分子生物学(中文)5-分子生物学基本研究法课件.ppt

1、第第 五五 章章 分子生物学基本研究法分子生物学基本研究法（上）（上）DNADNA、RNARNA及蛋白质操作技术及蛋白质操作技术扉页：扉页：当你进入实验室时，要像脱去外衣那样当你进入实验室时，要像脱去外衣那样放下你的想象力，因为实验操作中不能有一放下你的想象力，因为实验操作中不能有一丁点儿的想象，否则，你对事物的观察就会丁点儿的想象，否则，你对事物的观察就会受影响；当你翻开书本的时候，你又必须尽受影响；当你翻开书本的时候，你又必须尽可能展开想象的可能展开想象的“翅膀翅膀”，否则，你就不可，否则，你就不可能走在别人的前面。能走在别人的前面。基因操作主要包括基因操作主要包括DNADNA分子的分子的

2、切割与连接、细胞切割与连接、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、表达、定转化、核酸序列分析以及基因人工合成、表达、定点突变和点突变和PCRPCR扩增扩增等，是分子生物学研究的核心技术。等，是分子生物学研究的核心技术。基因工程是指基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达定的繁殖和表达。基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强强调

3、了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达与性状表达。事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它生命科学技术的根本特征。区别于其它生命科学技术的根本特征。重组重组DNADNA技术发展史上的三大里程碑：技术发展史上的三大里程碑：一、一、2020世纪世纪4040年代确定了遗传信息的携带者、年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是即基因的分子载体是DNADNA而不是蛋白质，解决而不是蛋白

4、质，解决了遗传的物质基础问题。了遗传的物质基础问题。二、二、5050年代提出了年代提出了DNADNA分子的双螺旋结构模型和分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代解决了基因的自我复制和世代交替问题。交替问题。Generalized model of semiconservative replication of DNA.New synthesis is shown in blue.三、三、5050年代末至年代末至6060年代，相继提出了年代，相继提出了“中心法中心法则则”和操纵子学说和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，阐成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息

5、的流动与表达机制。明了遗传信息的流动与表达机制。CrickCrick于于19541954年所提出的遗传信息传递规律（即年所提出的遗传信息传递规律（即中心法则）。中心法则）。中心法则的演变中心法则的演变1954年首次年首次提出的提出的“中心法则中心法则”1970-1980年年的的“中心法则中心法则”21世纪后修正世纪后修正的的“中心法则中心法则”上个世纪中下叶以来，现代分子生物学的迅猛发展源上个世纪中下叶以来，现代分子生物学的迅猛发展源自工具酶的发现。自工具酶的发现。5.1 5.1 基因操作的基本工具基因操作的基本工具（一）限制性核酸内切酶（一）限制性核酸内切酶能够识别能够识别DNADNA上的特

6、定碱基序列并从这个位点切开上的特定碱基序列并从这个位点切开DNADNA分子。分子。第一个核酸内切酶第一个核酸内切酶EcoRIEcoRI是是BoyerBoyer实验室在实验室在19721972年发现年发现的，它能特异性识别的，它能特异性识别GAATTCGAATTC序列，将双链序列，将双链DNADNA分子在这分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。图图5-1 几种主要几种主要DNA内切酶所识别的序列及内切酶所识别的序列及其酶切末端其酶切末端。Werner Arber,Hamilton Smith and Daniel Nathans were award

7、ed the 1978 Nobel Prize for their work on REs.图图5-2 DNA连接酶能把不同的连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体片段连接成一个整体 RE RE 切割随机切割随机DNADNA分子（假定分子（假定4 4种碱基在种碱基在DNADNA中中均匀分布）的概率由该酶所识别的碱基数目均匀分布）的概率由该酶所识别的碱基数目按照按照4 4n n 来计算，如一个来计算，如一个6 6碱基切割酶平均每碱基切割酶平均每4096 bp4096 bp核核DNADNA有一个酶切位点（有一个酶切位点（4 46 6），而一），而一个个4 4碱基切割酶平均每碱基切割酶平均每256

8、 bp256 bp核核DNADNA就有一个就有一个酶切位点（酶切位点（4 44 4）。）。重组重组DNA实验中常见的主要工具酶实验中常见的主要工具酶酶酶 类类功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开识别并在特定位点切开DNADNADNADNA连接酶连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个通过磷酸二酯键把两个或多个DNADNA片段连接片段连接成一个成一个DNADNA分子分子DNADNA聚合酶聚合酶I I（大肠杆菌）（大肠杆菌）按按55到到33方向加入新的核苷酸，补平方向加入新的核苷酸，补平DNADNA双双链中的缺口链中的缺口反转录酶反转录酶按照按照RNARNA分子中的碱基序列，根据

