光谱分析技术及相关仪器课件.ppt

1、 光谱分析技术及相关仪器光谱分析技术及相关仪器内内 容容 提提 要要光谱分析技术基础理论与光谱技术分类光谱分析技术基础理论与光谱技术分类 紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计 荧光光谱仪荧光光谱仪 原子光谱分析仪原子光谱分析仪 F光谱分析（光谱分析（Spectral AnalysisSpectral Analysis）：）：指所有对物质指所有对物质发射辐射能的能谱分析或对辐射能与物质相互发射辐射能的能谱分析或对辐射能与物质相互作用引起的能谱改变的分析。作用引起的能谱改变的分析。F光谱分析法：光谱分析法：基于物质发射的电磁辐射及电磁基于物质发射的电磁辐射及电磁辐射与物质的相互作用而建立起来的分

2、析方法。辐射与物质的相互作用而建立起来的分析方法。常用光谱分析仪器常用光谱分析仪器紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计原子吸收分光光度计原子吸收分光光度计红外光谱仪红外光谱仪原子发射光谱仪原子发射光谱仪荧光分析仪荧光分析仪原子荧光分析仪等原子荧光分析仪等第一节第一节 光谱分析技术基础理论与分类光谱分析技术基础理论与分类F吸收光谱（吸收光谱（absorption spectrumabsorption spectrum）即物质对不同波长）即物质对不同波长光的吸收程度不同而产生的光谱。光的吸收程度不同而产生的光谱。F发射光谱是由物质分子或原子吸收了外来的能量后发生发射光谱是由物质分子或原子吸收了外

3、来的能量后发生分子或原子间的能级跃迁而产生的光谱。分子或原子间的能级跃迁而产生的光谱。一、光谱分析技术的基础理论一、光谱分析技术的基础理论J光的光的波粒二象性：波粒二象性：微粒性微粒性 波动性波动性 E E 为光子的能量；为光子的能量；为光波的频率（为光波的频率（HzHz）；）；h h为普朗克常数（为普朗克常数（6.6266.626）；）；c c为光速（为光速（2.99772.997710108 8m ms s）；）；为光波的波长为光波的波长 hchEhchEEE02S2S1S0S3E2E0E1E302EEhh 一、光谱分析技术的基础理论一、光谱分析技术的基础理论J物质的吸收光谱:在连续光谱中

4、某些波长的光被物质吸收后产生的光谱被称作吸收光谱,包括分子吸收光谱和原子吸收光谱。吸收光谱取决于物质的结构。一、光谱分析技术的基础理论一、光谱分析技术的基础理论J朗伯朗伯-比尔定律：比尔定律：I I0 0：入射光强度入射光强度 C:C:溶液浓度溶液浓度 b:b:液层厚度液层厚度 I:I:透射光强度透射光强度 T:T:透光度透光度 A:A:吸光度吸光度 k:k:吸光系数吸光系数kbcIIT100kbcTIIIITA1lglglglg00bI0I一、光谱分析技术的基础理论一、光谱分析技术的基础理论朗伯朗伯-比尔定律的适用条件：比尔定律的适用条件：1.1.入射光为单色光。波长范围越大，单色光纯入射光

5、为单色光。波长范围越大，单色光纯度越低，偏离越大；度越低，偏离越大；2.2.溶液中邻近分子的存在并不改变每一给定溶液中邻近分子的存在并不改变每一给定分子的特性，即分子间互不干扰。分子的特性，即分子间互不干扰。3.3.适用于分子吸收和原子吸收。适用于分子吸收和原子吸收。一、光谱分析技术的基础理论一、光谱分析技术的基础理论J发射光谱发射光谱:物质所发射物质所发射的光被光谱仪器分解的光被光谱仪器分解而成的光谱。而成的光谱。J发射光谱分析方法就发射光谱分析方法就是根据每种元素特有是根据每种元素特有的线光谱来识别或检的线光谱来识别或检查各种元素。查各种元素。发射光谱发射光谱线状光谱线状光谱由原子或离子被

6、激 发而发射 带状光谱带状光谱由分子被激发而发射 连续光谱连续光谱由炙热的固体或液 体所发射 二、光谱分析技术的分类二、光谱分析技术的分类 分子吸收法分子吸收法:可见与紫外分光光度法、红外光谱法可见与紫外分光光度法、红外光谱法 分子光谱分子光谱 分子发射法分子发射法:分子荧光光度法分子荧光光度法光谱技术光谱技术 原子吸收法：原子吸收法：原子吸收法原子吸收法 原子光谱原子光谱 原子发射法：原子发射法：发射光谱分析法、原子荧光法等发射光谱分析法、原子荧光法等 第二节第二节、紫外、紫外-可见分光光度计可见分光光度计 分光光度计分光光度计:能从含有各种波长的混合光中能从含有各种波长的混合光中将每一单色

