农杆菌介导法课件.ppt

1、12.5 植物基因工程231983年年首次成功实现了将外源基因首次成功实现了将外源基因(Bt基因基因)导入植物（导入植物（烟草烟草）进行表达。到现在进行表达。到现在100多种不同的植物物种都实现了转化。多种不同的植物物种都实现了转化。1994年：年：首个转基因食品（延熟首个转基因食品（延熟番茄番茄）在美国上市）在美国上市1996年年：转基因作物种植商业化的第一年，仅有：转基因作物种植商业化的第一年，仅有6个国家个国家2007年：年：232008年：年：252009年：年：252010年：年：29我国目前共有我国目前共有7种种转基因植物允许商业化种植，包括番茄、转基因植物允许商业化种植，包括番茄

2、、甜椒、辣椒、矮牵牛、玉米、水稻、棉花，其中种植面积最甜椒、辣椒、矮牵牛、玉米、水稻、棉花，其中种植面积最多的是转基因多的是转基因棉花棉花。*45截至截至2009年底，全球已有年底，全球已有25个国家个国家批准了批准了24种转基因作物种转基因作物的商业化应用。的商业化应用。672009年我国种植的转基因农作物主要是年我国种植的转基因农作物主要是棉花棉花。2010年年4月月2日：日：2009年第三批安全证书中，年第三批安全证书中，181个项目中有个项目中有172个是棉花。个是棉花。8“中国生物安全网中国生物安全网”隶属农业部农业转基因生物安全管理隶属农业部农业转基因生物安全管理办公室，专门负责发

3、布相关政策及审批信息办公室，专门负责发布相关政策及审批信息http:/ Bacillus thuringiensisthuringiensis,Bt),Bt)革兰氏阴性菌，菌体短杆状，生革兰氏阴性菌，菌体短杆状，生鞭毛，单生或形成短链，内生芽鞭毛，单生或形成短链，内生芽孢孢有若干菌株（亚种），产生不同有若干菌株（亚种），产生不同的毒素，能特异地杀死不同昆虫。的毒素，能特异地杀死不同昆虫。1319011901年在日本被发现年在日本被发现苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌1911 1911 年由贝利纳年由贝利纳（E.BerlinerE.Berliner）从德国苏云金地区一家面粉厂）从德国苏云金地区一家面

4、粉厂寄出的地中海粉螟的患病幼虫中分离出来，寄出的地中海粉螟的患病幼虫中分离出来，19151915年被命名年被命名.19511951年发现具有潜在商业价值年发现具有潜在商业价值是当前国内外是当前国内外研究最多，应用最广泛，最成功、研究最多，应用最广泛，最成功、开发时间最长、产量最大开发时间最长、产量最大的杀虫细菌的杀虫细菌能感染能感染130130多种鳞翅目幼虫和一些膜翅目、双多种鳞翅目幼虫和一些膜翅目、双翅目、直翅目和鞘翅目的一些昆虫，如吉卜赛翅目、直翅目和鞘翅目的一些昆虫，如吉卜赛毒蛾、小菜蛾、松毛虫、枞色卷蛾等毒蛾、小菜蛾、松毛虫、枞色卷蛾等14BtBt能杀死宿主昆虫主要靠其能杀死宿主昆虫主

5、要靠其芽孢芽孢和和毒素（毒素（）。）。细菌营养生长到一定阶段后，在细菌的一端形成芽孢，另细菌营养生长到一定阶段后，在细菌的一端形成芽孢，另一端形成伴孢晶体（蛋白质晶体、近菱形）。菌体破裂后一端形成伴孢晶体（蛋白质晶体、近菱形）。菌体破裂后可释放出芽孢和伴孢晶体。可释放出芽孢和伴孢晶体。伴胞晶体伴胞晶体主要由蛋白质（主要由蛋白质（杀虫晶体蛋白杀虫晶体蛋白，ICPICP，crycry）和糖）和糖组成，不溶于水或有机溶剂组成，不溶于水或有机溶剂,有一定耐热能力有一定耐热能力(100(100下保下保毒毒30min)30min)，可溶于碱性溶液。，可溶于碱性溶液。*15当昆虫吞食后，当昆虫吞食后，ICP