9、碱基互补分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成原则合成DNADNA链链多核苷酸激酶多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5-OH5-OH末端末端（进行末端标记实验或用来进行（进行末端标记实验或用来进行DNADNA的连接的连接末端转移酶末端转移酶在双链核酸的在双链核酸的33末端加上多聚或单核苷酸末端加上多聚或单核苷酸DNADNA外切酶外切酶IIIIII从从DNADNA链的链的33末端逐个切除单核苷酸末端逐个切除单核苷酸噬菌体噬菌体DNADNA外切酶外切酶从从DNADNA链的链的55末端逐个切除单核苷酸末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶切除位于切除位于DNA

10、DNA链末端的磷酸基团链末端的磷酸基团嘌呤嘌呤腺嘌呤腺嘌呤鸟嘌呤鸟嘌呤嘧啶嘧啶胞嘧啶胞嘧啶尿嘧啶尿嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶组成组成DNA和和RNA分子的五种含氮碱基的结构式分子的五种含氮碱基的结构式多聚核苷酸链中新生磷酸糖苷键的产生过程多聚核苷酸链中新生磷酸糖苷键的产生过程单核苷酸5-磷酸基团向核酸链的3-OH发起进攻（二）基因克隆的载体（二）基因克隆的载体 载体三要素：载体三要素：自我复制能力自我复制能力 携带外源基因片段大小携带外源基因片段大小 插入位点多少插入位点多少易于鉴定识别程度易于鉴定识别程度大肠杆菌质粒载体大肠杆菌质粒载体:1 1、pSC101pSC101质粒载体质粒载体 长长9.0

11、9kb9.09kb，带有四环素抗性基因（，带有四环素抗性基因（tettetr r）及）及EcoRIEcoRI、HindIIIHindIII、BamHIBamHI、SalISalI、XhoIXhoI、PvuIIPvuII以及以及SmaISmaI等等7 7种限制性核酸内切酶的单种限制性核酸内切酶的单酶切位点，在酶切位点，在HindIIIHindIII、BamHIBamHI和和SalISalI等等3 3个个位点插入外源基因，会导致位点插入外源基因，会导致tettetr r失活。失活。大 肠 杆 菌大 肠 杆 菌pSC101质质粒 载 体 示粒 载 体 示意图。意图。是第一个基因克隆载体。缺点：它是一

12、种严紧是第一个基因克隆载体。缺点：它是一种严紧型复制控制的低拷贝质粒，平均每个寄主细胞型复制控制的低拷贝质粒，平均每个寄主细胞仅有仅有1212个拷贝，从带有该质粒的寄主细胞中提个拷贝，从带有该质粒的寄主细胞中提取取pSC101 DNApSC101 DNA，产量很低。，产量很低。2 2、ColE1ColE1质粒载体质粒载体 松弛型复制控制的多拷贝质粒。松弛型复制控制的多拷贝质粒。一般情况下，当培养基中氨基酸被耗尽，或是在一般情况下，当培养基中氨基酸被耗尽，或是在细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主染色体主染色体DNADNA的复制便被抑制，细胞

13、的生长也随之的复制便被抑制，细胞的生长也随之停止。停止。松弛型质粒松弛型质粒DNADNA却继续复制数小时，使每个寄主细却继续复制数小时，使每个寄主细胞中胞中ColE1ColE1质粒的拷贝数达到质粒的拷贝数达到1000300010003000个，占细胞个，占细胞总总DNADNA的的50%50%左右。左右。3 3、pBR322pBR322质粒载体质粒载体由三个不同来源的部分组成的：由三个不同来源的部分组成的：第一部分来源于第一部分来源于pSF2124pSF2124质粒易位子质粒易位子Tn3Tn3的氨苄的氨苄青霉素抗性基因（青霉素抗性基因（AmpAmpR R）；）；第二部分来源于第二部分来源于pSC

