单基因高血压PPT医学课件(PPT 113页).pptx

1、1.第1页，共113页。单基因高血压属于继发性高血压：单基因高血压属于继发性高血压：继发性高血压比我们想象的多继发性高血压比我们想象的多有人在三级甲等医学中心检查有人在三级甲等医学中心检查44294429例顽固性高血压发现：例顽固性高血压发现：10%10%为继发性高血压，为继发性高血压，6060岁以上的难治性高血压患者中岁以上的难治性高血压患者中17%17%为继发性高血压为继发性高血压（Anderson Anderson GH Jr,etal.J Hypertens 1994;12:609GH Jr,etal.J Hypertens 1994;12:609）一般估计：继发性高血压患病率一般估计

2、：继发性高血压患病率6%-20%6%-20%（难治性高血压）（难治性高血压）2.第2页，共113页。309309例例16-3016-30岁（平均岁（平均24.024.05.25.2岁）青年难治性高血压住院（岁）青年难治性高血压住院（2002-2002-20082008年）患者年）患者,40%,40%可找到病因可找到病因 青年顽固性高血压有青年顽固性高血压有40%40%能找到原因，解除病因，免得终生服药。能找到原因，解除病因，免得终生服药。原发性高血压原发性高血压 185185例例 59.9%59.9%继发性高血压占继发性高血压占 124124例例 40.1%40.1%肾动脉性高血压肾动脉性高血

3、压 8888例例 28.5%28.5%主动脉缩窄主动脉缩窄 1313例例 4.2%4.2%原醛原醛 9 9例例 2.9%2.9%肾实质高血压肾实质高血压 5 5例例 1.6%1.6%Liddle Liddle 综合征综合征 3 3例例 1.0%1.0%其他原因其他原因 3 3例例 1.0%1.0%未分类未分类 3 3例 1.0%1.0%其他原因：其他原因：1 1例白大衣高血压，例白大衣高血压，1 1例柯兴氏，例柯兴氏，1 1例肾素瘤例肾素瘤 吴燕，惠汝太等，未发表资料，吴燕，惠汝太等，未发表资料，20102010 3.第3页，共113页。盐敏感高血压：盐敏感高血压：50%50%，对利尿剂敏感，

4、对利尿剂敏感 原醛：多，原醛：多，10%-20%10%-20%嗜铬细胞瘤：估计中国嗜铬细胞瘤：估计中国9 9万万-11-11万，万，少，恶，可治愈少，恶，可治愈4.第4页，共113页。单基因继发性高血压：至少单基因继发性高血压：至少1919个致病基因个致病基因 9 9个导致嗜铬细胞瘤的基因个导致嗜铬细胞瘤的基因 1010个导致盐敏感高血压的致病基因个导致盐敏感高血压的致病基因 问题：我们没有诊断出来，需要提高问题：我们没有诊断出来，需要提高 需要把科学进步为患者带来的希望，送给患者需要把科学进步为患者带来的希望，送给患者 （转化）（转化）患者的最佳利益是我们考虑的唯一利益（患者的最佳利益是我们

5、考虑的唯一利益（MayoMayo）5.第5页，共113页。目前的目前的1919个高血压致病基因主要定位在肾与肾上腺个高血压致病基因主要定位在肾与肾上腺目前多数单基因高血压目前多数单基因高血压病因：肾离子通道，肾病因：肾离子通道，肾上腺。上腺。6.第6页，共113页。性激素性激素醛固酮醛固酮糖皮质激素糖皮质激素肾上腺皮质病肾上腺皮质病变：增生、变：增生、结节结节腺瘤，癌腺瘤，癌（少）（少）John Hoppkins 尸解发现一尸解发现一般人群肾上般人群肾上腺瘤患病腺瘤患病率率1.97%1.97%肾上腺髓质：分泌肾上腺髓质：分泌3737种升压物质，如种升压物质，如儿茶酚胺儿茶酚胺7.第7页，共11

6、3页。NEJM 361:2153-2164，2009肾脏处理离子（钠，钾；氯），肾脏处理离子（钠，钾；氯），对水盐代谢、血压调控起到重对水盐代谢、血压调控起到重要作用。要作用。有效利尿降压药的作用部位也有效利尿降压药的作用部位也主要在肾脏。主要在肾脏。肾皮质肾皮质肾髓质肾髓质8.第8页，共113页。NEDD4L/ENaC NEDD4L/ENaC 参与血压调控参与血压调控McCormick JA Physiology 20:134-139,2005.NEDD4L主要泛素化主要泛素化 ENaC(NEDD4L-WW 域与域与 ENaC 亚单位亚单位PY 域相互作域相互作用用)，泛素化的泛素化的ENa