6、ICP在昆虫中肠的在昆虫中肠的碱性消化液碱性消化液和和胰蛋白酶胰蛋白酶作用作用下，变成有活性的毒蛋白，并与昆虫中肠上皮细胞上的特异下，变成有活性的毒蛋白，并与昆虫中肠上皮细胞上的特异性受体结合，全部或部分嵌合于细胞膜中形成离子通道，造性受体结合，全部或部分嵌合于细胞膜中形成离子通道，造成膜穿孔，细胞渗透平衡受到破坏，代谢终止，昆虫停止进成膜穿孔，细胞渗透平衡受到破坏，代谢终止，昆虫停止进食，最后脱水死亡。食，最后脱水死亡。由于由于ICPICP要形成有活性的毒蛋白，要形成有活性的毒蛋白，必须同时具备碱性条件和特必须同时具备碱性条件和特定的蛋白酶才能产生，因此人畜不受影响定的蛋白酶才能产生，因此人

7、畜不受影响。杀虫晶体蛋白的杀虫作用机理杀虫晶体蛋白的杀虫作用机理*16芽孢芽孢（sporespore）细菌生长到一定阶段形成的一种结构，是营养细胞的休眠体。细菌生长到一定阶段形成的一种结构，是营养细胞的休眠体。成熟的芽孢可抵抗溶菌酶的消化，具保护作用。对鳞翅目幼成熟的芽孢可抵抗溶菌酶的消化，具保护作用。对鳞翅目幼虫有毒性的芽孢包括活芽孢、死芽孢、芽孢衣和芽孢外套。虫有毒性的芽孢包括活芽孢、死芽孢、芽孢衣和芽孢外套。纯的芽孢对昆虫毒力很低，主要通过与杀虫晶体蛋白协同作纯的芽孢对昆虫毒力很低，主要通过与杀虫晶体蛋白协同作用起到杀虫的效果。用起到杀虫的效果。17在杀虫晶体蛋白对中肠上皮细胞造成膜穿孔

8、之后，在昆虫血在杀虫晶体蛋白对中肠上皮细胞造成膜穿孔之后，在昆虫血腔大量繁殖，营养细胞产生的大量的外毒素和酶，使得幼虫腔大量繁殖，营养细胞产生的大量的外毒素和酶，使得幼虫患败血症，同时肠液也进入血腔使血淋巴患败血症，同时肠液也进入血腔使血淋巴pHpH值上升值上升,幼虫全幼虫全身瘫痪身瘫痪,发黑发黑,最终死亡。最终死亡。芽孢的杀虫作用机理芽孢的杀虫作用机理184 Bt4 Bt的其他活性物质的其他活性物质营养期杀虫蛋白（营养期杀虫蛋白（Vegetative Vegetative insecticitalinsecticital protein,VIPprotein,VIP）几丁质酶（几丁质酶（ch

9、itinasechitinase ）苏云金素（苏云金素（thuringiensinthuringiensin）19Contents2.5.12.5.1常用的植物转化方法常用的植物转化方法(农杆菌介导法农杆菌介导法)2.5.2 2.5.2 植物基因工程的应用植物基因工程的应用2.5.32.5.3转基因植物的安全性问题转基因植物的安全性问题202.5.12.5.1常用的植物转化方法常用的植物转化方法lAgrobacterium-mediated transformation（农杆菌介导法农杆菌介导法）*l种质系统介导基因转化（花粉管通道法等）种质系统介导基因转化（花粉管通道法等）lplant vi

10、ruses（植物病毒载体介导法）植物病毒载体介导法）ldirect DNA transfer（DNA直接导入法直接导入法化学（化学（PEG介导法、脂质体法）；介导法、脂质体法）；物理（基因枪法、电激法、激光微束法、物理（基因枪法、电激法、激光微束法、显微注射法等）显微注射法等）目前较为成熟的植物病毒载体是花椰菜花叶病毒目前较为成熟的植物病毒载体是花椰菜花叶病毒(CaMV)和番茄金花叶病毒和番茄金花叶病毒(TGMV)。21农杆菌介导法目前研究最多、理论机理目前研究最多、理论机理最清楚、技术方法最成熟最清楚、技术方法最成熟的基因转化途径的基因转化途径是当前植物基因工程最常是当前植物基因工程最常用的