14、101pSC101质粒的四环素抗性基因质粒的四环素抗性基因（tettetr r）；）；第三部分则来源于第三部分则来源于ColE1ColE1的派生质粒的派生质粒pMB1pMB1的的DNADNA复制起点（复制起点（oriori）。）。优点是具有较小的分子量优点是具有较小的分子量(4363bp)(4363bp)，易于纯化。，易于纯化。即使携带了即使携带了6-8kb6-8kb的外源的外源DNADNA片段，操作仍较便片段，操作仍较便利。利。有两种抗生素抗性基因作为转化子的选择标记。有两种抗生素抗性基因作为转化子的选择标记。有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增，每个细胞有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增，每个细胞可

15、累积可累积1000300010003000个拷贝，便于制备重组体个拷贝，便于制备重组体DNADNA。4 4、pUCpUC质粒载体（包括四个部分）：质粒载体（包括四个部分）：来自来自pBR322pBR322质粒的复制起点（质粒的复制起点（oriori）氨苄青霉素抗性基因（氨苄青霉素抗性基因（ampampr r）大肠杆菌大肠杆菌-半乳糖半乳糖苷苷酶基因（酶基因（lacZlacZ）启动子及）启动子及编码编码-肽链的肽链的DNADNA序列。特称为序列。特称为lacZlacZ基因基因 位于位于lacZlacZ基因基因5-5-端的一段多克隆位点端的一段多克隆位点（MCSMCS），外源基因插入破坏），外源基

16、因插入破坏lacZ lacZ 基因功能基因功能LacZLacZ编码编码-半乳糖苷酶氨基端半乳糖苷酶氨基端146146个氨基酸的个氨基酸的-肽，肽，IPTGIPTG（异丙基（异丙基-D-D-硫代半乳糖苷）诱导该基因表硫代半乳糖苷）诱导该基因表达，所合成的达，所合成的-半乳糖苷酶半乳糖苷酶-肽与宿主细胞编码的肽与宿主细胞编码的缺陷型缺陷型-半乳糖苷酶互补，产生有活性的半乳糖苷酶互补，产生有活性的-半乳糖半乳糖苷酶，水解培养基中的苷酶，水解培养基中的X-galX-gal（5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚吲哚-D-D-半乳糖苷），生成蓝色的溴氯吲哚。半乳糖苷），生成蓝色的溴氯吲哚。含含X-ga

17、lX-gal培养基中非转化菌落呈蓝色，含有重组培养基中非转化菌落呈蓝色，含有重组DNADNA分分子的菌落为白色。子的菌落为白色。优点：优点：更小的分子量和更高的拷贝数。在更小的分子量和更高的拷贝数。在pBR322pBR322基础基础上构建上构建pUCpUC质粒载体时，仅保留下其中的氨苄青霉素质粒载体时，仅保留下其中的氨苄青霉素抗性基因及复制起点，其分子小了许多，抗性基因及复制起点，其分子小了许多，pUC8pUC8为为2750bp2750bp，pUC18pUC18为为2686bp2686bp。由于缺失。由于缺失roprop基因，基因，pUCpUC质质粒不经氯霉素扩增时，平均每个细胞即可达粒不经氯

18、霉素扩增时，平均每个细胞即可达500700500700个拷贝。个拷贝。ColE1质粒质粒DNA复制起始部位调控因子之间关系复制起始部位调控因子之间关系前体前体RNA(RNAII)RNA(RNAII)的转录起始于复制起点上游，需经的转录起始于复制起点上游，需经RNaseHRNaseH加工后产生有加工后产生有555555个核苷酸的引物，起始个核苷酸的引物，起始DNADNA合合成。成。RNA 1RNA 1在在RNA 2RNA 2的的55末端，转录方向相反，因此能通过末端，转录方向相反，因此能通过氢键配对与后者相互作用，阻止氢键配对与后者相互作用，阻止RNaseHRNaseH加工加工RNA 2RNA

19、2，使，使其不能转化为有活性的引物，阻碍复制起始。其不能转化为有活性的引物，阻碍复制起始。没有没有RopRop蛋白，蛋白，RNA 1RNA 1基因就不能起始转录。基因就不能起始转录。pUCpUC质粒结构中具有来自大肠杆菌质粒结构中具有来自大肠杆菌laclac操纵子的操纵子的lacZlacZ基因，所编码的基因，所编码的-肽链可参与肽链可参与-互补互补作用。因此，可用作用。因此，可用X-galX-gal显色法实现对重组体转显色法实现对重组体转化子的鉴定。化子的鉴定。具有多克隆位点具有多克隆位点MCSMCS区段，可以把具两种不同粘区段，可以把具两种不同粘性末端（如性末端（如EcoRIEcoRI和和B

