分子生物学第六章基因重组ppt课件.ppt
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- 分子生物学 第六 基因 重组 ppt 课件
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1、Chapter 6 Genetic recombination遗传重组 重组recombination:是已存在的遗传物质产生新的组合的过程。分子间或染色体间重组:离散的染色体混合时产生新的组合。如真核染色体减数分裂时的染色体独立分配。不依赖酶。分子内或染色体内重组:通过DNA的剪切和连接产生新的染色体类型。依赖酶。分子内重组 同源重组homological recombination:同源性依赖,非序列专一性依赖。在大肠杆菌由RecA蛋白指导。位点特异性重组site specific recombination:序列专一性依赖,非同源性依赖。由位点特异性重组酶指导。转座transpositi
2、on:非同源性依赖。由转座酶、整合酶指导。酶识别转座因子两端特异序列,但受体位点相对非特异。不正常重组或非常规重组illegitimate recombination:很少或不需要同源性。一般使用不正常底物进行细胞正常加工。与癌症相关。人工重组artificial recombination:体外进行DNA的剪切和连接引起的重组,即基因重组。一、同源重组 功能:减数分裂时染色体分配、DNA修复、特定噬菌体的复制、酵母的交配型转换、真核基因组的遗传作图、基因导入 模型:v拷贝-选择:在DNA复制中,新生链延伸时转换为新的模板。如DNA修复。v断裂-重新连接:重组没有在复制中产生,DNA链在双链间
3、断裂、交换和重新连接。如减数分裂时染色体交换v杂合模型:包括上面两种特征。修复损伤DNA的同源重组真核生物同源重组的断裂与重接模型真核生物同源重组的断裂与重接模型 Darlingtong D.C.Darlingtong D.C.于于19361936年提出:年提出:减数分裂同源染色体联会时,非姊妹染色单体由于减数分裂同源染色体联会时,非姊妹染色单体由于缠绕而产生张力,两个染色单体在同一位置断裂、缠绕而产生张力,两个染色单体在同一位置断裂、重节,以消除张力,从而产生重组。重节,以消除张力,从而产生重组。证据证据:姊妹染色单体的交换:姊妹染色单体的交换 Diploid eukaryotes:cros
4、sing over(双倍体染色体交换)1.1.Homologous chromosomes line up in meiosis Homologous chromosomes line up in meiosis(when)(when)2.2.The The nonsister nonsister chromatids exchange equivalent sections chromatids exchange equivalent sections(what)(what)同源重组 发生在两条DNA双链之间 重组酶能以任何的同源序列为底物 重组的频率在整组基因中并不很频繁,但对整体和局部都
5、有影响 重组的总频率在精子和卵子中并不相同,在人类中女性是男性的两倍 在整组基因内部,同源重组的频率与染色体的构象有关,例如,十字结构将阻止附近的DNA重组变异。染色体的重组包含部分的物理性的改变:破损与再联合细线期偶线期粗线期双线期终变期同化作用在DNA双链中制造一个破损两条DNA双链分子的联接作用是基因重组的关健环节 同 源 染 色 体 两 对DNA双链在相应点产生nick,一条单链离开它的伙伴,与另一个双链分子的相应位置倒易位置,创 造 了 两 个DNA双链之间的连系,这种连接在一起的一对双链叫做交差分子。一个链与另一个链的连接点叫做重组关节。重组关节能沿着DNA双链分子移动,这种移动叫
6、做枝状迁移 在一条链被另一条链取代的过程中,分叉点可以沿任一个方向移动 交差分子旋转后形成一个平面结构-Holliday结构细菌基国重组中的单链同化作用 single-strand assimilation DNA分子的单链部分通过碱基互补配对转移到另一DNA双链分子中,称为单链吸收或单链同化。有三个必备条件:其中一个DNA分子必须有单链区其中一个DNA分子必须有自由3端单链区和3端必须设置在两分子互补区内RecA催化单链的同化作用 RecA催化单、双链DNA的反应分为三个阶段:RecA在单链DNA上慢慢聚合。单链DNA与其互补物在双链上快速配对反应,产生异源双链连接 单链从双链中慢慢转移,产
7、生一个长的异源双链DNA区带。SSB(单链结合蛋白)的存在刺激了这个反应RecA promotes the assimilation of invading single strands into duplex DNA so long as one of the reacting strands has a free end.RecA catalyzes single-strand RecA catalyzes single-strand assimilationassimilation RecA介导的DNA修复重组热点 重组起始于双链破损。双链破损在轴素形成期产生,在联会丝复合物形成阶断消失
8、(60min)在染色体上容易发生双链破损的位点,称为重组热点。Chi序列刺激它周围附近的重组 与重组有关的基因称为Rec基因 Rec突变体不能进行同源重组 大约1020个与重组有关的DNA位点通过E.coli 的Rec基因突变体鉴定 Chi序列能刺激它周围附近的重组:5GCTGGTGG 3 3CGACCACC 5 Chi序列在大肠杆菌中每510kb出现一次 Chi是一个被RecBCD基因编码的酶的作用目标。RecBCD是有强烈降解DNA能力的核酸酶,在SSB存在下,有解开DNA双链的酶活性和ATP酶活性,它在重组中所起的作用便是提供带有自由3端的单链DNA。Haploid prokaryote
9、sHaploid prokaryotes (单倍体生物原核同源重组)单倍体生物原核同源重组)Between the two homologous DNA duplex(where)partially duplicated DNA of the chromosome partially duplicated DNA of the chromosome between chromosomal DNA and“foreign”DNA between chromosomal DNA and“foreign”DNA1.1.Nicks made near Nicks made near ChiChi (G
