分子生物学研究法(下)基因功能研究技术课件.ppt

1、16 分子生物学研究法（下）分子生物学研究法（下）基因功能研究技术基因功能研究技术6.1 基因表达研究技术基因表达研究技术6.2 基因敲除技术基因敲除技术6.3 蛋白质和蛋白质和RNA相互作用技术相互作用技术6.4 基因芯片及数据分析基因芯片及数据分析6.5 利用酵母鉴定靶基因功能利用酵母鉴定靶基因功能6.6 其它分子生物学技术其它分子生物学技术26.1 基因表达研究技术基因表达研究技术6.1.3 原位杂交技术原位杂交技术（in situ hybridization,ISH）o 原位杂交技术原位杂交技术（in situ hybridization,ISH）：用标记的核酸探针，用标记的核酸探针，

2、经放射自显影或非经放射自显影或非放射检测体系，在放射检测体系，在组织、细胞、间期组织、细胞、间期核及染色体上对核核及染色体上对核酸进行定位和相对酸进行定位和相对定量研究。定量研究。菌落原位杂交菌落原位杂交3荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization，FISH)o 是在已有的放射性原位杂交技术的基础上发展是在已有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性起来的一种非放射性DNA分子原位杂交技术分子原位杂交技术 o 它利用荧光标记的它利用荧光标记的核酸片段核酸片段为探针，与染色体为探针，与染色体或或DNA上特异序列杂交，通过与荧光

3、分子相偶上特异序列杂交，通过与荧光分子相偶联的单克隆抗体来确定该联的单克隆抗体来确定该DNA序列的位置。序列的位置。o FISH技术检测时间短，检测灵敏度高，无污技术检测时间短，检测灵敏度高，无污染，已广泛应用于染色体的鉴定、基因定位和染，已广泛应用于染色体的鉴定、基因定位和异常染色体检测等领域。异常染色体检测等领域。4荧光原位杂交技术原理示意图荧光原位杂交技术原理示意图5端粒端粒DNA的荧光原位杂交的荧光原位杂交66.1.4 基因定点突变技术基因定点突变技术o 研究某些氨基酸残基对蛋白质结构、催化活性研究某些氨基酸残基对蛋白质结构、催化活性及结合配体能力的影响。主要蛋白质结构与功及结合配体能

4、力的影响。主要蛋白质结构与功能的关系。能的关系。o 重叠延伸技术重叠延伸技术和和大引物诱变法大引物诱变法。7重叠延伸介导的定点诱变重叠延伸介导的定点诱变8大引物诱变法大引物诱变法96.3 蛋白质及蛋白质及RNA相互作用技术相互作用技术6.3.1酵母单杂交系统酵母单杂交系统p 酵母单杂交系统：是用于研究酵母单杂交系统：是用于研究DNA-蛋白质蛋白质之之间相互作用的新技术，可识别稳定结合于间相互作用的新技术，可识别稳定结合于DNA上的蛋白质，并通过筛选上的蛋白质，并通过筛选DNA文库直接获得靶文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。序列相互作用蛋白的编码基因。10酵母单杂交系统原理酵母单杂交系统

5、原理o 将已知顺式作用元件构建将已知顺式作用元件构建到最基本启动子（到最基本启动子（Pmin）的）的上游，把报告基因连接到上游，把报告基因连接到Pmin下游。下游。将编码待测转将编码待测转录因子录因子cDNA与已知酵母转与已知酵母转录激活结构域（录激活结构域（AD）融合表）融合表达载体导入酵母细胞。达载体导入酵母细胞。该该基因产物如果能够与顺式作基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活用元件相结合，就能激活 Pmin启动子，使报告基因得启动子，使报告基因得到表达。到表达。酵母单杂交的基本原理酵母单杂交的基本原理11从拟南芥从拟南芥cDNA文库中文库中 筛选与顺式元筛选与顺式元 件件DRE