7、光分离出来并测量其强度的将每一单色光分离出来并测量其强度的仪器。仪器。m分析精密度高分析精密度高m测量范围广测量范围广m分析速度快分析速度快m样品用量少样品用量少 射射线线x射射线线紫紫外外光光红红外外光光微微波波无无线线电电波波10-2 nm 10 nm 102 nm 104 nm 0.1 cm 10cm 103 cm 105 cm可可 见见 光光 第二节第二节、紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计根据使用的波长范围不同分为紫外光区、可见光区、红外光区以及万用（全波段）分光光度计等。第二节第二节、紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计紫外紫外-可见分光光度计：可见分光光度计：工作波段在工作

8、波段在200nm200nm800nm800nm的分光光度计。其中：的分光光度计。其中：200nm200nm400nm400nm为紫外光区。为紫外光区。400nm400nm800nm800nm为可见光区。为可见光区。属于分子吸收光谱仪。属于分子吸收光谱仪。m721 721 可见分光光度计可见分光光度计 m722722系列系列 可见分光光度计可见分光光度计 mSP-756PSP-756P紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计 mTENSORTENSOR系列红外光谱仪系列红外光谱仪 0.208一、紫外一、紫外-可见分光光度计的基本结构和工作原理可见分光光度计的基本结构和工作原理紫外紫外-可见分光光度计

9、的基本结构示意图可见分光光度计的基本结构示意图 光源（光源（light sourcelight source）：提供入射光的装置。）：提供入射光的装置。要求要求:1.1.能在所需波长范围的光谱区域内发射连续光谱；能在所需波长范围的光谱区域内发射连续光谱；2.2.有足够的辐射强度并能长时间稳定。有足够的辐射强度并能长时间稳定。常用的光源有热辐射灯（钨灯、卤钨灯等），气常用的光源有热辐射灯（钨灯、卤钨灯等），气体放电灯（氢灯、氘灯及氙灯等），金属弧灯体放电灯（氢灯、氘灯及氙灯等），金属弧灯（各种汞灯）等。（各种汞灯）等。一、紫外一、紫外-可见分光光度计的基本结构和工作原理可见分光光度计的基本结构和

10、工作原理几种常见光源比较几种常见光源比较光源波长范围(nm)特 点钨灯3202500钨丝易蒸发，寿命短。用于可见光区卤钨灯3202500加入卤素使用寿命延长，稳定性好氢灯185375用于紫外区氘灯185375发光强度比氢灯高35倍汞灯254734用于紫外或荧光分析仪一、紫外一、紫外-可见分光光度计的基本结构和工作原理可见分光光度计的基本结构和工作原理单色器（单色器（MonochromatorMonochromator）：是将来自光源的复）：是将来自光源的复合光分解为单色光并分离出所需波段光束的装置。合光分解为单色光并分离出所需波段光束的装置。m入射狭缝：限制杂散光进入；入射狭缝：限制杂散光进入

11、；m色散元件：将复合光分解为色散元件：将复合光分解为 单色光，有棱镜和光栅两种；单色光，有棱镜和光栅两种；m准直镜：将来自色散元件的准直镜：将来自色散元件的 平行光束聚集在出射狭缝上；平行光束聚集在出射狭缝上；m出射狭缝：将固定波长范围出射狭缝：将固定波长范围 的光射出单色器，可以限制的光射出单色器，可以限制 通带宽度。通带宽度。一、紫外一、紫外-可见分光光度计的基本结构和工作原理可见分光光度计的基本结构和工作原理吸收池（吸收池（absorption cellabsorption cell）：）：是用来盛放被测溶是用来盛放被测溶液的器件。在可见光区常用无色光学玻璃或塑液的器件。在可见光区常用无

12、色光学玻璃或塑料制作；在紫外区需用能透紫外线的石英或熔料制作；在紫外区需用能透紫外线的石英或熔凝石英制作。凝石英制作。m同一套吸收池的厚度、透光面的透射、反射、同一套吸收池的厚度、透光面的透射、反射、折射应严格保持一致。指纹、油污及池壁上的折射应严格保持一致。指纹、油污及池壁上的沉淀物都会影响吸收池的透光性能。沉淀物都会影响吸收池的透光性能。一、紫外一、紫外-可见分光光度计的基本结构和工作原理可见分光光度计的基本结构和工作原理J通过改进吸收池的几何形状，可提高通过改进吸收池的几何形状，可提高“光程光程/体体积比积比”，即尽可能延长单位体积的光程。常用的，即尽可能延长单位体积的光程。常用的有：有

13、：微型吸收池（微型吸收池（Microdrill absorption cellMicrodrill absorption cell）：“光程光程/体积比体积比”提高了近提高了近1010倍。倍。多光路吸收池（多光路吸收池（Multipie-path absorption Multipie-path absorption cellcell）：在吸收池壁上装有反射镜，使光线在溶）：在吸收池壁上装有反射镜，使光线在溶液中经多次反射后才离开吸收池，大大增加了有液中经多次反射后才离开吸收池，大大增加了有效光程，提高了测定的灵敏度效光程，提高了测定的灵敏度。一、紫外一、紫外-可见分光光度计的基本结构和工作原