11、方法用的方法第一批第一批能表达外源基因的转基因植物就是用农杆菌介导法能表达外源基因的转基因植物就是用农杆菌介导法转化获得的。转化获得的。迄今所获得的转基因植株中迄今所获得的转基因植株中80以上是利用根癌农杆菌转以上是利用根癌农杆菌转化系统产生的。化系统产生的。*番茄茎杆上的根瘤番茄茎杆上的根瘤22根瘤菌科，农杆菌属根瘤菌科，农杆菌属（AgrobacteriumAgrobacterium）：）：革兰氏阴性菌，侵染植物伤口进革兰氏阴性菌，侵染植物伤口进入细胞后，将入细胞后，将T-DNAT-DNA插入植物基因插入植物基因组中，导致植物产生冠瘿瘤或毛状组中，导致植物产生冠瘿瘤或毛状不定根，干扰植物的正

12、常生长不定根，干扰植物的正常生长根癌农杆菌（根癌农杆菌（A.A.tumefacienstumefaciens）TiTi质粒质粒(tumor-inducing plasmid)(tumor-inducing plasmid)（广广泛使用）泛使用）发根农杆菌发根农杆菌(A.A.rhizogenesrhizogenes)RiRi质粒质粒(root-inducing plasmid)(root-inducing plasmid)23Ti plasmidTi（tumor-inducing plasmid）质粒：根）质粒：根癌农杆菌含有一种内源质粒，大小因种癌农杆菌含有一种内源质粒，大小因种类而异，在类而

13、异，在200250kb之间。当农杆菌之间。当农杆菌同植物接触时，同植物接触时，Ti质粒中有一段质粒中有一段DNA，大约在大约在15kb-30kb，称为，称为T-DNA（transfer-DNA），），能转移并整合到植能转移并整合到植物基因组中，并导致冠瘿瘤的形成。物基因组中，并导致冠瘿瘤的形成。章鱼碱型章鱼碱型 胭脂碱型胭脂碱型 农杆碱型农杆碱型 农杆菌素型农杆菌素型 琥珀碱型琥珀碱型根据其诱导的植根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类，成的冠瘿碱种类，Ti 质粒进行分类质粒进行分类*24TiTi质粒分为质粒分为4 4个功能区：个功能区：n Con区：与细菌间接合转移的有关基

14、因，调控区：与细菌间接合转移的有关基因，调控Ti 质粒在农质粒在农杆菌之间的转移杆菌之间的转移n Ori区：区：Ori区上的基因调控区上的基因调控Ti 质粒的自我复制。质粒的自我复制。uTDNA区区：从：从Ti质粒上被切割下来转移到植物细胞的一段质粒上被切割下来转移到植物细胞的一段DNA，约，约23kb，含有编码植物激素和冠瘿碱的基因，含有编码植物激素和冠瘿碱的基因。u Vir区：区：Vir区上的基因能激活区上的基因能激活T-DNA转移，使根癌农杆菌表转移，使根癌农杆菌表现出毒性现出毒性*25边界序列边界序列TDNA左右两端边界各有一个左右两端边界各有一个25bp长的正向重复序列长的正向重复序

15、列(左左边界边界(left border,LB)，右边界，右边界(right border,RB)，在不同，在不同Ti质粒中高度保守。它在质粒中高度保守。它在T-DNA的切除及整合过程具有重的切除及整合过程具有重要意义。要意义。右边界的存在右边界的存在对外源基因整合到植物基因组中相对外源基因整合到植物基因组中相当重要，但当重要，但左边界则非必须左边界则非必须。边界序列对边界序列对TDNA转移和整转移和整合不可缺少合不可缺少；已证实只要保留；已证实只要保留两端边界序列，虽然中间序列两端边界序列，虽然中间序列不同程度被外源片断所替换，不同程度被外源片断所替换，仍可转移整合到植物基因组中仍可转移整合