6、结结合的合的 转录因子示意图。转录因子示意图。126.3.2酵母双杂交系统酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）o 酵母双杂交系统：用于酵母双杂交系统：用于检测细胞内蛋白质相互作用检测细胞内蛋白质相互作用的遗传系统。现不仅局限于检测已知蛋白间的相互的遗传系统。现不仅局限于检测已知蛋白间的相互作用，也可用于蛋白质的功能域研究及未知蛋白编作用，也可用于蛋白质的功能域研究及未知蛋白编码基码基因的分离克隆等。因的分离克隆等。o 完整的真核生物转录调控因子完整的真核生物转录调控因子具有具有2个可分隔开的个可分隔开的结构域：结构域：DNA特异结合域（特异结合域（DNA-bindi

7、ng domain,BD）;转录激活域（转录激活域（transcriptional activation domain,AD）o 一个完整的、具有激活特定基因表达的激活因子必一个完整的、具有激活特定基因表达的激活因子必须同时含有须同时含有BD、AD，否则无法完成激活功能。，否则无法完成激活功能。13BD-XAD-Y共同表达于共同表达于酵母细胞内酵母细胞内AD、BD会形成完整的转录会形成完整的转录激活因子，并激活相应的报告基因表达。激活因子，并激活相应的报告基因表达。如果如果2蛋白能发生相互作用蛋白能发生相互作用14 酵母双杂交的基本原理示意图酵母双杂交的基本原理示意图156.3.4 细胞内蛋白

8、质相互作用研究细胞内蛋白质相互作用研究荧光荧光共振能量转移法（共振能量转移法（FRET）o FRET荧光能量转移有三个基本条件：荧光能量转移有三个基本条件：给体与受体在合给体与受体在合适的距离（适的距离（110nm）；）；给体的发射光谱与受体的吸给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠；收光谱有一定的重叠；给体与受体的偶极具有一定的给体与受体的偶极具有一定的空间取向。空间取向。166.3.5 RNAi技术及其应用技术及其应用o RNAi（RNA interference）技术：利用双链）技术：利用双链小小RNA高效、特异性降解细胞内同源高效、特异性降解细胞内同源mRNA从从而阻断靶基因表达，

9、使细胞出现靶基因缺失的而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。表型。17siRNA：小干扰：小干扰RNA small interfering RNA(siRNA)：是一种小：是一种小RNA分子（分子（21-25核苷酸），与核苷酸），与mRNA 的互的互补区发生碱基配对作用，阻遏其表达。具有这补区发生碱基配对作用，阻遏其表达。具有这种作用的短小单链种作用的短小单链RNA称。这种作用称称。这种作用称RNA干扰（干扰（RNA interference，RNAi）。）。18 siRNA和相应的和相应的蛋白结合并形成蛋白结合并形成活化的活化的RNA诱导诱导沉默复合物沉默复合物（RNA induce

10、d silencing complex，RISC），），RISC进进而识别和而识别和siRNA具有完全互补序具有完全互补序列的列的mRNA，特，特异的降解异的降解mRNA。19206.6 其它分子生物学技术其它分子生物学技术6.6.2噬菌体表面显示技术噬菌体表面显示技术o 噬菌体溶原周期、溶菌周期噬菌体溶原周期、溶菌周期o 表面显示表面显示（surface display）：是一种基因表）：是一种基因表达筛选技术。是将达筛选技术。是将“诱饵诱饵”蛋白基因克隆在特蛋白基因克隆在特定的表达载体中，使其以融合蛋白的形式显示定的表达载体中，使其以融合蛋白的形式显示在噬菌体表面，直接用于捕获靶蛋白库中可与在噬菌体表面，直接用于捕获靶蛋白库中可与“诱饵诱饵”蛋白相互作用的蛋白质。蛋白相互作用的蛋白质。21o 重组噬菌体侵染宿主细重组噬菌体侵染宿主细菌后，复制形成大量带菌后，复制形成大量带有杂合外壳蛋白的噬菌有杂合外壳蛋白的噬菌体颗粒，直接用于捕获体颗粒，直接用于捕获靶蛋白库中与靶蛋白库中与“诱饵诱饵”相互作用的蛋白质。相互作用的蛋白质。22THE END!