20、amHIBamHI）的外源）的外源DNADNA片段直接片段直接克隆到克隆到pUC8pUC8质粒载体上。质粒载体上。5 5、pGEM-3ZpGEM-3Z质粒质粒 长度为长度为2743bp2743bp，编码有一个氨苄青霉素抗，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个性基因和一个lacZlacZ基因。基因。含有两个噬菌体启动子含有两个噬菌体启动子(T7(T7和和SP6)SP6)，为，为RNARNA聚合酶的附着提供了特异性识别位点。加入聚合酶的附着提供了特异性识别位点。加入T7T7或或SP6 RNASP6 RNA聚合酶，所克隆的外源基因便会转录聚合酶，所克隆的外源基因便会转录出相应的出相应的mRNAmRNA

21、。6 6、穿梭质粒载体（、穿梭质粒载体（shuttle plasmid vectorshuttle plasmid vector）由人工构建的具有两种不同复制起点由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，可在两种不同的寄主细胞中存和选择记号，可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。活和复制的质粒载体。这类质粒载体可保证外源这类质粒载体可保证外源DNADNA序列在不序列在不同物种同物种(原核和真核原核和真核)的细胞间得到扩增，用的细胞间得到扩增，用途广泛。途广泛。7 7、pBluescriptpBluescript噬菌粒载体噬菌粒载体 pBluescriptpBluescript是一类从

22、是一类从pUCpUC载体派载体派生而来的噬菌粒载体，简称为生而来的噬菌粒载体，简称为pBSpBS（+/-+/-），如今则更多地叫作），如今则更多地叫作pBluescript KSpBluescript KS（+/-+/-）或）或pBluescript SKpBluescript SK（+/-+/-）。）。SKSK表示多克隆位点区的取向，即表示多克隆位点区的取向，即lacZlacZ基因是按照基因是按照SacIKpnISacIKpnI的方向转录；的方向转录；（+/-+/-）表示单链噬菌体）表示单链噬菌体f1f1复制起点的两种相反的复制起点的两种相反的取向。取向。f1f1（+）起点表示当）起点表示当

23、pBluescriptpBluescript噬菌粒载体和辅助噬菌粒载体和辅助噬菌体共感染寄主细胞时，能够回收到噬菌体共感染寄主细胞时，能够回收到lacZlacZ基因的基因的有意义链有意义链DNADNA；而；而f1f1（-）起点则表示当）起点则表示当pBluesriptpBluesript噬菌粒载体与辅助噬菌体共感染寄主细胞时，可回噬菌粒载体与辅助噬菌体共感染寄主细胞时，可回收到收到lacZlacZ基因的无意义链基因的无意义链DNADNA。(i)(i)在多克隆位点区（在多克隆位点区（MCSMCS）的两侧，存在一对）的两侧，存在一对T3T3和和T7T7噬菌体的启动子，用以定向指导插入在多克隆位点噬

24、菌体的启动子，用以定向指导插入在多克隆位点上的外源基因的转录活动；上的外源基因的转录活动；(ii)(ii)具有单链噬菌体具有单链噬菌体M13M13或或f1f1的复制起点和一个来自的复制起点和一个来自ColE1ColE1质粒的复制起点，保证质粒的复制起点，保证pBluescriptpBluescript噬菌粒载噬菌粒载体在有或无辅助噬菌体共感染的不同情况下，按照体在有或无辅助噬菌体共感染的不同情况下，按照不同的复制形式分别合成出单链或双链不同的复制形式分别合成出单链或双链DNADNA；(iii(iii）编码有一个氨苄青霉素抗性基因，）编码有一个氨苄青霉素抗性基因，作为转化子克隆的选择标记；作为转

25、化子克隆的选择标记；(iv)(iv)含有一个含有一个lacZlacZ基因，可以按照基因，可以按照X-X-gal-IPTGgal-IPTG组织化学显色法筛选噬菌粒载组织化学显色法筛选噬菌粒载体的重组子。体的重组子。仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNADNA连接酶进行连接酶进行DNADNA的切割和重组，还不能满足的切割和重组，还不能满足基因工程的要求，只有将它们连接到具备自基因工程的要求，只有将它们连接到具备自主复制能力的主复制能力的DNADNA分子上，才能在寄主细胞分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。中进行繁殖。具备自主复制能力的具备自主复制能力的DNADNA

