分子生物学实验原理-课件(PPT 150页).pptx
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1、分子生物学实验原理分子生物学实验原理第1页,共150页。第一节 分子生物学发展概述分子生物学发展概述第2页,共150页。l分子生物学分子生物学molecular biology是在分子水平上研究是在分子水平上研究生物的结构、组织和功能的科学。生物的结构、组织和功能的科学。l1950年,年,Astbury在一次学术报告中,首次提出在一次学术报告中,首次提出并使用了分子生物学这一名词术语。并使用了分子生物学这一名词术语。l广义和狭义之分广义和狭义之分l医学分子生物学医学分子生物学是应用分子生物学技术和理论是应用分子生物学技术和理论来阐明人体正常生理活动和病理过程及其调控来阐明人体正常生理活动和病理
2、过程及其调控的分子机理。的分子机理。第3页,共150页。分子生物学理论与实际应用的成就分子生物学理论与实际应用的成就理论方面理论方面1.关于肿瘤的发生:关于肿瘤的发生:提出了肿瘤起源于提出了肿瘤起源于细胞增殖和细胞增殖和分化调控的失常分化调控的失常和细胞同它周围组织关系的紊乱。和细胞同它周围组织关系的紊乱。癌基因:癌基因:100多种;抑癌基因:多种;抑癌基因:20多种多种 细胞周期调控系统细胞周期调控系统 细胞凋亡细胞凋亡 端粒酶端粒酶第4页,共150页。2.关于艾滋病关于艾滋病 Acquired Immune Deficiency Syndrome HIV序列;疫苗序列;疫苗3.关于慢性病关
3、于慢性病chronic disease,如心血管疾病、,如心血管疾病、肥胖、糖尿病、骨质疏松,发现了相关基肥胖、糖尿病、骨质疏松,发现了相关基因及其多态性。因及其多态性。4.关于生长、发育与进化的统一理论,也深关于生长、发育与进化的统一理论,也深入到了分子水平。入到了分子水平。第5页,共150页。实际应用方面实际应用方面1.转基因植物转基因植物目前已鉴定和克隆化的用于转基因植物目前已鉴定和克隆化的用于转基因植物的的基因有基因有100多个多个。抗除草剂、抗昆虫、抗病毒、抗不良环抗除草剂、抗昆虫、抗病毒、抗不良环境因素境因素(抗寒、抗盐碱地、抗旱、抗(抗寒、抗盐碱地、抗旱、抗涝)、提高作物的产量、
4、涝)、提高作物的产量、提高蛋白质含量提高蛋白质含量、改善氨基酸构成等。改善氨基酸构成等。第6页,共150页。2.转基因动物转基因动物 1983年,年,超级小白鼠超级小白鼠,体重是正常鼠的,体重是正常鼠的2倍。倍。随后出现转基因随后出现转基因猪、羊、鸡、兔、牛、鲤鱼猪、羊、鸡、兔、牛、鲤鱼等。等。我国目前研究了金鱼、鲤鱼、圆头鲂。我国目前研究了金鱼、鲤鱼、圆头鲂。3.基因工程多肽药物与疫苗基因工程多肽药物与疫苗 主要指主要指DNADNA体外重组技术所研制的产品,体外重组技术所研制的产品,转基因动物和植物所研制的产品转基因动物和植物所研制的产品,以及,以及蛋白蛋白质工程技术质工程技术所研制或改进的
5、产品。所研制或改进的产品。第7页,共150页。4.基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗 基因诊断基因诊断gene diagnosis是指通过直接探查基因的是指通过直接探查基因的存在状态或缺陷,从而对疾病作出诊断的方法。存在状态或缺陷,从而对疾病作出诊断的方法。目的物:目的物:DNA或或RNA 方法:方法:核酸分子杂交技术、核酸分子杂交技术、PCR技术、技术、DNA芯片技术芯片技术 疾病:疾病:遗传性疾病;传染病或感染性疾病遗传性疾病;传染病或感染性疾病第8页,共150页。基因治疗基因治疗gene therapy 指将正常的外源基因导入生物体靶细胞内,指将正常的外源基因导入生物体靶细胞内,以弥补