14、理可见分光光度计的基本结构和工作原理检测器：把光信号转换为电信号的装置。检测器：把光信号转换为电信号的装置。m对检测器的要求：对检测器的要求：1 1、产生的电信号与照射到它上面的光强有恒、产生的电信号与照射到它上面的光强有恒定的函数关系；定的函数关系；2 2、波长响应范围大；、波长响应范围大；3 3、灵敏度高；、灵敏度高；4 4、响应速度快，一般要求小于、响应速度快，一般要求小于10-810-8s s；5 5、产生的电信号易于检测、放大，噪声低。、产生的电信号易于检测、放大，噪声低。一、紫外一、紫外-可见分光光度计的基本结构和工作原理可见分光光度计的基本结构和工作原理检测器工作原理检测器工作原

15、理 m光照射在某些金属表面，会有光电子从金属表光照射在某些金属表面，会有光电子从金属表面逸出，这种光电效应称为外光电效应。利用面逸出，这种光电效应称为外光电效应。利用外光电效应可以制成光电管和光电倍增管。外光电效应可以制成光电管和光电倍增管。m光深入到物体内部，将物体内部原子中的一部光深入到物体内部，将物体内部原子中的一部分束缚电子激发成自由电子，但这些电子并不分束缚电子激发成自由电子，但这些电子并不逸出物体，而是留在物体内部从而使物体导电逸出物体，而是留在物体内部从而使物体导电性增强，称为内光电效应。利用内光电效应可性增强，称为内光电效应。利用内光电效应可制成光敏电阻、光敏二极管以及光电池。

16、制成光敏电阻、光敏二极管以及光电池。一、紫外一、紫外-可见分光光度计的基本结构和工作原理可见分光光度计的基本结构和工作原理几种常用检测器比较几种常用检测器比较检测器 工 作 原 理 特 点光电管外光电效应简单,灵敏度低光电倍增管外光电效应与多级二次发射体相结合灵敏度比光电管高200多倍光电二极管阵列外光电效应，由一行光敏区和二行读出寄存器构成可同时检测多个波长的光强度。寿命长、光谱响应范围宽、可靠性高、读出速度快光电池内光电效应结实、便宜、使用方便。但产生的电流大小不稳定电荷耦合器件模拟集成电路芯片能同时多谱线检测，极大地提高分析速度一、紫外一、紫外-可见分光光度计的基本结构和工作原理可见分光

17、光度计的基本结构和工作原理信号显示系统信号显示系统:是把放大的信号以适是把放大的信号以适当的方式显示或记录当的方式显示或记录下来的装置。下来的装置。信号显示装置信号显示装置直读直读检流计检流计电位调节电位调节指零装置指零装置自动记录自动记录和数字显和数字显示装置示装置一、紫外一、紫外-可见分光光度计的基本结构和工作原理可见分光光度计的基本结构和工作原理二、影响分光光度法准确性的因素二、影响分光光度法准确性的因素F 单色性不纯的影响单色性不纯的影响F 杂散光的影响杂散光的影响F 吸收池的影响吸收池的影响F 电压、检测器负高压波动的影响电压、检测器负高压波动的影响F 其它因素的影响其它因素的影响二

18、、影响分光光度法准确性的因素二、影响分光光度法准确性的因素（一）单色性不纯的影响（一）单色性不纯的影响m光的吸收定律只是在入射光为单色光的条件下光的吸收定律只是在入射光为单色光的条件下成立，而通常所指的单色光是指有一定谱带宽成立，而通常所指的单色光是指有一定谱带宽度的光谱。由于单色器的类型和质量不同，得度的光谱。由于单色器的类型和质量不同，得到的单色光纯度不同，加上使用中狭缝宽度调到的单色光纯度不同，加上使用中狭缝宽度调节不当，都可造成入射光的单色性不纯。从而节不当，都可造成入射光的单色性不纯。从而使仪器读数不准，造成测量误差。使仪器读数不准，造成测量误差。二、影响分光光度法准确性的因素二、影

19、响分光光度法准确性的因素（二）杂散光的影响：（二）杂散光的影响：m有两种两种原因引起的杂散光：有两种两种原因引起的杂散光：1.1.仪器中光学、机械零件的反射和散射等原因仪器中光学、机械零件的反射和散射等原因使所采用的测定波长的光偏离正常光路，在不通使所采用的测定波长的光偏离正常光路，在不通过样品的情况下直接照射到单色器。这种杂散光过样品的情况下直接照射到单色器。这种杂散光波长与测定波长相同；波长与测定波长相同；2.2.由仪器的光学系统设计制作缺陷引起。如不由仪器的光学系统设计制作缺陷引起。如不必要的反射面、光束孔径不匹配、光学元件表面必要的反射面、光束孔径不匹配、光学元件表面的擦痕、光学系统的