26、分子就是分子分子就是分子克隆的载体（克隆的载体（vectorvector）。病毒、噬菌体）。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。因导入的载体。获得了用外源获得了用外源DNADNA片段和载体分子重组而成的片段和载体分子重组而成的杂种杂种DNADNA分子后，还必须通过一个被称为细菌分子后，还必须通过一个被称为细菌转化的过程将其重新导入到寄主细胞中，才转化的过程将其重新导入到寄主细胞中，才能保证重组能保证重组DNADNA分子的增殖（图分子的增殖（图5-35-3）。）。5.2 DNA5.2 DNA操作技术操作技术5.2.15.2.1核酸的凝胶电

27、泳核酸的凝胶电泳自 从 琼 脂 糖（自 从 琼 脂 糖（a g a r o s ea g a r o s e）和 聚 丙 烯 酰 胺）和 聚 丙 烯 酰 胺（polyacrylamidepolyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离子量大小分离DNADNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组种分析鉴定重组DNADNA分子及蛋白质与核酸相互作用的分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。重要实验手段。一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这

28、种电泳分子在电度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。成正比，与片段大小成反比。生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，所 以，所 以，D N AD N A 和和 R N AR N A 又 被 称 为 多 聚 阴 离 子又 被 称 为 多 聚 阴 离 子（polyanionspolyanions），在电场中向正电极的方向迁移。），在电场中向正电极的方向迁移。由

29、于糖由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链双链DNADNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。的速度向正电极方向迁移。琼脂糖凝胶分辨琼脂糖凝胶分辨DNADNA片段的范围为片段的范围为0.2-50kb0.2-50kb之间。之间。聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1 1到到10001000个碱基对之间。个碱基对之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。高，孔隙越小，其分辨能力就越强。表

30、表5-3 琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片片段的能力段的能力 凝胶类型及浓度凝胶类型及浓度 分离分离DNA的大小范围（的大小范围（bp）0.3%琼脂糖琼脂糖 50 0001 000 0.7%琼脂糖琼脂糖 20 0001 000 1.4%琼脂糖琼脂糖 6 000300 4.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 1 000100 10.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 50025 20.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 501图图5-4 5-4 溴化乙锭染溴化乙锭染料的化学结构及其料的化学结构及其对对DNADNA分子的插入作分子的插入作用。由于插入了溴用。由于插入了溴化乙锭分子，在紫化乙锭分子，在

31、紫外光照射下，琼脂外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中糖凝胶电泳中DNADNA的的条带便呈现出橘黄条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。色荧光，易于鉴定。图图5-4 DNA脉冲电场凝胶电泳示意图脉冲电场凝胶电泳示意图 5.2.2 5.2.2 细菌转化与目标细菌转化与目标DNADNA分子的增殖分子的增殖通过细菌转化方法将体外构建好的杂种通过细菌转化方法将体外构建好的杂种DNADNA分子分子导入宿主细胞中。外源导入宿主细胞中。外源DNADNA通过自身载体上的复通过自身载体上的复制起始点进行复制增殖，能在宿主细胞中长期制起始点进行复制增殖，能在宿主细胞中长期保存下来，并能以完整的形式从细胞中被分离保存下来，并能

32、以完整的形式从细胞中被分离纯化出来。纯化出来。细菌转化（细菌转化（transformationtransformation），是指一种），是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的DNADNA而而导致性状特征发生遗传改变的过程。导致性状特征发生遗传改变的过程。为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增加其获取增加其获取DNADNA的能力。经过这种处理的细胞被的能力。经过这种处理的细胞被称作感受态细胞称作感受态细胞（competent cellscompetent cells）。CaClCaCl2 2法法将快速生长期大肠杆

33、菌置于经将快速生长期大肠杆菌置于经00预处理的低渗预处理的低渗CaClCaCl2 2溶液中，细胞膨胀，膜通透性改变，易与外源溶液中，细胞膨胀，膜通透性改变，易与外源DNADNA相相粘附。粘附。将该体系转移到将该体系转移到4242下做短暂的热刺激，外源下做短暂的热刺激，外源DNADNA就就可能被细胞吸收。将经过转化后的细胞置于选择性培可能被细胞吸收。将经过转化后的细胞置于选择性培养基上，筛选阳性克隆。养基上，筛选阳性克隆。转化效率可达到转化效率可达到5 510106 6-2-210107 7个转化子个转化子/g g超螺旋质超螺旋质粒粒DNADNA。电击法电击法电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，形成