7、C被胞饮、分解被胞饮、分解。GWAS：原发性高血压、家族性体位性低原发性高血压、家族性体位性低血压连锁到血压连锁到1818号染色体长臂号染色体长臂2121区区（18q21）NEDD4L 位于此区域位于此区域。9.第9页，共113页。Sgk1(serum glucocorticoid-inducible kinase)与与 Akt 磷酸化磷酸化Nedd4L(Nedd4-2)，磷酸化的磷酸化的 Nedd4L 可与可与 14-3-3结合结合,抑制抑制 Nedd4L与与ENaC的相互作用的相互作用Cell Death and Differentiation(2010)17,6877 上皮钠通道（上皮钠

8、通道（ENaCENaC）活性调控）活性调控（1）正常）正常（2）ENaC突变突变（3 3）高醛固酮）高醛固酮 高胰岛素高胰岛素10.第10页，共113页。原醛比率原醛比率 中国高血压中国高血压3.43.4亿亿全部高血压中约全部高血压中约 6.1%6.1%为原醛为原醛 2000万万 1期高血压有期高血压有 2%2期高血压期高血压 8%（SBP180-179，DBP100-109）3期高血压期高血压 13%（SBP180,或DBP110）难治性高血压难治性高血压 17%-23%自发低血钾与利尿剂诱发的低血钾高血压患者自发低血钾与利尿剂诱发的低血钾高血压患者：非常常见非常常见 肾上腺孤立瘤：在普通人

9、群中约肾上腺孤立瘤：在普通人群中约2%（报告范围（报告范围1.1-10%）多少是由基因突变所致？多少是由基因突变所致？原发性醛固酮增多症原发性醛固酮增多症11.第11页，共113页。家族性与散发原醛的遗传机制家族性与散发原醛的遗传机制 三种临床类型：三种临床类型：FH-1:FH-1:GRA GRA，嵌合基因突变（，嵌合基因突变（CYP11B2/B1CYP11B2/B1)FH-2:FH-2:最常见最常见,但没有发现致病基因；连锁位点但没有发现致病基因；连锁位点7p22 7p22 FH-3:FH-3:KCNJ5 KCNJ5突变引起突变引起APAs(aldosterone producing APA

10、s(aldosterone producing adenomas)adenomas)。其他点突变、遗传重排伴。其他点突变、遗传重排伴LOHLOH尚待发现、证实。尚待发现、证实。FHxFHx：其他孟德尔型的原醛可能存在。其他孟德尔型的原醛可能存在。最常见的两侧肾上腺增生（最常见的两侧肾上腺增生（BAHBAH，bilateral adrenal bilateral adrenal hyperplasia),hyperplasia),致病基因突变尚未找到。致病基因突变尚未找到。12.第12页，共113页。家族与散发原发性醛固酮增多症遗传机制家族与散发原发性醛固酮增多症遗传机制FH:FH:家族性高醛固

11、酮血症家族性高醛固酮血症Circ Res 2011;108:1417FH1FH1：GRA,GRA,CYP11B2/B1嵌合基因突变嵌合基因突变FH3FH3：致病基因：致病基因：KCNJ5KCNJ5，编码钾通道，编码钾通道Kir3.4Kir3.4，FH2:FH2:连锁在连锁在7p227p22Copyright American Heart Association家族性家族性散发散发13.第13页，共113页。诊断步骤诊断步骤 表型表型(phenotype):(phenotype):提供诊断线索提供诊断线索 基因诊断：金标准，基因诊断：金标准，注意外显率注意外显率(penetrance)拟表型（拟

12、表型（phenocopyphenocopy）定位：病变定位定位：病变定位14.第14页，共113页。与原发性醛固酮增多症有关的与原发性醛固酮增多症有关的单基因疾病的诊断路径单基因疾病的诊断路径1 1，临床表现：可疑原醛，临床表现：可疑原醛2 2，筛查试验：，筛查试验：ARRARR（醛固酮（醛固酮/肾素活性比率）肾素活性比率）3 3，确诊试验：，确诊试验：4 4个个4 4，肿瘤定位，良、恶性：影像，肿瘤定位，良、恶性：影像5 5，鉴别腺瘤还是增生？，鉴别腺瘤还是增生？6 6，两侧还是一侧病变：手术还是保守？，两侧还是一侧病变：手术还是保守？7 7，术后随访，术后随访15.第15页，共113页。原

13、发性醛固酮增多症的筛查原发性醛固酮增多症的筛查16.第16页，共113页。表型：表型：高血压高血压-低血钾低血钾-血浆肾素活性（血浆肾素活性（PRAPRA）抑制）抑制1 1，血钾，血钾，2424小时尿钾小时尿钾 临床意义临床意义 30mEq 30mEq 存在失钾存在失钾 25mEq 25mEq 存在失钾存在失钾2 2，PRAPRA抑制抑制1ng/ml/h15ng/dl 15ng/dl 7ug?7ug?,钠负荷后钠负荷后12-14ug12-14ug 17.第17页，共113页。原醛诊断：筛查原醛诊断：筛查/确诊确诊/定位定位筛查：筛查：清晨血浆肾素活性，醛固酮清晨血浆肾素活性，醛固酮 禁用安体舒