20、像差、不均匀色散以及由于的擦痕、光学系统的像差、不均匀色散以及由于机械零部件加工不良、位置错移、仪器内壁防眩机械零部件加工不良、位置错移、仪器内壁防眩黑漆脱落等。黑漆脱落等。二、影响分光光度法准确性的因素二、影响分光光度法准确性的因素（三）吸收池的影响（三）吸收池的影响m由于吸收池的质量不好或使用保管不善，吸收由于吸收池的质量不好或使用保管不善，吸收池不配套，透光面被污染上油污、指纹、沉淀，池不配套，透光面被污染上油污、指纹、沉淀，吸收池与光路不垂直等原因都可影响捡测结果吸收池与光路不垂直等原因都可影响捡测结果的准确性。的准确性。二、影响分光光度法准确性的因素二、影响分光光度法准确性的因素（四

21、）电压、检测器负高压波动的影响（四）电压、检测器负高压波动的影响m如果仪器电源电压波动过大，超过了仪器的稳如果仪器电源电压波动过大，超过了仪器的稳压范围或稳压器质量不好，都可引起光源电压、压范围或稳压器质量不好，都可引起光源电压、检测器负高压波动，造成光源光强波动和检测检测器负高压波动，造成光源光强波动和检测器噪声增大，使捡测结果准确度降低。器噪声增大，使捡测结果准确度降低。二、影响分光光度法准确性的因素二、影响分光光度法准确性的因素（五）其它因素的影响（五）其它因素的影响m吸光度读数刻度误差、仪器安装环境（如振吸光度读数刻度误差、仪器安装环境（如振动、温度变化）、化学因素（如荧光、溶剂动、温

22、度变化）、化学因素（如荧光、溶剂效应等）等也可影响捡测结果的准确度。效应等）等也可影响捡测结果的准确度。三、紫外三、紫外-可见分光光度计的类型可见分光光度计的类型J按其光学系统分可分为按其光学系统分可分为 单波长分光光度计单波长分光光度计 单光束单波长分光光度计单光束单波长分光光度计 双光束单波长分光光度计双光束单波长分光光度计 双波长分光光度计双波长分光光度计 三、紫外三、紫外-可见分光光度计的类型可见分光光度计的类型单波长单光束分光光度计特点单波长单光束分光光度计特点 单光束光路，从光源到试样至接收器只有一个光单光束光路，从光源到试样至接收器只有一个光通道；通道；仪器只有一个色散元件，工作

23、波长范围较窄；仪器只有一个色散元件，工作波长范围较窄；通常采用直接接收放大显示的简单电子系统，用通常采用直接接收放大显示的简单电子系统，用电表或数字显示；电表或数字显示；结构简单、附件少、功能范围小，不能做特殊试结构简单、附件少、功能范围小，不能做特殊试样如浑浊样品、不透明样品等的测定。样如浑浊样品、不透明样品等的测定。检测准确性不够稳定，不能用于精密分析。检测准确性不够稳定，不能用于精密分析。单波长单光束分光光度计单波长单光束分光光度计0.208三、紫外三、紫外-可见分光光度计的类型可见分光光度计的类型721型分光光度计光路图型分光光度计光路图三、紫外三、紫外-可见分光光度计的类型可见分光光

24、度计的类型751型分光光度计光路图型分光光度计光路图三、紫外三、紫外-可见分光光度计的类型可见分光光度计的类型三、紫外三、紫外-可见分光光度计的类型可见分光光度计的类型单波长双光束分光光度计单波长双光束分光光度计m在出射狭缝和样品吸收池之间增加了一个光在出射狭缝和样品吸收池之间增加了一个光束分裂器或斩波器，用一定的频率将一个光束分裂器或斩波器，用一定的频率将一个光束交替分成两路，使一路经过参比溶液，另束交替分成两路，使一路经过参比溶液，另一路经过样品溶液，然后由一个检测器交替一路经过样品溶液，然后由一个检测器交替接收或由两个匹配器分别接收两路信号。接收或由两个匹配器分别接收两路信号。三、紫外三

25、、紫外-可见分光光度计的类型可见分光光度计的类型单波长双光束分光光度计特点单波长双光束分光光度计特点1.1.从光源到检测器有试样光路和参考光路两条从光源到检测器有试样光路和参考光路两条通路；通路；2.2.采用两个光栅或棱镜加光栅的双单色器，能采用两个光栅或棱镜加光栅的双单色器，能有效地提高分辨率和降低杂散光；有效地提高分辨率和降低杂散光；3.3.可以自动进行波长扫描、自动记录光谱曲线，可以自动进行波长扫描、自动记录光谱曲线，也可以外接计算机，实现自动化运行；也可以外接计算机，实现自动化运行；4.4.可装备各种附件，功能范围宽。可装备各种附件，功能范围宽。比值比值单波长双光束分光光度计单波长双光