10、CTGGTGG/each 4 kb)(GCTGGTGG/each 4 kb)sites by a nuclease sites by a nuclease with recBCD.with recBCD.2.2.RecA binds to ssDNA RecA binds to ssDNA to form RecA-ssDNA.to form RecA-ssDNA.How:Holliday model 3.3.RecA-ssDNA filaments search the opposite DNA duplex RecA-ssDNA filaments search the opposite
11、DNA duplex for corresponding sequence(invasion).for corresponding sequence(invasion).4.4.Seal the nicks and form a four-branched Holliday Seal the nicks and form a four-branched Holliday structurestructure5.5.Branch migration&resolving Holliday junctionBranch migration&resolving Holliday junctionHap
12、loid prokaryotesHaploid prokaryotes (原核同源重组)原核同源重组)Haploid prokaryotesHaploid prokaryotes(原核同源重组)原核同源重组)Resolving Holliday junction二、位点专一性重组 非序列同源性 重组位点特异 由识别特异重组位点的酶指导 导致DNA序列发生重排 举例:l l噬菌体插入细菌基因组噬菌体插入细菌基因组 l l噬菌体从细菌基因组中切离噬菌体从细菌基因组中切离1.1.l-encoded integrase(Int l-encoded integrase(Int 整合酶整合酶):makes
13、):makes staggeredcutsstaggeredcuts交错切点交错切点in the specific sites in the specific sites(15bp seq15bp seq)2.2.Int and IHF(integration host factor encoded by Int and IHF(integration host factor encoded by bacteria):recombination and insertionbacteria):recombination and insertion3.3.l-encoded excisionase
14、(XIS):excision of the phage DNA l-encoded excisionase(XIS):excision of the phage DNA Site-specific recombination:(Site-specific recombination:(位点专一性重组)位点专一性重组)bacteriophage l insertionbacteriophage l insertion 整合过程要求在attp和attB之间进行识别;而移除过程则需要在attL和attR之间进行识别 重组过程是可逆的,但反应条件不同:整合反应需要int产物和IHF因子;移除反应还需要
15、噬菌体xis基因产物。xis基因产物决定噬菌体是否进行复制 整合的过程:A.具有对特异性DNA强烈亲和力的Int与attP和attB位点结合;B.Int的拓扑异构酶活性,使两条双链各自断开一条单链,瞬间旋转然后交换连接,形成Holliday中间提,C.在另两条单链之间发生同样的断裂重接,从而完成双链间的重组。位点专一性重组的核苷酸序列位点专一性重组的核苷酸序列 1.attP:POP:O为15bp(核心)富含A-T的非对称序列;P为-160 O的160bp序列 P为O 80的80bp序列 共240bp 2.attB:BOB:B为-11 O序列 B为O 11序列 共23bp重组后形成BOP(att
16、L,91bp)和POB(attR,171bp)特异性重组可以在体外进行 特异性重组可以通过Int和IHF在体外进行,它包括在缺少任何DNA合成下的破损与再结合,两个臂的功能可以通过在两侧产生缺失来研究 attp发挥作用要240bp,而attB只需要由-11到+11的23bp的片断即可发挥作用,在这个片段中,核心两侧只有4bp通路克隆系统gateway cloning system 一种位点特异的DNA重组技术,包括LR和BP两个反应体系。可简单表示为:attBXattP attLXattR用途:PCR产物的定向克隆 DNA片断高效、广泛的亚克隆 氨基或羧基末端的融合蛋白表达LR反应和BP反应
17、LR 反应:通路克隆的主要反应,LR 克隆酶(整合酶(Int)和整合宿主因子(IHF)蛋白)识别attL 和attR 重组位点后,催化入口克隆(entry clone)的外源DNA 及其两端部分位点取代目标载体(destination vector)的ccdB 基因及其两端部分位点(灰色),形成表达克隆(expression clone)。BP 反应:与LR 反应反向,BP 克隆酶混和物(Int、IHF 和切除酶(Xis)催化表达载体attB 间的目的基因转到供体载体中,形成新的入口克隆,此克隆又可与其它目标载体重组产生新的表达载体。PCRPCR产物的产物的BPBP反应反应三、转座重组特点:1
18、.自身携带有转座酶基因,末端有反向重复序列;2.转座过程中出现共联体;3.转座以后,可以造成原来转座子位置的DNA缺失(非复制转座),也可以依然保持在原位,而在靶序列上复制了一个转座子(复制转座);4.转座完成以后可以在靶序列上造成同向重复序列5.转座子插入后可影响所在位置的基因的表达转座子 转座子指能将自身插入基因组中其它位置的一段DNA序列。插入位置与转座子序列没有相关性。病毒、细菌和真核细胞的质粒或基因组中都含有转座子。多数转座子在插入新位点的过程中依赖其特异的插入序列去完成。原核生物转座因子包括:插入序列;转座子;转座噬菌体IS elementIS element基因组的进化既赖于获得
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