稳定地遗传，然后通过去阻遏使质粒高效表达。效表达。两阶段培养法举例：两阶段培养法举例：（5）控制培养条件）控制培养条件 众多环境因素中，培

32、养基组成、培养温度、菌体的众多环境因素中，培养基组成、培养温度、菌体的比生长速率尤为重要。比生长速率尤为重要。对一个已经组建完成的克隆菌来说，选择最合适的对一个已经组建完成的克隆菌来说，选择最合适的培养条件是进行工业化生产的关键步骤。培养条件是进行工业化生产的关键步骤。（6）固定化重组菌以提高基因工程菌的稳定性。）固定化重组菌以提高基因工程菌的稳定性。第七节第七节 菌种保藏菌种保藏 菌种是国家的重要资源。菌种是国家的重要资源。菌种保藏是微生物学研究和育种工作的重要组成部分。菌种保藏是微生物学研究和育种工作的重要组成部分。任务任务:不死亡、不污染、不退化不死亡、不污染、不退化。1980年，中国微

33、生物菌种保藏委员会成立。年，中国微生物菌种保藏委员会成立。一、一、菌种保藏的意义菌种保藏的意义原理：原理：人工创造条件使微生物的代谢尽量降低，以人工创造条件使微生物的代谢尽量降低，以减少变异。一般可通过限制营养、缺氧，干燥和减少变异。一般可通过限制营养、缺氧，干燥和低温，使菌种处于低温，使菌种处于“体眠体眠”状态。状态。二、二、菌种保藏原理和方法菌种保藏原理和方法（一）（一）斜面冰箱保藏法斜面冰箱保藏法 4冰箱保存。保存期冰箱保存。保存期1-3月。月。（二）（二）沙土管保藏法沙土管保藏法 适合于产孢子或芽孢的微生物。适合于产孢子或芽孢的微生物。1、将沙与土洗净、烘干、过筛，（、将沙与土洗净、烘

34、干、过筛，（1-2）：）：1混匀，混匀，分装于小试管中，料高分装于小试管中，料高1厘米，厘米，121度间歇灭菌三次，烘干度间歇灭菌三次，烘干备用。沙备用。沙80目，土目，土80一一100目。目。2、将孢子制成悬液，接入沙土管。或将斜面孢子刮、将孢子制成悬液，接入沙土管。或将斜面孢子刮下直接与沙土混合，置干燥器中用真空泵抽干，冰箱内保下直接与沙土混合，置干燥器中用真空泵抽干，冰箱内保存。存。3、保存期、保存期1年左右。年左右。（三）（三）菌丝速冻法菌丝速冻法 不产孢子或芽孢的微生物可用甘油菌丝速冻法。不产孢子或芽孢的微生物可用甘油菌丝速冻法。保藏温度为保藏温度为20，为避免损伤致死，需甘油作保护

35、，为避免损伤致死，需甘油作保护剂。甘油最终浓度为剂。甘油最终浓度为25。操作：操作：、配制浓度为、配制浓度为50的甘油溶液，的甘油溶液，121灭菌灭菌后备用；后备用；、制备菌悬液，一般浓度为、制备菌悬液，一般浓度为1081010个个/mL；、菌悬液和甘油溶液等体积混合均匀，置、菌悬液和甘油溶液等体积混合均匀，置20保藏。保藏。（四）（四）石蜡油封存法石蜡油封存法 向菌种斜面上，倒入一层灭菌石蜡油，量高出斜面向菌种斜面上，倒入一层灭菌石蜡油，量高出斜面1cm，保存冰箱中。，保存冰箱中。适于不能利用石蜡油作碳源的微生物。适于不能利用石蜡油作碳源的微生物。保存期约保存期约1年。年。（五）（五）真空冷

36、冻干燥保藏法真空冷冻干燥保藏法 基本原理：基本原理：在较低温度下在较低温度下(-18)，快速，快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。在这样的环境中，微生真空中使水分升华。在这样的环境中，微生物的生长和代谢暂时停止，不易发生变异。物的生长和代谢暂时停止，不易发生变异。菌种可保存菌种可保存5年左右。年左右。基本操作：基本操作：将微生物制成悬浮液，与将微生物制成悬浮液，与保护剂保护剂混合，放混合，放在安瓿管内，用低温酒精或干冰迅速冻结，低温下用真空在安瓿管内，用低温酒精或干冰迅速冻结，低温下用真空泵抽干，真空熔封。低温保藏。泵抽干，真空熔封

37、。低温保藏。保护剂：保护剂：脱脂牛奶或血清等。牛奶可用离心或加热的脱脂牛奶或血清等。牛奶可用离心或加热的方法脱脂。方法脱脂。保护剂的作用：保护剂的作用：在冷冻干燥的脱水过程中代替结合水在冷冻干燥的脱水过程中代替结合水而稳定细胞成分而稳定细胞成分(细胞膜细胞膜)的构型，防止细胞膜因为冻结而破的构型，防止细胞膜因为冻结而破坏。保护剂还可以起支持作用，使微生物疏松地固定在上坏。保护剂还可以起支持作用，使微生物疏松地固定在上面。面。（六）（六）液氮超低温保藏法液氮超低温保藏法 是近几年才发展起来的，国外已较普遍采用，适是近几年才发展起来的，国外已较普遍采用，适用范围最广。尤其是一些不产孢子的菌丝体，用