26、束分光光度计三、紫外三、紫外-可见分光光度计的类型可见分光光度计的类型双波长分光光度计工作原理双波长分光光度计工作原理m将从同一光源发出的光分为两束，分别经两个单色将从同一光源发出的光分为两束，分别经两个单色器分光后得到两束不同波长（器分光后得到两束不同波长（1 1，2 2）的单色光，）的单色光，经斩光器使两束光以一定频率交替照射同一样品，经斩光器使两束光以一定频率交替照射同一样品，测定两个波长下的吸光度差值（测定两个波长下的吸光度差值（A=AA=A11-A-A22），将），将AA用于计算结果。用于计算结果。三、紫外三、紫外-可见分光光度计的类型可见分光光度计的类型双波长分光光度计波长选择原则

27、双波长分光光度计波长选择原则1.1.被测物在一个波长上有最大吸收峰，被测物在一个波长上有最大吸收峰，在另一个波长上没有吸收或很少吸收；在另一个波长上没有吸收或很少吸收；2.2.非被测物在两个波长上的吸收相同。非被测物在两个波长上的吸收相同。三、紫外三、紫外-可见分光光度计的类型可见分光光度计的类型双波长分光光度计优点双波长分光光度计优点m只要只要1 1、2 2选择适当，选择适当，AA就是消除了非特征性吸收就是消除了非特征性吸收干扰的吸光度值。将干扰的吸光度值。将AA用于计算结果能较好的解决用于计算结果能较好的解决由于非特征吸收信号（如试样的浑浊、吸收池与空气由于非特征吸收信号（如试样的浑浊、吸

28、收池与空气界面以及吸收池与溶液界面的折射差别等）影响而带界面以及吸收池与溶液界面的折射差别等）影响而带来的误差，结果更准确。来的误差，结果更准确。双波长分光光度计双波长分光光度计三、紫外三、紫外-可见分光光度计的类型可见分光光度计的类型 四、紫外四、紫外-可见分光光度计性能评价指标可见分光光度计性能评价指标F(一一)波长准确度和波长重复性波长准确度和波长重复性 F(二二)光度准确度光度准确度 F(三三)光度线性范围光度线性范围 F(四四)分辨率分辨率 F(五五)光谱带宽光谱带宽F(六六)杂散光杂散光 F(七七)基线稳定度基线稳定度F(八八)基线平直度基线平直度 四、紫外四、紫外-可见分光光度计

29、性能评价指标可见分光光度计性能评价指标(一一)波长准确度和波长重复性波长准确度和波长重复性m波长准确度是指仪器波长指示器上所示波长值与波长准确度是指仪器波长指示器上所示波长值与仪器此时实际输出的波长值之间的符合程度。仪器此时实际输出的波长值之间的符合程度。m波长重复性是指在对同一个吸收带或发射线进行波长重复性是指在对同一个吸收带或发射线进行多次测量时，峰值波长测量结果的一致程度。多次测量时，峰值波长测量结果的一致程度。m波长误差来源于色散元件传动机构的运动误差、波长误差来源于色散元件传动机构的运动误差、波长度盘的刻划误差、狭缝中心位置偏移和装校波长度盘的刻划误差、狭缝中心位置偏移和装校误差等。

30、而波长重复性则取决于上述各种机构中误差等。而波长重复性则取决于上述各种机构中间隙的稳定性。间隙的稳定性。(二二)光度准确度光度准确度m光度准确度是指仪器在吸收峰上读出的透射率或吸光光度准确度是指仪器在吸收峰上读出的透射率或吸光度与已知真实透射率或吸光度之间的偏差。该偏差越度与已知真实透射率或吸光度之间的偏差。该偏差越小，光度准确度越高。小，光度准确度越高。m光度准确度测试方法主要有标准溶液法和滤光片法。光度准确度测试方法主要有标准溶液法和滤光片法。标准溶液多采用酸性重铬酸钾溶液。标准溶液多采用酸性重铬酸钾溶液。四、紫外四、紫外-可见分光光度计性能评价指标可见分光光度计性能评价指标(三三)光度线

31、性范围光度线性范围m指仪器光度测量系统对于照射到接收器上的辐指仪器光度测量系统对于照射到接收器上的辐射功率与系统的测定值之间符合线性关系的功射功率与系统的测定值之间符合线性关系的功率范围，即仪器的最佳工作范围。率范围，即仪器的最佳工作范围。m检测方法检测方法溶液稀释法：配制适当浓度的溶溶液稀释法：配制适当浓度的溶液，按照一定的倍数逐步稀释，分别测定其吸液，按照一定的倍数逐步稀释，分别测定其吸光度，根据测得的吸光度计算吸光系数，以吸光度，根据测得的吸光度计算吸光系数，以吸光度为横坐标，相应的吸光系数为纵坐标，绘光度为横坐标，相应的吸光系数为纵坐标，绘制吸光系数制吸光系数-吸光度曲线，曲线的平坦区

