克隆基因的表达课件3.ppt

1、第四章第四章克隆基因的表达克隆基因的表达克隆基因的表达：克隆基因的表达：指的是外源基因在宿主细胞中表达。指的是外源基因在宿主细胞中表达。外源基因外源基因表达载体表达载体重组载体重组载体导入宿主细胞导入宿主细胞在宿主细胞中在宿主细胞中 表达出蛋白质表达出蛋白质提取蛋白提取蛋白宿主细胞：宿主细胞：原核细胞或真核细胞原核细胞或真核细胞。一、一、常见表达系统的类型常见表达系统的类型原核生物原核生物基因表达基因表达系统系统真核生物真核生物基因表达基因表达系统系统大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统芽孢杆菌表达系统芽孢杆菌表达系统链霉菌表达系统链霉菌表达系统酵母表达系统酵母表达系统丝状真菌表达系统丝状真菌表达

2、系统昆虫表达系统昆虫表达系统哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统植物生物反应器植物生物反应器二、表达体系的组成：二、表达体系的组成：表达载体表达载体受体细胞受体细胞表达载体的构成l 启动子l 终止子l 核糖体结合位点（SD序列）l 筛选标记l 复制子（质粒拷贝数）l 多克隆位点启动子启动子操纵子操纵子S-D序列序列目的基因目的基因终止子终止子1、启动子、启动子启动子启动子是一段提供是一段提供RNA聚合酶识别和结合聚合酶识别和结合的的DNA序列，位于基因的上游，长度因生物序列，位于基因的上游，长度因生物种类而异，具有如下特征：种类而异，具有如下特征：序列特异性：具有保守序列筐序列特异性：具有

3、保守序列筐位置特性：位于基因的上游或基因内的前端位置特性：位于基因的上游或基因内的前端方向性方向性种属特异性种属特异性如常见的如常见的启动子：启动子：启动子-10区序列-35区序列TTGACAGATACTTTGATATATAATTAGACATAATGTTTGACATTAACTTTTACATATAATTTGACATATAATP LPrecAPtraAPtrpPlacPtac-35区序列启动子从转录模式上分为：组成型启动子和诱导型启动子组成型启动子和诱导型启动子表达系统启动子必须具备的条件：表达系统启动子必须具备的条件：必须是一种必须是一种强启动子强启动子 能使外源基因的蛋白产量达到细胞能使外源基

4、因的蛋白产量达到细胞总蛋白的总蛋白的10%-30%以上。以上。应呈现应呈现低水平的基础转录低水平的基础转录便于表达毒性蛋白等。便于表达毒性蛋白等。应是应是可诱导型的可诱导型的用温度或化学试剂诱导。用温度或化学试剂诱导。表达系统常选用 启动子启动子注意注意了！了！诱导型诱导型避免前期避免前期表达目的产物对菌株生长的影响；表达目的产物对菌株生长的影响；减少细菌蛋白酶对目标基因产物的减少细菌蛋白酶对目标基因产物的降解降解。诱导型工作的典型例子：诱导型工作的典型例子：乳糖操纵子模式乳糖操纵子模式原因？原因？用乳糖或其类似物用乳糖或其类似物IPTG充当诱导物，与阻遏蛋白充当诱导物，与阻遏蛋白结合，解除抑

5、制。结合，解除抑制。乳糖操纵子：乳糖启动子乳糖操纵子：乳糖启动子lac，来自大肠杆菌来自大肠杆菌l乳糖启动子Plac的可控性：加入乳糖类似物：异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导作用l色氨酸启动子Ptrp的可控性2 2、终止子、终止子作用：防止作用：防止转录过头。转录过头。过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下：因的表达，其原因如下：转录产物越长，外源基因本身的转录效率下降；转录产物越长，外源基因本身的转录效率下降；增加工程菌无谓的能量消耗；增加工程菌无谓的能量消耗；影响重组质粒的不稳定性；影响重组质粒的不稳定性；过长的转录物往