14、通、依普利酮、大剂量阿米洛利。禁用安体舒通、依普利酮、大剂量阿米洛利。其他降压药可不停。其他降压药可不停。一般疑诊为原醛：一般疑诊为原醛：1.ARR1.ARR2020（醛固酮（醛固酮 ng/dl/PRA AI ng/ml/ng/dl/PRA AI ng/ml/小时）小时）2.2.且血浆醛固酮且血浆醛固酮15ng/dl15ng/dl，同时，同时PRA1ng/ml/PRA11，若，若11支持诊断，支持诊断，如如0.46565岁，年龄所致的肾素降低比醛固酮更明显，因此，岁，年龄所致的肾素降低比醛固酮更明显，因此，ARRARR加大。加大。采血时间，近期饮食状况，体位，站立位置采血时间，近期饮食状况，体

15、位，站立位置用药情况用药情况采血方法采血方法,是否有困难是否有困难血钾水平血钾水平肌酐水平：肾衰可导致肌酐水平：肾衰可导致ARRARR假阳性。假阳性。23.第23页，共113页。19类影响因素类影响因素24.第24页，共113页。原发性醛固酮增多症的确诊原发性醛固酮增多症的确诊 方法方法-4-4个个25.第25页，共113页。原发性醛固酮增多症的确诊方法原发性醛固酮增多症的确诊方法-1-1：口服口服NaClNaCl试验试验1 1）禁忌：存在下列情形，禁止做此试验：）禁忌：存在下列情形，禁止做此试验：（1 1）严重没有控制的高血压（）严重没有控制的高血压（180/110180/110）,（2 2

16、）肾功不全，）肾功不全，（3 3）心功不全，）心功不全，（4 4）心律失常，）心律失常，（5 5）严重低血钾，）严重低血钾，2 2）试验过程中严密监测血压，心脏功能）试验过程中严密监测血压，心脏功能 3 3）试验：每天口服）试验：每天口服NaCl 12NaCl 12克（克（Na 6Na 6克，克，200 mmol/200 mmol/天）天）共共3 3天，天，Day-3Day-3早早7 7点开始留点开始留2424小时尿，小时尿，day-4day-4早上早上7am7am结结 束，混匀，计量总尿量，取束，混匀，计量总尿量，取100ml100ml保存，测定保存，测定2424小时尿小时尿 醛固酮。醛固酮

17、。26.第26页，共113页。原发性醛固酮增多症的确诊方法原发性醛固酮增多症的确诊方法-1口服口服NaCl 试验试验 4）结果判断：结果判断：（1）基本排除原醛：无肾病时尿醛固酮）基本排除原醛：无肾病时尿醛固酮12ug/24小（小（33.3nmol/天）；天）；Cleveland 标准：尿醛固酮标准：尿醛固酮14ug/24小（小（38.8nmol/天）天）放射免疫方法测定尿醛固酮的问题：放射免疫方法测定尿醛固酮的问题：尿醛固酮代谢产物，如醛固酮尿醛固酮代谢产物，如醛固酮-酮酮（oxo）葡萄糖醛酸，酸敏感代葡萄糖醛酸，酸敏感代谢产物，干扰测定结果。谢产物，干扰测定结果。解决方案：解决方案：HPL

18、C-MS HPLC-MS 方法方法。27.第27页，共113页。原发性醛固酮增多症的确诊方法原发性醛固酮增多症的确诊方法-2-2，静脉盐水负荷试验静脉盐水负荷试验1 1）禁忌：存在下列情形，禁止做次试验：）禁忌：存在下列情形，禁止做次试验：（1 1）严重没有控制的高血压（）严重没有控制的高血压（180/110180/110）,（2 2）肾功不全，）肾功不全，（3 3）心功不全，）心功不全，（4 4）心律失常，）心律失常，（5 5）严重低血钾，）严重低血钾，2 2）试验过程中严密监测血压，心脏功能）试验过程中严密监测血压，心脏功能28.第28页，共113页。原发性醛固酮增多症的确诊方法原发性醛固

19、酮增多症的确诊方法-2-2静脉盐水负荷试验静脉盐水负荷试验3)3)操作：操作：7am 7am 卧床歇息卧床歇息1 1小时后，取血测定血浆肾素活性（或肾素），醛固小时后，取血测定血浆肾素活性（或肾素），醛固 酮，皮质醇，血钾，血压，心率；酮，皮质醇，血钾，血压，心率；8am 8am 静脉输静脉输2000ml 0.9%NaCl2000ml 0.9%NaCl，4 4小时输完，小时输完，12am 12am 抽血测定血浆肾素活性（或肾素），醛固酮，皮质醇，血钾，抽血测定血浆肾素活性（或肾素），醛固酮，皮质醇，血钾，血压，心率。血压，心率。4 4）结果判断：）结果判断：基本排除原醛：输基本排除原醛：输20