32、域即吸光度曲线，曲线的平坦区域即为仪器的线性范围。为仪器的线性范围。四、紫外四、紫外-可见分光光度计性能评价指标可见分光光度计性能评价指标(四四)分辨率分辨率m指仪器对于紧密相邻的峰可分辨的最小波长指仪器对于紧密相邻的峰可分辨的最小波长间隔，此间隔越小分辨率越高。它是分光光间隔，此间隔越小分辨率越高。它是分光光度计质量的综合反映。度计质量的综合反映。m单色器输出的单色光的光谱纯度、强度以及单色器输出的单色光的光谱纯度、强度以及检测器的光谱灵敏度等是影响仪器分辨率的检测器的光谱灵敏度等是影响仪器分辨率的主要因素。主要因素。四、紫外四、紫外-可见分光光度计性能评价指标可见分光光度计性能评价指标(五

33、五)光谱带宽光谱带宽m光谱带宽（光谱带宽（Spectral band widthSpectral band width）是指从单）是指从单色器射出的单色光最大强度的色器射出的单色光最大强度的1/21/2处的谱带宽处的谱带宽度。它与狭缝宽度、分光元件、准直镜的焦距度。它与狭缝宽度、分光元件、准直镜的焦距有关，可以认为是单色器的线色散率的倒数与有关，可以认为是单色器的线色散率的倒数与狭缝宽度的乘积。狭缝宽度的乘积。m测量方法：测量钠双线（测量方法：测量钠双线（589.0nm589.0nm、589.6nm589.6nm）的宽度。由于元素灯谱线本身的宽度大大小于的宽度。由于元素灯谱线本身的宽度大大小于

34、单色器的宽度，故测得的光谱带宽可以认为就单色器的宽度，故测得的光谱带宽可以认为就是单色器的光谱带宽。是单色器的光谱带宽。四、紫外四、紫外-可见分光光度计性能评价指标可见分光光度计性能评价指标(六六)杂散光杂散光m除所需波长单色光以外其余所有的光都是杂散除所需波长单色光以外其余所有的光都是杂散光，是测量过程中的主要误差来源，会严重影光，是测量过程中的主要误差来源，会严重影响检测准确度。响检测准确度。m可用截止滤光器测定杂散光：截止滤光器对边可用截止滤光器测定杂散光：截止滤光器对边缘波长或某一波长的光可全部吸收，而对其它缘波长或某一波长的光可全部吸收，而对其它波长的光却有很高的透光率，因此测定某种

35、截波长的光却有很高的透光率，因此测定某种截止滤光器在边缘波长或某一波长的透光率，即止滤光器在边缘波长或某一波长的透光率，即表示杂散光的强度。表示杂散光的强度。四、紫外四、紫外-可见分光光度计性能评价指标可见分光光度计性能评价指标(七七)基线稳定度基线稳定度m是指在不放置样品的情况下，扫描是指在不放置样品的情况下，扫描100%T100%T或或0%T0%T时读数偏离的程度，是仪器噪声水平的时读数偏离的程度，是仪器噪声水平的综合反映。一般取最大的峰缝之间的值作综合反映。一般取最大的峰缝之间的值作为绝对噪声水平。如果基线稳定度差，光为绝对噪声水平。如果基线稳定度差，光度准确度就低。度准确度就低。四、紫

36、外四、紫外-可见分光光度计性能评价指标可见分光光度计性能评价指标(八八)基线平直度基线平直度m是指在不放置样品的情况下，扫描是指在不放置样品的情况下，扫描100%T100%T或或0%T0%T时基线倾斜或弯曲的程度。时基线倾斜或弯曲的程度。m在高吸收时，在高吸收时，0%0%线的平直度对读数的影响线的平直度对读数的影响大；在低吸收时，大；在低吸收时，100%100%线的平直度对读数线的平直度对读数的影响大。的影响大。m基线平直度不好，可使样品吸收光谱中各基线平直度不好，可使样品吸收光谱中各吸收峰间的比值发生变化，给定性分析造吸收峰间的比值发生变化，给定性分析造成困难。成困难。四、紫外四、紫外-可见

37、分光光度计性能评价指标可见分光光度计性能评价指标五、紫外五、紫外-可见分光光度计常见故障及排除方法可见分光光度计常见故障及排除方法 L分光光度计常见故障包括光路、电路故障。根据故障不分光光度计常见故障包括光路、电路故障。根据故障不同应采取不同的排除措施。接通电源后，指示灯不亮，同应采取不同的排除措施。接通电源后，指示灯不亮，仪器不工作，可能是电路故障；读数表不能调零（即仪器不工作，可能是电路故障；读数表不能调零（即0 0T T）和不能置）和不能置100100T T则可能是光路故障或微电流放大则可能是光路故障或微电流放大器损坏。需根据具体情况采取不同的处理方法。器损坏。需根据具体情况采取不同的处