6、所缺失的基因,关闭或降低异常表以弥补所缺失的基因,关闭或降低异常表达的基因,以达到治疗疾病的目的。达的基因,以达到治疗疾病的目的。治疗疾病:治疗疾病:遗传病遗传病 恶性肿瘤恶性肿瘤 传染病传染病第9页,共150页。5.环境监测与净化环境监测与净化 area survey and depollution 监测:可检测环境中的监测:可检测环境中的病毒和细菌病毒和细菌 净化:改造细菌净化:改造细菌分解环境中的石油、残留的农药和有毒分解环境中的石油、残留的农药和有毒金属金属6.克隆动物克隆动物Clone animal 1997年年“多利多利”克隆羊克隆羊 克隆器官克隆器官(干细胞(干细胞stem ce
7、ll技术)技术)第10页,共150页。7.人类基因组计划人类基因组计划human genome project;HGP1990年,年,美国国立卫生研究院(美国国立卫生研究院(NIH)和美国能源和美国能源部部联合发表了人类基因组计划。联合发表了人类基因组计划。30亿个碱基对亿个碱基对,估计有,估计有3万万4万个人类基因。万个人类基因。2000年年6月月26日,首次绘成人类基因组日,首次绘成人类基因组“工作框架工作框架图图”。2003年年4月月14日,中、美、日、德、法、英等日,中、美、日、德、法、英等6国科学家及领导人宣布人类基因组序列图绘制国科学家及领导人宣布人类基因组序列图绘制成功,成功,人
8、类基因组计划的所有目标全部实现人类基因组计划的所有目标全部实现。第11页,共150页。意意 义义与与“阿波罗阿波罗”登月计划相媲美登月计划相媲美1996年诺贝尔化学奖得主罗伯特年诺贝尔化学奖得主罗伯特柯特认为,柯特认为,20世纪是物理学和化学的世纪,世纪是物理学和化学的世纪,21世纪将是生物世纪将是生物学的世纪学的世纪。推动分子生物学更加快速地发展:推动分子生物学更加快速地发展:蛋白质组学、蛋白质组学、代谢蛋白质组学、药物蛋白质组学、毒物蛋白代谢蛋白质组学、药物蛋白质组学、毒物蛋白质组学、营养蛋白质组学质组学、营养蛋白质组学及各种计划及各种计划第12页,共150页。对其他相关学科的影响对其他相
9、关学科的影响1.向其他学科渗透向其他学科渗透2.形成了许多新兴的边缘学科形成了许多新兴的边缘学科 基础医学方面基础医学方面:肿瘤分子生物学、免疫分子生:肿瘤分子生物学、免疫分子生 物学、神经分子生物学等物学、神经分子生物学等 预防医学方面预防医学方面:分子营养学、分子毒理学、分:分子营养学、分子毒理学、分 子流行病学、遗传流行病学、人子流行病学、遗传流行病学、人 类基因组流行病学、类基因组流行病学、公共卫生公共卫生 遗传学遗传学第13页,共150页。在预防医学中的应用及发展方向在预防医学中的应用及发展方向1.1.慢性病的研究慢性病的研究 慢性病的发病原因绝大慢性病的发病原因绝大多数是多数是基因
10、与外界环境因素相互作用的结基因与外界环境因素相互作用的结果果。2.环境因素对人类遗传物质损伤的研究及环境因素对人类遗传物质损伤的研究及“三三致致”毒性的研究:毒性的研究:生物标志物的研究和评价生物标志物的研究和评价方法的建立方法的建立3.环境监测与污染物的净化。环境监测与污染物的净化。第14页,共150页。4.4.遗传病的产前诊断(基因型预防)及早期诊断遗传病的产前诊断(基因型预防)及早期诊断(表型预防)。(表型预防)。5.5.某些重要疾病的生物工程疫苗的研制。某些重要疾病的生物工程疫苗的研制。6.6.对环境因素敏感基因及易感人群的研究环境基对环境因素敏感基因及易感人群的研究环境基因组计划(环