16、到植物基因组中 Ti质粒遗传转化的理论依据。质粒遗传转化的理论依据。*26外源基因在外源基因在TiTi质粒介导转化到植物的过质粒介导转化到植物的过程程(T-DNA(T-DNA的转移过程的转移过程)农杆菌吸附于植物的表面伤口部位农杆菌吸附于植物的表面伤口部位受酚类物质（乙酰丁香酮或羟基乙酰受酚类物质（乙酰丁香酮或羟基乙酰丁香酮）的诱导丁香酮）的诱导，virvir区基因被激活区基因被激活，virDvirD基因编码的核酸内切酶分别将基因编码的核酸内切酶分别将T-T-DNADNA的的RBRB序列和序列和LBLB序列切出单链切口，序列切出单链切口，释放释放出出T-DNAT-DNA的单链线性拷贝（的单链线

17、性拷贝（T-T-链）链）T-T-链在链在RBRB序列的引导下定向穿过农杆序列的引导下定向穿过农杆菌的细胞膜、细胞壁、进入植物细胞菌的细胞膜、细胞壁、进入植物细胞壁并整合到植物的染色体基因组中壁并整合到植物的染色体基因组中T-DNAT-DNA在植物细胞中表达在植物细胞中表达*27TiTi质粒介导转化植物细胞示意图质粒介导转化植物细胞示意图28根癌农杆菌介导根癌农杆菌介导转化转化植株的基本程序植株的基本程序可简单分为三大部分研究工作可简单分为三大部分研究工作转化转化是将目的基因导入受体植物细胞，并且能得以表达是将目的基因导入受体植物细胞，并且能得以表达和稳定的遗传。所以它也是基因工程研究应用于生产

18、的和稳定的遗传。所以它也是基因工程研究应用于生产的关键技术。关键技术。*1.1.受体系统的建立（组织培养体系）受体系统的建立（组织培养体系）2.2.TiTi质粒转化载体的构建质粒转化载体的构建3.3.目的基因的目的基因的转化转化29田间试验、遗传分析、性状鉴定田间试验、遗传分析、性状鉴定根癌农杆菌介导转化植株的基本程序（详细）根癌农杆菌介导转化植株的基本程序（详细）植物表达载体构建（植物表达载体构建（E.coliE.coli）选择受体材料选择受体材料重组质粒转化农杆菌（三亲、冻融等）重组质粒转化农杆菌（三亲、冻融等）建立植株再生体系建立植株再生体系遗传转化到遗传转化到宿主细胞宿主细胞（共培养）

19、（共培养）转化体筛选（抗生素）转化体筛选（抗生素）植株再生（组织培养）植株再生（组织培养）转基因植株的检测（转基因植株的检测（PCRPCR、分子杂交等）、分子杂交等）*30水稻幼胚水稻幼胚水稻成熟胚水稻成熟胚水稻胚性愈伤水稻胚性愈伤侧面观侧面观底面观底面观潮霉素筛选及潮霉素筛选及分化分化温室炼苗温室炼苗农杆菌与愈伤共培养农杆菌与愈伤共培养31植物表达植物表达载体构建载体构建重组质粒转化重组质粒转化农杆菌农杆菌建立植株再生建立植株再生体系体系遗传转化到宿遗传转化到宿主细胞主细胞321.创伤植株感染法（创伤植株感染法（植株接种共转化法）农杆菌介导外源基因转化植物的常用方法：2 共培养共培养感染法感

20、染法 叶盘转化法 愈伤组织共培养转化法 悬浮细胞共培养转化法 原生质体共培养转化法33Ti质粒介导转化植物的优缺点优点：优点：自然界天然存在的基因工程，转化效率高自然界天然存在的基因工程，转化效率高主要以单拷贝或低拷贝形式插入，利于后代主要以单拷贝或低拷贝形式插入，利于后代的纯化和稳定遗传的纯化和稳定遗传不需要特殊的专用设备不需要特殊的专用设备缺点：缺点：只能以只能以T-DNAT-DNA插入的方式导入寄主细胞插入的方式导入寄主细胞，没，没有方向性有方向性341.2 基因枪法（particle gun）也称微弹轰击法也称微弹轰击法：将外源：将外源DNADNA包被包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在