38、理方法。第三节第三节 荧光光谱仪荧光光谱仪某些物质吸收光能量后，可发射波长与激发光某些物质吸收光能量后，可发射波长与激发光波长相同或不同的光，当激发光源停止照射试波长相同或不同的光，当激发光源停止照射试样，再发射过程立即停止，这种再发射的光称样，再发射过程立即停止，这种再发射的光称为荧光（为荧光（fluorescencefluorescence）。包括分子荧光和原）。包括分子荧光和原子荧光。子荧光。m荧光分析法：通过测定物质分子产生的荧光强荧光分析法：通过测定物质分子产生的荧光强度进行物质的定性与定量分析的方法。度进行物质的定性与定量分析的方法。m荧光光谱仪：采用荧光分析法来测量的仪器。荧光光

39、谱仪：采用荧光分析法来测量的仪器。第三节第三节 荧光光谱仪荧光光谱仪荧光产生机理荧光产生机理m物质的分子吸收了照射光的能量后，处于基物质的分子吸收了照射光的能量后，处于基态最低能级的分子被激发到第一电子激发态态最低能级的分子被激发到第一电子激发态和其它电子激发态的各个振动能级。到达激和其它电子激发态的各个振动能级。到达激发态的各个振动能级的分子，和周围的分子发态的各个振动能级的分子，和周围的分子（如溶剂分子）碰撞，并把部分能量以热能（如溶剂分子）碰撞，并把部分能量以热能的形式传给周围的分子，自己降落到单线第的形式传给周围的分子，自己降落到单线第二电子激发态的最低振动能级。然后，二电子激发态的最

40、低振动能级。然后，由此由此最低振动能级向基态的各个振动能级跃迁，最低振动能级向基态的各个振动能级跃迁，同时以发光的形式释放出其能量同时以发光的形式释放出其能量。这种光即。这种光即为荧光。为荧光。荧光分析的特点荧光分析的特点J优点：优点：灵敏度高（可达灵敏度高（可达10-12g10-12g数量级）；选数量级）；选择性强，有利于分析复杂的多组分混合物；择性强，有利于分析复杂的多组分混合物；用样量少、特异性好、操作简便。用样量少、特异性好、操作简便。L缺点：缺点：对温度、对温度、pHpH值等因素变化比较敏感；值等因素变化比较敏感；应用范围较窄，只能用来测量发荧光的物质，应用范围较窄，只能用来测量发荧

41、光的物质，或与某些试剂作用后发荧光的物质。或与某些试剂作用后发荧光的物质。第三节第三节 荧光光谱仪荧光光谱仪（一）激发光谱和荧光光谱（一）激发光谱和荧光光谱m任何发射荧光的物质都具有两个特征光谱，即激任何发射荧光的物质都具有两个特征光谱，即激发光谱（发光谱（excitation spectrumexcitation spectrum）和荧光光谱）和荧光光谱(fluorescence spectrum)(fluorescence spectrum)。它们是荧光分析中定。它们是荧光分析中定性和定量的基础。性和定量的基础。一、荧光分析的基本原理一、荧光分析的基本原理 激发光谱：激发光谱：将激发光的光

42、源用单色器分光，连续改将激发光的光源用单色器分光，连续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定不同波长变激发光波长，固定荧光发射波长，测定不同波长的激发光照射下，物质溶液发射的荧光强度的变化。的激发光照射下，物质溶液发射的荧光强度的变化。以激发光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，以激发光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，即可得到荧光物质即可得到荧光物质 的激发光谱。从激的激发光谱。从激 发光谱图上可找到发光谱图上可找到 发生荧光强度最强发生荧光强度最强 的激发波长的激发波长exex。一、荧光分析的基本原理一、荧光分析的基本原理荧光光谱：用荧光光谱：用exex作激发光源，并固定强度，让物质作激

43、发光源，并固定强度，让物质发射的荧光通过单色器分光，测定不同波长的荧光强发射的荧光通过单色器分光，测定不同波长的荧光强度。以荧光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，度。以荧光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，便得荧光光谱。荧光光谱中荧光强度最强的波长为便得荧光光谱。荧光光谱中荧光强度最强的波长为 em em。m荧光物质的荧光物质的exex和和emem 是鉴定物质的根据，也是鉴定物质的根据，也 是定量测定中所选用的是定量测定中所选用的 最灵敏的波长。最灵敏的波长。一、荧光分析的基本原理一、荧光分析的基本原理（二）物质的分子结构和荧光的关系（二）物质的分子结构和荧光的关系m强荧光物质在分子结构上

44、具有如下特征：强荧光物质在分子结构上具有如下特征：具有大的共轭具有大的共轭-双键结构，共轭体系越大，双键结构，共轭体系越大，越容易产生荧光。越容易产生荧光。具有刚性平面结构。荧光量子产率高的荧光物具有刚性平面结构。荧光量子产率高的荧光物质，其分子多为平面构型，并具有一定的刚性。质，其分子多为平面构型，并具有一定的刚性。具有最低的单线电子激发态具有最低的单线电子激发态S S1 1为为-型。型。若取代基团为给电子取代基，荧光强度增加。若取代基团为给电子取代基，荧光强度增加。一、荧光分析的基本原理一、荧光分析的基本原理二、荧光光谱仪二、荧光光谱仪 荧光光谱仪的工作原理荧光光谱仪的工作原理m荧光物质所