20、00ml2000ml盐水后血浆醛固酮水平盐水后血浆醛固酮水平5ng/dl10ng/dl 10ng/dl 277 pmol/l)；没有被盐水抑制；没有被盐水抑制居间：血浆居间：血浆5-10 ng/dl5-10 ng/dlIntravenous sodium loading should start during the morning,as the circadian rhythm of ACTH will lower PAC in some patients with adenoma and GRA,thereby generating false-negative results.29.第2

21、9页，共113页。原发性醛固酮增多症的确诊方法原发性醛固酮增多症的确诊方法-3 3，氟氢可的松抑制试验氟氢可的松抑制试验氟氢可的松抑制试验：最好住院做，便于监测血钾。氟氢可的松抑制试验：最好住院做，便于监测血钾。氟氢可的松氟氢可的松0.1mg 0.1mg 口服口服 q6hq6h，服，服4 4天。天。同时口服缓释钾，保持血钾在同时口服缓释钾，保持血钾在4mEq/L,4mEq/L,同时口服缓释钠同时口服缓释钠1.81.8克克 q6hq6h；维持尿钠至少；维持尿钠至少3mmol/kg3mmol/kg体重；体重；第第4 4天，天，7am7am，10am 10am 坐位，分别抽血测定血皮质醇，坐位，分别

22、抽血测定血皮质醇，10am 10am 测测定坐位（立位）血浆醛固酮，血浆肾素活性。定坐位（立位）血浆醛固酮，血浆肾素活性。结果判断结果判断：确诊原醛：确诊原醛：day4day4，10am10am立位血浆醛固酮立位血浆醛固酮6ng/dl,6ng/dl,PRA1ng/ml/PRA1ng/ml/小时；小时；10am10am血浆皮质醇血浆皮质醇7am30%,30%,原醛患者：原醛患者：血浆醛固酮仍高，血浆肾素活性仍被抑制。血浆醛固酮仍高，血浆肾素活性仍被抑制。特发性肾上腺增生患者：特发性肾上腺增生患者：有时醛固酮可被抑制。有时醛固酮可被抑制。31.第31页，共113页。若患者有下列指征，怀疑若患者有下

23、列指征，怀疑GRAGRA，建议做地塞米松抑制试验及遗传检查建议做地塞米松抑制试验及遗传检查1)1)原发性醛固酮增多症已确诊，但肾上腺原发性醛固酮增多症已确诊，但肾上腺CTCT等影像检查阴性等影像检查阴性2)2)有原发性醛固酮增多症家族史有原发性醛固酮增多症家族史3)3)或本人或直系亲属年龄或本人或直系亲属年龄401(1周周)会导致会导致GRAGRA患者肾素患者肾素-血管紧张素血管紧张素-醛醛固酮系统被激活，出现假阴性结果。固酮系统被激活，出现假阴性结果。地塞米松抑制试验不能完全鉴别产生醛固酮的腺瘤与地塞米松抑制试验不能完全鉴别产生醛固酮的腺瘤与GRAGRA，文献报告地塞米松剂量文献报告地塞米松

24、剂量2 28 mg/8 mg/天，天，试验时间：试验时间：2 2 天到天到4 4周；多数试验使用周；多数试验使用 Liddle Liddle 等推荐的口口服地塞米松服地塞米松0.750.752.0 mg/2.0 mg/天，至少用两天；天，至少用两天；在口服地塞米松前及负荷完成后测定血浆醛固酮浓度，同时在口服地塞米松前及负荷完成后测定血浆醛固酮浓度，同时测定皮质醇以保证测定皮质醇以保证ACTHACTH得到充分抑制。得到充分抑制。33.第33页，共113页。FH-1:糖皮质激素可以治疗的醛固酮增多症糖皮质激素可以治疗的醛固酮增多症Glucocorticoid remediable aldoster

25、onism(GRA）假性家族性高醛固酮血症假性家族性高醛固酮血症-II-II型（型（PHA-IIPHA-II）编码醛固酮合成酶与编码编码醛固酮合成酶与编码11-11-羟化酶的基因位于第羟化酶的基因位于第8 8号染色体，同号染色体，同源性源性95%95%；GRAGRA患者患者,11-,11-羟化酶基因的羟化酶基因的5 5-调控序列融合到醛固酮合成酶的编码调控序列融合到醛固酮合成酶的编码区，杂交基因的产物区，杂交基因的产物-醛固酮合成酶醛固酮合成酶ACTHACTH敏感。敏感。杂交基因位于束状带。醛固酮的产生在杂交基因位于束状带。醛固酮的产生在ACTHACTH调控下。调控下。34.第34页，共113