6、往不能形成理想的二级结构，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低从而大大降低基因编码产物的翻译效率基因编码产物的翻译效率启动子启动子操纵子操纵子S-D序列序列目的基因目的基因终止子终止子3 3、核糖体结合位点、核糖体结合位点（RBS）（ribosomebindingsite）即位于翻译起始密码子上游的即位于翻译起始密码子上游的6-86-8个核苷酸序列个核苷酸序列5 5 UAAGGAGG 3 UAAGGAGG 3，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的基中的16S rRNA 316S rRNA 3端区域端区域3 3 AUUCCUCC 5 AUUCCUCC

7、5并与之并与之专一性结合，将专一性结合，将mRNAmRNA定位于核糖体上，从而启动定位于核糖体上，从而启动翻译。翻译。tac lac O S-D/ATG GST 插入位点插入位点 TGAlacPl也叫也叫SD序列序列：Shine-Dalgarno sequencel是是mRNAmRNA上与核糖体上与核糖体16sRNA16sRNA结合的序列结合的序列（1）SD序列与起始密码子之间的序列对表序列与起始密码子之间的序列对表达的影响：达的影响：、SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；、碱基若为CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。、紧邻AUG的前三个碱基成份对翻

8、译起始也有影响，对于大肠杆菌-半乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20。pSD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提条件。p在很多情况下，SD序列位于AUG之前大约7个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低。（2）SD序列与起始密码子之间的距离的影响：序列与起始密码子之间的距离的影响：三、大肠杆菌表达系统三、大肠杆菌表达系统全基因组测序，共有全基因组测序，共有44054405个

9、开放型阅读框架；个开放型阅读框架；基因克隆表达系统成熟、完善；基因克隆表达系统成熟、完善；繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定；繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定；被被FDAFDA批准为安全的基因工程受体生物。批准为安全的基因工程受体生物。1、大肠杆菌表达外源基因的、大肠杆菌表达外源基因的优势：优势：缺乏对真核生物蛋白质的复性功能；缺乏对真核生物蛋白质的复性功能；缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统；缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统；内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白；内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白；周质内含有种类繁多的内毒素周质内含有种类繁多的内毒素。2、大肠杆菌表达外

10、源基因的、大肠杆菌表达外源基因的劣势劣势：3、外源蛋白在大肠杆菌中的、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位表达部位1）.细胞质中表达细胞质中表达 表达蛋白常以表达蛋白常以包涵体包涵体（inclusion body）形式存在。形式存在。包涵体包涵体是存在于细胞质中的一种不溶是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。形成原理未知。形成原理未知。2）.在在周质周质（periplasm）中表达中表达 周质周质：格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。蛋白质从细胞质转运到周质的复蛋白质从细胞质转运到周质的复杂机理目前不完全清楚。杂机理目前不完全清

11、楚。优点：优点：容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。在这在这啊！啊！由于需要由于需要穿过两层膜穿过两层膜，大肠杆菌只，大肠杆菌只能能分泌极少分泌极少的蛋白质到培养基中，效果的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。都不太理想。通常用溶血素（通常用溶血素（hemolysinhemolysin）基因构建分）基因构建分泌性融合蛋白，或与细菌素释放蛋白泌性融合蛋白，或与细菌素释放蛋白（bacteriocin release protein)bacteriocin release protein)共表达。共表达。使在大肠杆菌细胞中表达使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白的外源蛋白分泌到细胞外的分泌到细胞