11、境基因组学)因组计划(环境基因组学)(1 1)环境应答反应基因)环境应答反应基因 (2 2)筛选多态性及易感性)筛选多态性及易感性 (3 3)根据易感性制定不同的干预计划)根据易感性制定不同的干预计划第15页,共150页。一、分子生物学一些重要的理论知识一、分子生物学一些重要的理论知识1.分子生物学发展史上一些重要的事件分子生物学发展史上一些重要的事件(1)1865年,年,“遗传学之父遗传学之父”G.Mendel根据豌豆根据豌豆杂交试验结果,杂交试验结果,创立了遗传因子学说创立了遗传因子学说,即遗传的分,即遗传的分离律和自由组合律。离律和自由组合律。(2)1903年年W.Sutton提出提出染
12、色体染色体是是Mendel遗传单遗传单位的载体的概念。位的载体的概念。(3)1909年,年,W.Johannsen将这种在染色体上将这种在染色体上的遗传单位的遗传单位定名为基因定名为基因(gene)。)。第16页,共150页。(4)1910年,现代实验遗传学奠基人年,现代实验遗传学奠基人TH.Morgan和他的研究生在研究果蝇的遗传规和他的研究生在研究果蝇的遗传规律时发现了律时发现了基因的连锁律和交换律基因的连锁律和交换律。(5)1944年,年,OT.Avery等人(等人(3人)分离出人)分离出细菌细菌 DNA,并发现,并发现DNA是携带生命遗传物质是携带生命遗传物质的分子。的分子。(6)19
13、50年,年,Astbury在一次演讲中,首次使在一次演讲中,首次使用了用了“分子生物学分子生物学”术语术语。(7)1953年,年,Watson和和Crick提出了提出了DNA结结构的构的双螺旋模型双螺旋模型,揭示了遗传物质自我复制的机,揭示了遗传物质自我复制的机制。制。第17页,共150页。(8)1961年至年至1966年,年,Nirenberg和和Crick 等等人破译了人破译了DNA遗传密码遗传密码,1966年年 破译了破译了64个个遗传密码。遗传密码。提出了遗传信息由提出了遗传信息由DNA RNA蛋白质传递蛋白质传递的的中心法则中心法则。(9)1969年,年,Jonathan Beckw
14、ith及其同事及其同事在哈佛大学成功在哈佛大学成功分离出第一个基因分离出第一个基因。(10)1970年,发现了年,发现了逆转录酶逆转录酶。(11)1961年,年,F.Jacob和和J.Monod提出了提出了乳糖乳糖操纵子学说操纵子学说。第18页,共150页。(12)自)自1946年起的年起的20年当中,陆续发现了年当中,陆续发现了许多许多质粒质粒;1968年至年至1970年又发现了许多年又发现了许多限限制性内切酶制性内切酶,为,为DNA体外重组提供了有利工体外重组提供了有利工具。具。(13)1973年,年,重组重组DNA技术问世技术问世。(14)1986年,年,K.Mullis等建立了等建立了
15、PCR技术技术(15)1990年,年,人类基因组计划。人类基因组计划。第19页,共150页。2.2.三个重要理论三个重要理论important theory(1)DNA(1)DNA的结构、复制、中心法则的结构、复制、中心法则基本构成单位是基本构成单位是核苷酸核苷酸核苷酸由核苷酸由脱氧核糖、碱基和磷酸脱氧核糖、碱基和磷酸构成。构成。碱基分别是碱基分别是腺嘌呤腺嘌呤(A)(A)、鸟嘌呤、鸟嘌呤(G)(G)、胸腺、胸腺嘧啶嘧啶(T)(T)和胞嘧啶和胞嘧啶(C)(C)。相邻的两个核苷酸以相邻的两个核苷酸以磷酸二酯键磷酸二酯键相连相连进一步盘旋、折叠,形成进一步盘旋、折叠,形成三级或四级结构三级或四级结