26、页。嵌合基因嵌合基因CYP11B2/B135.第35页，共113页。醛固酮合成：从球状带易位到束状带醛固酮合成：从球状带易位到束状带性激素性激素醛固酮醛固酮糖皮质激素糖皮质激素36.第36页，共113页。GRA症状：可以没有症状症状：可以没有症状疲劳，头疼，疲劳，头疼，高血压，低血钾，高血压，低血钾，肌肉软弱，麻木，肌肉痉挛，间歇性或暂时性瘫痪，肌肉软弱，麻木，肌肉痉挛，间歇性或暂时性瘫痪，烦渴，烦渴，高血钠高血钠代谢性碱中毒代谢性碱中毒家族性早发脑血管意外家族性早发脑血管意外37.第37页，共113页。1）Southern Blot2）Long-range PCR S1:CYP11B2 S2

27、:嵌合基因嵌合基因GRA基因诊断基因诊断嵌合基因检查可使诊断敏感性嵌合基因检查可使诊断敏感性与特异性均达到与特异性均达到100%100%，高度可，高度可疑的患者应当建议基因诊断疑的患者应当建议基因诊断。38.第38页，共113页。GRAGRA治疗治疗 1)1)地塞米松：地塞米松：0.25mg qd0.25mg qd 2)2)依普利酮：依普利酮：50mg-100mg qd50mg-100mg qd 3)3)螺内酯：螺内酯：20mg tid20mg tid 因为因为GRAGRA患者的高醛固酮与高血压均是患者的高醛固酮与高血压均是ACTHACTH调控的醛固调控的醛固酮过分泌所致，糖皮质类固醇可以反馈

28、性抑制酮过分泌所致，糖皮质类固醇可以反馈性抑制ACTHACTH分泌。因分泌。因此，小剂量糖皮质类固醇（如每天地塞米松此，小剂量糖皮质类固醇（如每天地塞米松0.25mg0.25mg口服）可口服）可纠正纠正GRAGRA患者的高醛固酮血症及高血压（有时需要患者的高醛固酮血症及高血压（有时需要8 8周方见周方见效）。效）。另有报告，螺内酯，依普利酮（每天另有报告，螺内酯，依普利酮（每天50-100mg50-100mg）亦有）亦有效。效。39.第39页，共113页。FH-2:PHA-IIFH-2:PHA-II型，地塞米松不能抑制的高血压型，地塞米松不能抑制的高血压低肾素低肾素,高醛固酮，高醛固酮，18-

29、oxo18-oxo皮质醇，皮质醇，18-18-羟皮质醇，类固醇非常羟皮质醇，类固醇非常高。高。上述表现反应上述表现反应17-17-羟化酶与醛固酮合成酶氧化反应活跃。地塞羟化酶与醛固酮合成酶氧化反应活跃。地塞米松无效，提示是另一种常染色体遗传性高血压。米松无效，提示是另一种常染色体遗传性高血压。基因检查：虽然最常见基因检查：虽然最常见,但没有发现致病基因；连锁位点但没有发现致病基因；连锁位点7p227p22但是，病理改变：肾上腺特别大，两侧可达但是，病理改变：肾上腺特别大，两侧可达8282克。克。组织学：束状带增生（糖皮质素高？），细胞肥厚，球状带萎缩。组织学：束状带增生（糖皮质素高？），细胞肥

30、厚，球状带萎缩。40.第40页，共113页。基本概念复习基本概念复习41.第41页，共113页。体体细胞突变细胞突变(Somatic mutation)(Somatic mutation)：体细胞体细胞（Somatic cells)Somatic cells)：生物体内除生物体内除生殖细胞以外的所有细胞。体细胞以外的所有细胞。体细胞突变细胞突变：发生在体：发生在体细胞内的突变，只影响其子代细胞，不遗传后代。细胞内的突变，只影响其子代细胞，不遗传后代。如如辐射伤害：人体有躯体细胞和生殖细胞两类细胞，它们对辐射伤害：人体有躯体细胞和生殖细胞两类细胞，它们对电离辐射的敏感性和受损后的效应是不同的。电

31、离辐射对机体的电离辐射的敏感性和受损后的效应是不同的。电离辐射对机体的损伤其本质是对细胞的灭活作用，当被灭活的细胞达到一定数量损伤其本质是对细胞的灭活作用，当被灭活的细胞达到一定数量时，躯体细胞的损伤会导致人体器官组织发生疾病，最终可能导时，躯体细胞的损伤会导致人体器官组织发生疾病，最终可能导致人体死亡。躯体细胞一旦死亡，损伤细胞也随之消失了，不会致人体死亡。躯体细胞一旦死亡，损伤细胞也随之消失了，不会传递给下一代。传递给下一代。胚系突变（胚系突变（germinal mutationgerminal mutation，生殖细胞基因突变，生殖细胞基因突变):):在电离辐射或其他外界因素的影响下，