12、外的培养基中培养基中。3）.胞外表达胞外表达3、外源蛋白在大肠杆菌中的、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位表达部位4、外源基因在大肠杆菌中的表达形态、外源基因在大肠杆菌中的表达形态表达蛋白按溶解特性通常包括：表达蛋白按溶解特性通常包括：不溶性蛋白不溶性蛋白和和可溶性蛋白两类可溶性蛋白两类，具体包括如下几种结构形，具体包括如下几种结构形态：态：包涵体型蛋白包涵体型蛋白融合型蛋白融合型蛋白分泌型蛋白分泌型蛋白1）包涵体型蛋白：包涵体型蛋白：蛋白聚集成致密无膜的裸露结构，存于细胞质或细胞周质细胞周质中，无正确的空间构象，一般无生物活性。、包涵体表达形式的优点：外源基因表达产物易于分离纯化；能在一定程度上

13、保持表达产物的结构稳定；能表达对宿主有毒或有致死效应的目标蛋白。在这在这啊！啊！、包涵体型蛋白表达形式的缺点：、包涵体型蛋白表达形式的缺点：、包涵体用变性溶剂溶解、复性后，包涵体用变性溶剂溶解、复性后，不不一定能恢复生物学活性，回收的蛋白一定能恢复生物学活性，回收的蛋白生物活性差生物活性差；、复性成本较高。复性成本较高。2 2）、分泌型异源蛋白的表达）、分泌型异源蛋白的表达l 分泌异源蛋白分泌异源蛋白通过运输或分泌方式定位于通过运输或分泌方式定位于细胞周质细胞周质，甚至穿过外膜，甚至穿过外膜进入培养基进入培养基中。中。蛋白蛋白产物产物N N端端信号肽序列信号肽序列的存在是蛋白质分的存在是蛋白质

14、分泌的前提条件。泌的前提条件。phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、-内酰胺酶（内酰胺酶（lactamase）、）、肠毒素（肠毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等等 u常用的原核信号肽：常用的原核信号肽：如如大肠杆菌信号肽：大肠杆菌信号肽：u能带领蛋白穿过膜到达周质，但以后能带领蛋白穿过膜到达周质，但以后需要正确切割掉。需要正确切割掉。信号肽（信号肽（signal peptide）：）：一般位于一般位于N N端。端。目的蛋白稳定性高目的蛋白易于分离目的蛋白末端完整外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达；表达率通常要比包涵体方式低。、分泌表达形式的优点：、分泌

15、表达形式的优点：、分泌表达形式的缺点：、分泌表达形式的缺点：3 3）融合型蛋白融合型蛋白 将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起进行表达，并能正确折叠形成良好的杂合构象，但不同于天然构象。目的蛋白稳定性高；目的蛋白易于分离；目的蛋白表达率高；目的蛋白溶解性好；目的蛋白需要回收；特点：GST/His目的基因目的基因例子：例子：pTYB11，pTYB12:intein在在N端端利用利用Intein 分离纯化外源蛋白分离纯化外源蛋白Intein与与Chitin柱结合柱结合DTT或或-巯基乙醇或半胱氨酸能够巯基乙醇或半胱氨酸能够诱导诱导Intein的自我裂解活性的自我裂解活性 载体表达出的外源基

16、因蛋白质不与细载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。菌的任何蛋白质融合在一起。S-D序列序列 ATG-外源基因外源基因-TAG优点：优点：5、几种类型的原核表达载体、几种类型的原核表达载体1）.非融合型表达载体非融合型表达载体 产物结构接近于真核细胞体内的产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。蛋白质结构。缺点：缺点：容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。载体表达出的外源蛋白质与细菌的载体表达出的外源蛋白质与细菌的分分泌信号肽泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细连在一起，可被宿主菌分泌到细胞胞周质周质中。中。如：如：pIN III系列：系列：2）.分泌型表

17、达载体分泌型表达载体pIN III-comA1,pIN III-comA2,pIN III-comA3,分泌信号分泌信号肽肽外膜蛋外膜蛋白基因白基因Ipplac P lac O S-D/ATG ompa 插入位点插入位点 表达出的外源基因产物蛋白是表达出的外源基因产物蛋白是与质粒与质粒载体上的菌体蛋白载体上的菌体蛋白连接在一起的。连接在一起的。3）.融合蛋白表达载体：如融合蛋白表达载体：如pGEX系列系列 优点：优点：便于融合蛋白的分离和纯化。便于融合蛋白的分离和纯化。lacItac lac O S-D/ATG GST 插入位点插入位点 TGAlacPGST：谷胱甘肽巯基转移酶：谷胱甘肽巯基转