38、其他保用范围最广。尤其是一些不产孢子的菌丝体，用其他保藏方法不理想，可用液氮保藏法，其保存期最长。藏方法不理想，可用液氮保藏法，其保存期最长。（1）原理）原理 液氮的温度可达液氮的温度可达-196，远远低于新陈代谢作用停，远远低于新陈代谢作用停止的温度止的温度(-130)，菌种代谢活动停止，化学作用消失。，菌种代谢活动停止，化学作用消失。（2）操作）操作 a 安瓿管安瓿管 需能承受大温差而不至于破裂，加棉塞后灭菌，烘干需能承受大温差而不至于破裂，加棉塞后灭菌，烘干后备用。后备用。b 菌种准备及分装菌种准备及分装 超低温冷冻过程需要保护剂。常用保护剂为超低温冷冻过程需要保护剂。常用保护剂为10甘

39、油，甘油，制备好菌液后，加入安瓿管，装量制备好菌液后，加入安瓿管，装量0.21mL。c 冻结冻结 关键是把微生物从常温过渡到低温。这样在细胞接触关键是把微生物从常温过渡到低温。这样在细胞接触低温前，使胞内水通过膜渗出，而不形成冰晶而伤害细胞。低温前，使胞内水通过膜渗出，而不形成冰晶而伤害细胞。美国美国ATCC先将菌液降到先将菌液降到0，再，再1/min降低到降低到35，再放入液氮罐的气相中。再放入液氮罐的气相中。因液氮蒸发导致温度上升，冰晶状态发生变化而导致因液氮蒸发导致温度上升，冰晶状态发生变化而导致菌种死亡。所以要常常注意液氮残存量，定期补加。菌种死亡。所以要常常注意液氮残存量，定期补加。

40、d 重新培养重新培养 将安瓿管从冰箱中取出，室温迅速解冻，升温将安瓿管从冰箱中取出，室温迅速解冻，升温至至0时即可打开安瓿管，移到适宜的斜面上培养。时即可打开安瓿管，移到适宜的斜面上培养。三、三、国内外主要菌种保藏机国内外主要菌种保藏机构构国际机构：国际机构：ATCC American Type Culture Collection.Rockvill Maryland,U.S.A.美国标准菌种收藏所，美国，马里兰州，罗克维美国标准菌种收藏所，美国，马里兰州，罗克维尔市。尔市。CSH Cold Spring Harbor Laboratory.U.S.A.冷泉港研究冷泉港研究室，美国。室，美国。

41、NIH National Institutes of Health.Bethesda,Maryland,U.S.A.国立卫生研究所，美国，马里兰州，贝塞斯达。国立卫生研究所，美国，马里兰州，贝塞斯达。NRRL Northern Uti1ization Research and Development Division,U.S.Department of Argculture,Peoria,U.S.A.美国农业部、北方开发利用研究部，美国皮奥里亚美国农业部、北方开发利用研究部，美国皮奥里亚市。市。IAM Institute of Applied Micribiology.University o

42、f Tokyo,Japan.日本东京大学应用微生物研究所，日本日本东京大学应用微生物研究所，日本东京。东京。IFO Instltute for Fermentation.Osaka,Japan.发酵研究发酵研究所，日本大阪。所，日本大阪。KCC Kaken Chemical Company Ltd.Tokyo,Japan.科科研化学有限公司，日本东京。研化学有限公司，日本东京。NCTC National Collection of Type Culture.London,United Kingdom.国立标准菌种收藏所，英国伦敦。国立标准菌种收藏所，英国伦敦。国内机构：国内机构：中国微生物菌种

43、保藏管理委员会中国微生物菌种保藏管理委员会(China Committee for Culture Collection of MicroorganismsCCCMS)。下设六个菌种保藏管理中心。下设六个菌种保藏管理中心。1、普通微生物菌种保藏管理中心：、普通微生物菌种保藏管理中心：China General Microbiological Culture Collection Centre(CGMCC)中国科学院微生物研究所，北京中国科学院微生物研究所，北京(AS)：真菌，细菌；：真菌，细菌；中国科学院武汉病毒研究所，武汉中国科学院武汉病毒研究所，武汉(AS-)：病毒。：病毒。(CCTCC)

44、2、农业微生物菌种保藏管理中心、农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)：中国农业科学院土壤肥料研究所，北京中国农业科学院土壤肥料研究所，北京(1SF)。3、工业微生物菌种保藏管理中心、工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)：轻工业部食品发酵工业科学研究所，北京轻工业部食品发酵工业科学研究所，北京(IFFl)。4、医学微生物菌种保藏管理中心、医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)：中国医学科学院皮肤病研究所，南京中国医学科学院皮肤病研究所，南京(1D)：真菌。：真菌。卫生部药品生物制品检定所，北京卫生部药品生物制品检定所，北京(NICPBP)：细菌。：细菌。中国医学科学院病毒研究所，北京：病毒。中国医学科学院病毒研究所，北京：病毒。5、抗生素菌种保藏管理中心、抗生素菌种保藏管理中心(CACC)：中国医学科学院抗生素研究所，北京中国医学科学院抗生素研究所，北京(1A)。四川抗生素工业研究所，成都四川抗生素工业研究所，成都(STA)：新抗生素菌种。：新抗生素菌种。华北药厂抗生素研究所，石家庄华北药厂抗生素研究所，石家庄(IANP)：生产用抗：生产用抗生素菌种。生素菌种。6、兽医微生物菌种保藏管理中心、兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)：农业部兽医药品监察所，北京。农业部兽医药品监察所，北京。