21、微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下微粒被高速射入在高压的作用下微粒被高速射入受体细胞或组织。微粒上的外源受体细胞或组织。微粒上的外源DNADNA进入细胞后，整合到植物染色进入细胞后，整合到植物染色体上，从而实现基因的转化。体上，从而实现基因的转化。可将基因枪分为三种类型：可将基因枪分为三种类型：第一类是以火药作为动力；第一类是以火药作为动力；第二类是以高压气体作为动力；第二类是以高压气体作为动力；第三类是以高压放电作为动力。第三类是以高压放电作为动力。35基因枪基因枪361)1)提高植物的农业价值（产量、品质、抗性）和园艺价提高植物的农业价值（产量、品质、抗性）和园艺价值（花色、花形、花

22、期），值（花色、花形、花期），egeg.抗虫棉、转基因矮牵牛抗虫棉、转基因矮牵牛等；等；2)2)作为生物反应器生产某些重要蛋白质和次生代谢物质，作为生物反应器生产某些重要蛋白质和次生代谢物质，egeg.生长激素、干扰素、白介素生长激素、干扰素、白介素-2-2、乙肝疫苗、表皮生乙肝疫苗、表皮生长因子等；长因子等；3)3)研究基因在发育及其他生理生化过程与代谢途径中的研究基因在发育及其他生理生化过程与代谢途径中的作用作用2 植物基因工程的应用373 转基因植物的安全性问题转基因植物的扩散、转基因植物的扩散、转入植物的外源基因的扩散、转入植物的外源基因的扩散、转入植物的其他标记基因的扩散、转入植物的

23、其他标记基因的扩散、转基因植物是否会影响生物多样性、转基因植物是否会影响生物多样性、转基因植物是否会改变与之相关物种（如害虫）转基因植物是否会改变与之相关物种（如害虫）的进化速度、的进化速度、转基因植物中标记基因的毒性问题等转基因植物中标记基因的毒性问题等环境安环境安全性全性食品安食品安全性全性其食用部分是否会引起食用者产生不良其食用部分是否会引起食用者产生不良反应反应(过敏过敏)，有无累积效应；有无累积效应；经合组织经合组织19931993年提出了食品安全性评价的年提出了食品安全性评价的实质等同性原则实质等同性原则。如。如果转基因植物生产的产品与传统产品具有实质等同性，则可以果转基因植物生产

24、的产品与传统产品具有实质等同性，则可以认为是安全的。认为是安全的。*38应对措施设置缓冲作物带；设置缓冲作物带；设置隔离区；设置隔离区；质粒构建时尽量避免使用抗性基因或发展质粒构建时尽量避免使用抗性基因或发展无选择标记的转化系统；无选择标记的转化系统；转基因作物与未转基因作物隔年轮作；转基因作物与未转基因作物隔年轮作；39小结：植物基因工程的主要内容目的基因的获得目的基因的获得构建合适的植物表达载体构建合适的植物表达载体通过合适方式的介导（农杆菌介导、基因枪、通过合适方式的介导（农杆菌介导、基因枪、PEG介导、病毒载体介导等），将其转化到植介导、病毒载体介导等），将其转化到植物受体细胞（创伤部

25、位、原生质体、叶片组织物受体细胞（创伤部位、原生质体、叶片组织等），并整合到染色体基因组上等），并整合到染色体基因组上使携带外源基因的植物细胞或组织再生成形态使携带外源基因的植物细胞或组织再生成形态正常的健康可育的植株正常的健康可育的植株外源基因能持续稳定地遗传给后代外源基因能持续稳定地遗传给后代*40小结小结TiTi质粒、根癌农杆菌、质粒、根癌农杆菌、T-DNAT-DNA、基因枪、边界序列、基因枪、边界序列根癌农杆菌的转化原理（利用根癌农杆菌的转化原理（利用TiTi质粒介导法，将外源序列导质粒介导法，将外源序列导入植物细胞的过程如何？根癌农杆菌介导转化植株的基本程入植物细胞的过程如何？根癌农杆菌介导转化植株的基本程序？）序？）如何利用如何利用TiTi质粒介导法，将外源基因导入培养的烟草叶盘中？质粒介导法，将外源基因导入培养的烟草叶盘中？基因工程在植物方面的应用前景如何？基因工程在植物方面的应用前景如何？植物基因工程中常用的外源基因转化方法有哪些？植物基因工程中常用的外源基因转化方法有哪些？