18、移酶柱（柱（column）GST 外源蛋白外源蛋白凝血酶凝血酶 外源蛋白外源蛋白柱（柱（column）GSTGST洗脱洗脱柱（柱（column）可再利用可再利用GST融合蛋白用融合蛋白用Glutathione Sepharose亲和层析柱亲和层析柱分离纯化。分离纯化。分离和纯化：分离和纯化：其它融合蛋白系统：其它融合蛋白系统：His-tag（组氨酸标签）：（组氨酸标签）：l在外源多肽的在外源多肽的N端或端或C端接上端接上6个组氨个组氨酸（酸（His）。）。lHis-tag能与能与Ni2+柱结合，但很容易被柱结合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脱下来，可以（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白

19、质。纯化蛋白质。5-TTGACA-3 5-TATAAT-3 -35box -10box（Pribnow Box）6、影响外源基因表达效率的因素、影响外源基因表达效率的因素1）.启动子的结构启动子的结构对表达效率的影响对表达效率的影响RNA聚合酶聚合酶 亚基的识别位点亚基的识别位点（1）一致顺序）一致顺序（2）-35区与区与-10区之间的区之间的距离距离间隔为间隔为17bp时，启动子最强。时，启动子最强。（3）-35区和区和-10区的区的碱基顺序碱基顺序越接近一致顺序，启动子越强。越接近一致顺序，启动子越强。5-TTGACA TATAAT 一致顺序一致顺序lactrp PL recAtac It

20、ac II5-TTTACA TATGTT 5-TTGACA TTAACT 5-TTGACA GATACT 5-TTGATA TATAAT 5-TTGACA TATAAT 5-TTGACA TTTAAT-35box-10boxS-D序列后面的序列后面的4个碱基：如果是个碱基：如果是A（T）,翻翻译效率最高；如果是译效率最高；如果是G（C）,效率只有效率只有50%或或25%。2）.转译起始序列转译起始序列对表达效率的影响对表达效率的影响（1）S-D序列序列5-AGGAGGU-3？AUG左侧左侧的三个碱基有影响。的三个碱基有影响。（2）起始密码起始密码AUG3）.启动子与外源基因之间的启动子与外源基

21、因之间的距离距离 转录终止区的存在保证载体不会转录非必转录终止区的存在保证载体不会转录非必须基因，不必浪费源量和能量、不会干扰正须基因，不必浪费源量和能量、不会干扰正常的表达。常的表达。增加载体的拷贝数会增加转录出的增加载体的拷贝数会增加转录出的mRNAmRNA数目，增加表达效率数目，增加表达效率。4）.转录终止区转录终止区对表达效率的影响对表达效率的影响5）.载体拷贝数及稳定性载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响对表达效率的影响6）.外源蛋白外源蛋白在菌体中的在菌体中的稳定性稳定性对表达效率的影响对表达效率的影响 但过度的外源基因的表达会影响宿主的正但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长。

22、常生长。l1）、表达载体的优化设计；）、表达载体的优化设计；l2）、提高目标基因）、提高目标基因mRNA和目标基因产和目标基因产物的稳定性；物的稳定性；l3）、密码子偏爱性；）、密码子偏爱性；l4）、表达环境条件的优化。）、表达环境条件的优化。7、提高外源基因表达常用的方法与途径、提高外源基因表达常用的方法与途径1）、）、表达质粒的优化设计表达质粒的优化设计启动子：选择启动子：选择诱导型诱导型强启动子强启动子 如进行基因的诱导表达，将宿主生长代谢与外源基因表达分开。SD序列：序列：UAAGGAGG高于高于3倍倍AAGGA；调整调整SD序列和起始密码序列和起始密码AUG间碱基长度：间碱基长度：一