32、可导致遗传基因发生突在电离辐射或其他外界因素的影响下，可导致遗传基因发生突变，当生殖细胞中的变，当生殖细胞中的DNADNA受到损伤时，后代遗传到父母改变了受到损伤时，后代遗传到父母改变了的基因，导致有缺陷的后代。的基因，导致有缺陷的后代。42.第42页，共113页。等位基因（等位基因（alleleallele）：位于同源染色体的同一位置上）：位于同源染色体的同一位置上的基因的基因若一个座位上的基因以两个以上的状态存若一个座位上的基因以两个以上的状态存在，便称为在，便称为复等位基因复等位基因。若成对的等位基因中两个成员完全相同，若成对的等位基因中两个成员完全相同，则该个体对此性状来说成为则该个体

33、对此性状来说成为纯合子纯合子。若两个等位基因各不相同，则该个体对该若两个等位基因各不相同，则该个体对该性状来说是性状来说是杂合子杂合子。在杂合子配对中，显性等位基因使隐性等在杂合子配对中，显性等位基因使隐性等位基因的性状得不到表现。某些成对基因位基因的性状得不到表现。某些成对基因的两个成员为共显性的，即彼此间没有显的两个成员为共显性的，即彼此间没有显性和隐性的关系。性和隐性的关系。43.第43页，共113页。纯合性缺失纯合性缺失,就是染色体上的一对等位基因一起缺失就是染色体上的一对等位基因一起缺失;杂合性缺失（杂合性缺失（loss of heterozygosity,LOHloss of he

34、terozygosity,LOH）：）：就是只丢失了一条同源染色体上的基因就是只丢失了一条同源染色体上的基因,另一条还在另一条还在,通常通常如果另一条上的基因突变或者甲基化，使基因不能表达如果另一条上的基因突变或者甲基化，使基因不能表达,如果发生在抑癌基因上就可能导致肿瘤。如果发生在抑癌基因上就可能导致肿瘤。基因缺失，就是没有了，不能表达某一蛋白了，或者干脆基因缺失，就是没有了，不能表达某一蛋白了，或者干脆少了这一个位点。少了这一个位点。44.第44页，共113页。找突变的技术：找突变的技术：somatic mutation screening-somatic mutation screeni

35、ng-组织（表组织（表观），全基因组观），全基因组-胚突变，胚突变，要发现的突变类型：要发现的突变类型：杂合性缺失杂合性缺失（loss of heterozygosityloss of heterozygosity，LOH)LOH)：见于：见于 绝大多数病例绝大多数病例点突变点突变（point mutations）CN-LOH CN-LOH（copy-neutral LOHcopy-neutral LOH）/UPD/UPD*拷贝数平衡的杂拷贝数平衡的杂 合性缺失合性缺失/单亲源二体单亲源二体（uniparental disomyuniparental disomy，UPDUPD）指一对杂合的等

36、位基因变成纯合状态的现象指一对杂合的等位基因变成纯合状态的现象UPD:UPD:指一个个体的两条等位基因均来自同一个亲本。指一个个体的两条等位基因均来自同一个亲本。45.第45页，共113页。杂合性丢失杂合性丢失是指肿瘤基因是指肿瘤基因组中特定染色体上的某种组中特定染色体上的某种DNADNA多态标记的等位基因片段多态标记的等位基因片段,由同一患者正常组织基因组由同一患者正常组织基因组的两种变成一种，即等位基的两种变成一种，即等位基因型由杂合子变成纯合子。因型由杂合子变成纯合子。而不是丢失了一条同源染色而不是丢失了一条同源染色体的基因。其实这个也就是体的基因。其实这个也就是肿瘤发生学中的肿瘤发生学

37、中的“二次突变学二次突变学说说”所说的丢失了一条，一对抑所说的丢失了一条，一对抑癌基因丢失了其中之一，变癌基因丢失了其中之一，变成了杂合子，这是第一次突变，成了杂合子，这是第一次突变，一般发生在出生前，后来再发生一般发生在出生前，后来再发生第二次突变时，就是杂合子变成第二次突变时，就是杂合子变成了纯合子，也就是杂合性缺失，了纯合子，也就是杂合性缺失，抑癌基因缺失，与肿瘤的发生相抑癌基因缺失，与肿瘤的发生相关。关。46.第46页，共113页。杂合性缺失的检测杂合性缺失的检测 通常用定量荧光检测通常用定量荧光检测strstr（短核苷酸串连重复多态，微卫星）不同微卫星）不同重复次数的峰值。重复次数的