16、构第20页,共150页。RNARNA与与DNADNA有如下不同点有如下不同点:u五碳糖为五碳糖为核糖核糖(不是脱氧核糖不是脱氧核糖);u碱基中有碱基中有尿嘧啶尿嘧啶U(uracil)U(uracil)而没有胸腺嘧啶而没有胸腺嘧啶uRNARNA为为单链单链,不是双链,但,不是双链,但RNARNA单链之间相邻单链之间相邻的碱基可由氢键作用形成局部双链。的碱基可由氢键作用形成局部双链。uDNADNA存在于细胞核的染色体、线粒体存在于细胞核的染色体、线粒体以及染色以及染色体以外的质粒中体以外的质粒中(质粒是一些双链,闭环的质粒是一些双链,闭环的DNADNA分分子子)。第21页,共150页。DNA(DN
17、A(或或RNA)RNA)结构给我们的启示结构给我们的启示 DNA(DNA(或或RNA)RNA)是是水溶性的水溶性的。这是由于含有磷酸。这是由于含有磷酸基因、羟基和氨基。在核酸提取过程中,我们基因、羟基和氨基。在核酸提取过程中,我们保留的是水相、而不是有机相保留的是水相、而不是有机相。核酸是核酸是两性电离两性电离,既带正电荷,又带负电,既带正电荷,又带负电荷。它的等电点荷。它的等电点(PI)(PI)为为2 22.52.5。在中性溶液。在中性溶液中带负电荷。对核酸进行中带负电荷。对核酸进行电泳时,点样时应电泳时,点样时应点在负极点在负极;杂交时选择尼龙膜时,最好;杂交时选择尼龙膜时,最好选择选择带
18、正电荷的尼龙膜带正电荷的尼龙膜。(核酸带负电荷,容易吸附到核酸带负电荷,容易吸附到带正电荷的膜上,牢固,不掉带正电荷的膜上,牢固,不掉)第22页,共150页。DNADNA在细胞中存在部位不同在细胞中存在部位不同(细胞核、线粒体、细胞核、线粒体、质粒质粒),所以应注意提取方法的不同,所以应注意提取方法的不同 由于由于DNADNA空间构象不同空间构象不同,在电泳时迁移率不同。,在电泳时迁移率不同。根据根据碱基互补配对原则碱基互补配对原则,可设计引物和探针,可设计引物和探针杂交。杂交。由于由于DNADNA的双螺旋结构和的双螺旋结构和RNARNA易由于分子内氢链易由于分子内氢链作用形成二级结构,所以在
19、进行杂交等反应时,作用形成二级结构,所以在进行杂交等反应时,首先首先应加热变性,破坏二级结构。应加热变性,破坏二级结构。第23页,共150页。l 在在解旋酶解旋酶的作用下,打开的作用下,打开DNADNA双链双链 l 在特定的在特定的复制起始点复制起始点l 以每条以每条DNADNA链为链为模板模板l 在在DNADNA聚合酶聚合酶的催化下的催化下l 以以4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸为前体物,合成一条为前体物,合成一条互补互补DNADNA链。链。DNADNA的复制双称为半保留复制。的复制双称为半保留复制。DNA的复制的复制第24页,共150页。第25页,共150页。DNA在复制起始点,由解旋酶打开
20、双链,形成复在复制起始点,由解旋酶打开双链,形成复制叉,制叉,合成新链的合成新链的方向为方向为5-35-3端端前导链与后随链前导链与后随链后随链的合成是不连续的后随链的合成是不连续的。先合成先合成RNARNA引物引物 再合成不连续的小片段再合成不连续的小片段(冈崎片段冈崎片段,10010010001000核苷酸长度核苷酸长度)最后在最后在DNADNA连接酶连接酶作用下,将小片段连接作用下,将小片段连接起,形成完整的起,形成完整的DNADNA链。链。第26页,共150页。DNA 半半 不不 连连 续续 复复 制制第27页,共150页。DNADNA的复制给了我们一些启示的复制给了我们一些启示 PC