23、般为一般为5-9bp为宜；为宜；SD序列和起始密码序列和起始密码AUG间碱基序列：间碱基序列：A/T丰富则翻译效率高。丰富则翻译效率高。2）、提高目标基因mRNA和目标基因产物的稳定性：目标基因mRNA的序列和结构改造：5加“发夹”结构；3加稳定序列；采用缺乏某种蛋白水解酶基因的缺陷株作为宿主菌；改造基因碱基序列包涵体形式、融合型表达目的基因包涵体形式、融合型表达目的基因。3）、密码子偏爱性：密码子偏爱性：u基因突变改变稀有密码子u共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因l4）、表达环境条件的优化。）、表达环境条件的优化。培养基培养基温度温度8 8、据蛋白用途选择基因的表达策略、据蛋白用途选择基因

24、的表达策略1）、表达蛋白用于生物化学和分子生物学研究表达蛋白用于生物化学和分子生物学研究 主要考虑保持蛋白质原有的功能不变主要考虑保持蛋白质原有的功能不变l表达策略：表达策略：融合表达融合表达 直接表达直接表达2 2）、表达蛋白用作抗原）、表达蛋白用作抗原 主要考虑表达蛋白的主要考虑表达蛋白的快速提纯快速提纯l表达策略：表达策略：以包涵体形式合成目的蛋白以包涵体形式合成目的蛋白 融合表达目标蛋白（不用去除标签蛋白）融合表达目标蛋白（不用去除标签蛋白）3 3）、表达蛋白用作结构研究）、表达蛋白用作结构研究 表达蛋白以天然可溶形式产生表达蛋白以天然可溶形式产生l 表达时考虑因素：表达时考虑因素：表

25、达温度（高温促进包涵体的形成）表达温度（高温促进包涵体的形成）表达水平（高表达促成包涵体的形成）表达水平（高表达促成包涵体的形成）表达载体受体菌表达载体受体菌9、原核表达系统的注意事项、原核表达系统的注意事项1）.外源基因外源基因不能带有内含子不能带有内含子。2）.必须用必须用cDNA3）.不能直接不能直接用真核基因组用真核基因组DNA。4）.须利用原核细胞的调控原件（启动子等）须利用原核细胞的调控原件（启动子等）5）.防止外源基因产物对宿主细胞的防止外源基因产物对宿主细胞的毒害毒害。四、酵母表达系统l大肠杆菌表达系统的缺陷 缺少翻译后的修饰和加工 表达蛋白多以包含体形式存在l酵母（酿酒酵母）

26、表达系统 繁殖快，能高密度发酵 可对表达蛋白进行翻译后的修饰和加工甲醇酵母表达系统甲醇酵母的生物学特点：能利用甲醇为唯一碳源，主要受乙醇氧化酶调控（AOX1，AOX2），其它碳源：葡萄糖和甘油；生长温度：2830，超过32不利于表达表达载体和受体菌受体菌：组氨酸缺陷型GS115，KM71，SMD1168等表达载体：整合型质粒，分胞内表达pPIC3.5K和分泌表达pPIC9K及多拷贝表达载体Pao815；载体特点：5，AOX1含启动子和重组位点，MCS，TT序列，3，AOX1重组位点，HIS筛选标记；抗性基因。l载体转化与基因的整合：p载体转化：物理法（电转法）、化学法（PEG和LiCl）、原生质球法。p基因的整合：插入、替换l甲醇酵母表达系统的优点：具有强的受严格调控的AOX1启动子表达蛋白的翻译后的加工和修饰营养要求低，工业化生产成本低可高密度发酵表达蛋白可存在于胞内和胞外l影响基因表达的因素基因本身（A、T的含量）整合位点和基因拷贝数产物稳定性翻译后的修饰宿主菌的甲醇利用表型over