38、峰值。如果两个峰值之前的比例是如果两个峰值之前的比例是1:1,1:1,说明一对等位基因都存在说明一对等位基因都存在,未缺失未缺失;如果比值不是如果比值不是1:1,1:1,且差别比较大且差别比较大,说明可能有杂合性缺失说明可能有杂合性缺失;如果只有一个峰如果只有一个峰,有两种可能有两种可能:1 1）正常基因组有两个峰）正常基因组有两个峰,只一个峰说明有缺失。只一个峰说明有缺失。2 2）正常基因组只有一个重合峰）正常基因组只有一个重合峰,则看标本的峰是不是将近两倍则看标本的峰是不是将近两倍高高,如果是将近两倍高，说明正常如果是将近两倍高，说明正常,如果峰值比较低如果峰值比较低,不到两倍不到两倍,那

39、有可能是缺失那有可能是缺失,但这样判断不精确但这样判断不精确,通常需要换一个位点再看。通常需要换一个位点再看。47.第47页，共113页。杂合性缺失检测方法：杂合性缺失检测方法：FISH,strFISH,str（微卫星片断分析，微卫卫星多态位点是一种短核苷酸串连重复多态short tandom repeat,STR）,SNPSNPfish结果判断简洁明了,但贵,而且操作难度大。做snp可能需要MGB探针。StrStr：一对同源染色体上同一一对同源染色体上同一strstr位点的重复次数不一定相同位点的重复次数不一定相同,pcr,pcr扩增扩增strstr全长全长,再跑胶再跑胶,如果出现两条带如果

40、出现两条带,就说明该就说明该strstr位点是杂合子位点是杂合子,假如你在肿瘤细胞中只看到一假如你在肿瘤细胞中只看到一条带条带,那说明有杂合性缺失。那说明有杂合性缺失。如果该位点本来就是纯合子如果该位点本来就是纯合子,需要结合其他位点分析需要结合其他位点分析,所以做所以做strstr需需要多个位点。要多个位点。如果没有正常如果没有正常DNADNA作对照作对照,跑出的胶图全是单峰跑出的胶图全是单峰,不能排除全纯合子。不能排除全纯合子。用测序仪做会简单些用测序仪做会简单些,但原理一样。检测杂合性缺失比较常用的方法但原理一样。检测杂合性缺失比较常用的方法snpsnp和和strstr，如果有测序仪，如

41、果有测序仪，strstr方法比较方便；如果没有测序仪，方法比较方便；如果没有测序仪，pcrpcr后再跑后再跑pagepage胶胶,麻烦但很便宜麻烦但很便宜。48.第48页，共113页。T T：肿瘤组织DNADNA；N N：远癌肺组织DNADNA。EcoREcoR酶切后肿瘤组织2.4?kb2.4?kb杂交带发生了缺失；BglBgl酶切后肿瘤组织7.6?kb7.6?kb杂交带发生缺失(如箭头所示)。nm23-H1nm23-H1等位基因缺失等位基因缺失nm23-H1和和nm23-H2探针杂交探针杂交 49.第49页，共113页。C、D为同一张膜，人组织为同一张膜，人组织DNA经经Bgl酶切后分别进行

42、了酶切后分别进行了nm23-H1和和nm23-H2探针探针杂交，杂交，nm23-H1杂交后杂交后(A)，11号为杂合子，含有号为杂合子，含有7.6和和2.3?kb杂交带，杂交带，12号为纯合子，号为纯合子，仅有仅有2.3?kb，无，无7.6?kb杂交带；杂交带；nm23-H2杂交后杂交后(B)，nm23nm23等位基因缺失：等位基因缺失：人组织DNA经EcoR酶切后，与nm23-H1探针杂交显示，11号为号为第一种类型杂交图，含有第一种类型杂交图，含有2.8和和2.4?kb杂交带，杂交带，12号为第二种类型杂交图，含有号为第二种类型杂交图，含有4.2、2.8和和2.4?kb杂交带。杂交带。T：

43、肿瘤组织：肿瘤组织DNA；N：远癌肺组织：远癌肺组织DNA。A、B为同一张膜，人组织为同一张膜，人组织DNA经经EcoR酶酶切后分别与切后分别与nm23-H1和和nm23-H2探针杂交。探针杂交。(A)：11号为杂合子，含有号为杂合子，含有4.6、2.4及及2.2?kb杂交带，杂交带，12号为纯合子，仅含号为纯合子，仅含4.6及及2.2?kb杂交带；杂交带；(B)只有一种杂交图只有一种杂交图(21、6.7、3.9?kb三条杂交带三条杂交带)。AB无无7.6kb带带无无2.2带带50.第50页，共113页。FH-3:FH-3:KCNJ5KCNJ5突变引起产醛固酮的腺瘤（突变引起产醛固酮的腺瘤（A