45、发出的荧光强度在激发光的频率、荧光物质所发出的荧光强度在激发光的频率、强度以及液层厚度不变时与溶液的浓度成正强度以及液层厚度不变时与溶液的浓度成正比。由此可以通过测定荧光强度来求出该物比。由此可以通过测定荧光强度来求出该物质的含量。质的含量。m荧光分析法所测量的是待测物质所发射的荧荧光分析法所测量的是待测物质所发射的荧光强弱，而不是物质对光谱的吸收强弱，属光强弱，而不是物质对光谱的吸收强弱，属于发射光谱分析，荧光光度计和荧光分光光于发射光谱分析，荧光光度计和荧光分光光度计属于发射光谱仪器。度计属于发射光谱仪器。荧光光谱仪分类荧光光谱仪分类m荧光光度计（荧光光度计（fluorophotomete

46、rfluorophotometer）m荧光分光光度计（荧光分光光度计（fluorospectrophotometerfluorospectrophotometer）二者的区别在于荧光光度计采用二者的区别在于荧光光度计采用滤光片滤光片做做单色器，单色器，结构较简单，功能也较差，而结构较简单，功能也较差，而荧光分光光度计荧光分光光度计采采用棱镜或光栅为色散元件，结构较复杂，功能较用棱镜或光栅为色散元件，结构较复杂，功能较强，但价格远远高于荧光光度计。强，但价格远远高于荧光光度计。二、荧光光谱仪二、荧光光谱仪mFluoscenceFluoscence荧光分光光度计荧光分光光度计FP-6500荧光分光

47、光度计mJascoJasco荧光光谱仪荧光光谱仪mARL 9800 ARL 9800 系列系列 X X射线荧光光谱仪射线荧光光谱仪 荧光光谱仪的主要结构荧光光谱仪的主要结构m激光光源：激发样品中荧光分子产生荧光。激光光源：激发样品中荧光分子产生荧光。常用汞弧灯、氢弧灯及氘灯等。常用汞弧灯、氢弧灯及氘灯等。m单色器：分离出所需要的单色光。仪器有两单色器：分离出所需要的单色光。仪器有两个单色器，一是激发单色器，用于选择激发个单色器，一是激发单色器，用于选择激发光波长；二是发射单色器，用于选择发射到光波长；二是发射单色器，用于选择发射到检测器上的荧光波长。检测器上的荧光波长。m样品池：放置测试样品，

48、用石英做成。样品池：放置测试样品，用石英做成。m检测器：接受光信号并将其转变为电信号。检测器：接受光信号并将其转变为电信号。m记录显示系统：检测器出来的电信号经过放记录显示系统：检测器出来的电信号经过放大器放大后，由记录仪记录下来，并可数字大器放大后，由记录仪记录下来，并可数字显示和打印。显示和打印。二、荧光光谱仪二、荧光光谱仪0.208激发激发荧光光度计结构示意图荧光光度计结构示意图发射发射荧光光谱仪典型配置荧光分光光度计光路图荧光分光光度计光路图荧光分光光度计光路图荧光分光光度计光路图荧光光谱仪的使用与维护荧光光谱仪的使用与维护m严格按照仪器规定的操作步骤进行操作。一旦仪器出了故严格按照仪

49、器规定的操作步骤进行操作。一旦仪器出了故障，特别是光学部件的故障，必须请专门人员进行检修。障，特别是光学部件的故障，必须请专门人员进行检修。m在使用过程中应注意以下问题：在使用过程中应注意以下问题：1.1.电源：电压，电流，电源的稳定须符合仪器的规定。电源：电压，电流，电源的稳定须符合仪器的规定。2.2.光源：启动后需预热光源：启动后需预热20min20min，灯及其窗口须保持清洁。，灯及其窗口须保持清洁。3.3.单色器：应注意防潮、防尘、防污和防机械损伤。单色器：应注意防潮、防尘、防污和防机械损伤。4.4.光电倍增管：加高压时切不可受外来光线直接照射。光电倍增管：加高压时切不可受外来光线直接

50、照射。5.5.样品池：使用时应同一个方向插放，不能经常磨擦。样品池：使用时应同一个方向插放，不能经常磨擦。6.6.防止眼睛损伤：操作者不能直视光源，以免紫外线损防止眼睛损伤：操作者不能直视光源，以免紫外线损伤眼睛。伤眼睛。二、荧光光谱仪二、荧光光谱仪三、荧光光谱仪的应用三、荧光光谱仪的应用J常规分析（如定性和定量分析、化学表征、色谱常规分析（如定性和定量分析、化学表征、色谱流出物的检测等）；流出物的检测等）；J获得分子信息（如测量分子内间距、决定键合平获得分子信息（如测量分子内间距、决定键合平衡、研究结构变化等）；衡、研究结构变化等）；J医药研究（如研究膜结构和功能、确定抗体的形医药研究（如研