21、R PCR技术的原理:在体外要靠温度技术的原理:在体外要靠温度(90(90以上以上)打双链,而不是解旋酶,也是以打双链,而不是解旋酶,也是以DNADNA为模,需要为模,需要引物,需引物,需DNADNA聚合酶,需要聚合酶,需要dNTPdNTP为前体。为前体。PCRPCR与与体内体内(细胞内细胞内)DNA)DNA复制的最大差异是温度复制的最大差异是温度。检测核分裂指数:在细胞培养中,检测核分裂指数:在细胞培养中,加入加入3 3H H标记标记的的dNTPdNTP前体物前体物,被细胞摄取后,参与,被细胞摄取后,参与DNADNA复制,复复制,复制速度越快,参入的制速度越快,参入的3 3H H标记的标记的
22、dNTPdNTP越多,可用液越多,可用液闪计数仪检测放射性强度,据此判断。闪计数仪检测放射性强度,据此判断。第28页,共150页。p遗传信息的传递是:遗传信息的传递是:DNARNA DNARNA多肽多肽(蛋白质蛋白质)p在逆转录酶的作用下,在逆转录酶的作用下,RNARNA可形成可形成cDNAcDNA,然后再由然后再由RNARNA蛋白质蛋白质以上就是完整的中心法则理论,亦可称为以上就是完整的中心法则理论,亦可称为基因的表达基因的表达(expression)(expression)。中心法则中心法则第29页,共150页。中中 心心 法法 则则第30页,共150页。转录转录(transcriptio
23、n)(transcription)以以DNADNA为模板,合成为模板,合成RNARNA的过程。的过程。非模板链称为有意义链,而模板常称为反义链非模板链称为有意义链,而模板常称为反义链。转录的过程大致是这样的:转录的过程大致是这样的:u 以以DNADNA一条链为一条链为模板模板,u 诱导诱导RNARNA聚合酶活性、聚合酶活性、RNARNA聚合酶识别聚合酶识别并结合在转录起并结合在转录起始位点始位点u 以以ATPATP、GTPGTP、CTPCTP和和UTPUTP为前体,为前体,合成合成(转录转录)RNA)RNAu 当遇到转录当遇到转录终止信号时,转录即停止终止信号时,转录即停止。第31页,共150
24、页。有意义链有意义链反义链反义链第32页,共150页。转录后的初级产物转录后的初级产物剪切掉内含子剪切掉内含子,并将外显子,并将外显子连接起来,这样才能变成成熟的连接起来,这样才能变成成熟的RNARNA分子分子还需要在还需要在5-5-端加一个特殊的核苷酸,端加一个特殊的核苷酸,7-7-甲基鸟甲基鸟嘌呤核苷酸嘌呤核苷酸,这个过程叫戴帽,这个过程叫戴帽另外,另外,mRNAmRNA的,这一过程又叫穿靴,的,这一过程又叫穿靴,3-3-端端还要加上一串腺苷酸还要加上一串腺苷酸(AMP)poly(A)(AMP)poly(A)或多聚腺苷酸或多聚腺苷酸化。化。同一机体不同的细胞具有相同的同一机体不同的细胞具有
25、相同的DNADNA或基因,但或基因,但基因在不同细胞的表达是不同的基因在不同细胞的表达是不同的,具有组织特异性,具有组织特异性,使不同的细胞具有不同的功能使不同的细胞具有不同的功能第33页,共150页。由由RNA RNA 蛋白质的过程,又叫翻译蛋白质的过程,又叫翻译。只有聚合酶。只有聚合酶IIII催催化的反应产物是化的反应产物是mRNAmRNA,而只有,而只有mRNAmRNA才翻译成蛋白质。才翻译成蛋白质。基因基因(DNA)(DNA)上三个相邻的碱基组成一个密码子上三个相邻的碱基组成一个密码子,一个密,一个密码子决定一种特定的氨基酸,共有码子决定一种特定的氨基酸,共有4 43 3=64=64个
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