44、PAsAPAs，aldosterone producing adenomas)aldosterone producing adenomas)；其他点突变、其他点突变、遗传重排伴遗传重排伴LOHLOH（杂合缺失）尚待发现、证实。（杂合缺失）尚待发现、证实。51.第51页，共113页。体细胞突变体细胞突变/胚细胞突变？肿瘤组织找突变，外周血胚细胞突变？肿瘤组织找突变，外周血基因组基因组DNADNA找突变找突变新技术：全外显子测序（新技术：全外显子测序（whole exome sequencingwhole exome sequencing）4个腺瘤个腺瘤（APA）的的DNA及及4个配对未受累对照的

45、腺瘤个配对未受累对照的腺瘤DNA（pairs from unrelated subjects）,作者在作者在3个肿瘤组织中查到体细胞个肿瘤组织中查到体细胞KCNJ5 基因突变基因突变；再对再对6 6个患者的个患者的1818个腺瘤个腺瘤（APA）进行筛查，发现进行筛查，发现KCNJ5 突变。只有2个突变（G151RG151R与与 L168RL168R）重复出现，位于影响Kir3.4 钾通道选择性滤过功能部位。在在 FH-3 家系中发现家系中发现类似的胚细胞突变类似的胚细胞突变T158A,位于相同的保守区域位于相同的保守区域。Science.2011;331:76877252.第52页，共113页

46、。Three-dimensional models of the Kir3.1/Kir3.4 channel.Dibb K M et al.J.Biol.Chem.2003;278:49537-495482003 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology只有2 2个突变（G G151151R R与L L168168R R）重复出现，位于影响Kir3.4Kir3.4钾通道选择性滤过功能部位。T T158158A A（胚性突变）（胚性突变）KCNJ5 编码内向钾电流通道 Kir3.4 以同源4聚体与Kir3.1形成异四聚体

47、存在。形成异四聚体存在。异四聚体异四聚体53.第53页，共113页。基因突变的功能研究基因突变的功能研究-下结论下结论作者用电生理研究方法证明：这些突变导致作者用电生理研究方法证明：这些突变导致Kir3.4Kir3.4功能改变：功能改变：钾通道丧失选择性，增加钠电导，增加膜除极。钾通道丧失选择性，增加钠电导，增加膜除极。肾上腺皮质球状带细胞合成醛固酮肾上腺皮质球状带细胞合成醛固酮,膜除极导致电压膜除极导致电压-激活的钙通激活的钙通道开放道开放,调控醛固酮合成的主要信号通路调控醛固酮合成的主要信号通路-钙信号通路激活。钙信号通路激活。根据这些基因结构与突变基因功能研究结果，作者得出以下结论：根据

48、这些基因结构与突变基因功能研究结果，作者得出以下结论：KCNJ5KCNJ5 突变参与遗传性与获得性醛固酮增多症的发病。突变参与遗传性与获得性醛固酮增多症的发病。KCNJ5KCNJ5 突突变导致肾上腺皮质细胞自主增生，足以引起持续性醛固酮分泌，变导致肾上腺皮质细胞自主增生，足以引起持续性醛固酮分泌，细胞增殖。细胞增殖。K+Channel Mutations in Adrenal Aldosterone-Producing Adenomas and Hereditary HypertensionChoi et al Science.2011;331:768772 54.第54页，共113页。KCN

49、J5KCNJ5 编码钾通道编码钾通道 Kir3.4Kir3.4突变突变,导致相当一部分导致相当一部分APAsAPAs（adrenal aldosterone producing adenoma），），生殖细胞生殖细胞KCNJ5 KCNJ5 突变引起罕见常染色体显性、早发突变引起罕见常染色体显性、早发型型PALPAL（以两侧肾上腺结节样增生为主，临床常诊为（以两侧肾上腺结节样增生为主，临床常诊为FH-3FH-3（family hyperaldosteronism FHfamily hyperaldosteronism FH）PAL:Primary aldosteronism，idiopathic

50、 hyperaldosteronism（BAH 两侧增生）Science.2011;331:76877255.第55页，共113页。解释出乎预料的发现解释出乎预料的发现-1-1：为什么突变相似，体细胞为什么突变相似，体细胞KCNJ5KCNJ5 突突变可以导致变可以导致APAAPA；而；而KCNJ5KCNJ5胚系突变导致两侧肾上腺增生而没有结胚系突变导致两侧肾上腺增生而没有结节？节？3 3个携带胚系突变（个携带胚系突变（T158A T158A KCNJ5KCNJ5）的家庭成员）的家庭成员,均接受两侧肾均接受两侧肾上腺切除，显示他们的肾上腺束状带广泛增生，但没没有发现上腺切除，显示他们的肾上腺束状