34、疏电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。随着跨膜电压增加，大疏水性孔洞水孔洞。随着跨膜电压增加，大疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞，介质中的会转变为亲水性孔洞，介质中的DNADNA进入细进入细胞质。胞质。将生长至对数中期的将生长至对数中期的E.coliE.coli菌液冷却至菌液冷却至44后离心，洗菌后用后离心，洗菌后用10%10%的甘油悬浮，将高密的甘油悬浮，将高密度菌液（度菌液（2210101010/ml/ml）置于特制的电极杯中）置于特制的电极杯中进行电击。进行电击。获 得 最 大 转 化 效 率 时 场 强 一 般 为获 得 最 大 转 化 效 率 时 场 强 一 般 为12.515

35、kV/cm12.515kV/cm，时间跨度一般为，时间跨度一般为4.55.54.55.5毫毫秒。秒。电击转化与温度有关，一般在电击转化与温度有关，一般在0404进行。进行。由于转化载体上常带有由于转化载体上常带有LacLacZ Z基因，多用带有基因，多用带有不同抗生素的选择性培养基结合不同抗生素的选择性培养基结合-互补蓝互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。白斑筛选法鉴定转化细胞。5.2.35.2.3聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCRPCR）技术）技术聚合酶链式反应是快速扩增聚合酶链式反应是快速扩增DNADNA序列最常用的序列最常用的方法。方法。PCRPCR反应的模板反应的模板DNADNA若是基因

36、组上的某个片段，若是基因组上的某个片段，就称为就称为genomic PCRgenomic PCR，若是，若是mRNAmRNA反转录产生的反转录产生的cDNAcDNA，就称为，就称为RT-PCRRT-PCR。图图5-7 聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）技术）技术 图图5-8 PCR指数扩增时循指数扩增时循环次数与环次数与DNA产物数量的产物数量的比较比较19891989年年1212月，月，著名的自然科学杂志著名的自然科学杂志“SCIENCE”SCIENCE”将将PCRPCR和它所使用的聚合酶命名为第一个和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子年度分子”。主编主编Daniel Koshla

37、nd Jr.Daniel Koshland Jr.写道：第一篇有关写道：第一篇有关PCRPCR的的论文发表于论文发表于19851985年。自那以后，年。自那以后，PCRPCR已经发展成为日已经发展成为日益强大的和有广泛用途的技术。益强大的和有广泛用途的技术。有了有了PCRPCR，极少，极少量遗传物质也能扩增产生大量一般实验室都能得到的、量遗传物质也能扩增产生大量一般实验室都能得到的、可用于生化分析和鉴定的材料。可用于生化分析和鉴定的材料。“SCIENCE”“SCIENCE”确实在确实在19851985年发表了第一篇关于年发表了第一篇关于PCRPCR的的论文。但是，却拒绝了由穆利斯撰写的描述论文

38、。但是，却拒绝了由穆利斯撰写的描述PCRPCR技术技术的论文。编辑部给他回了一封标准的拒稿信：的论文。编辑部给他回了一封标准的拒稿信：“这篇文章虽然通过了评审委员会的初选，但不幸这篇文章虽然通过了评审委员会的初选，但不幸的是，专家们对本文的评审结论并没有像对同时期的是，专家们对本文的评审结论并没有像对同时期拟录用的稿件那样积极。所以，尊稿无力竞争本刊拟录用的稿件那样积极。所以，尊稿无力竞争本刊有限的版面。有限的版面。”凯利凯利穆利斯博士，穆利斯博士，（英文名（英文名Kary Banks Mullis，1944年年12月月28日日），美国生物），美国生物化学家。化学家。1993年年因发明聚合酶链

39、因发明聚合酶链锁反应（锁反应（PCR），），与迈克尔与迈克尔史密斯史密斯分享诺贝尔化学分享诺贝尔化学奖。同年还获得奖。同年还获得日本国际奖。日本国际奖。凯利凯利穆利斯（穆利斯（Kary MullisKary Mullis），），19441944年出生，年出生，19621962年在佐治亚理工学院化学工程专业毕业年在佐治亚理工学院化学工程专业毕业.受受同学们的蛊惑同学们的蛊惑，19661966年报考加州伯克利大学生化专年报考加州伯克利大学生化专业研究生被录取。业研究生被录取。19681968年一个人在年一个人在NATURENATURE发表发表“时间反演的宇宙学意义时间反演的宇宙学意义”论文并论文并

40、侥幸侥幸通过了博士生资格考试。通过了博士生资格考试。19721972年，以年，以“微生物铁转运因子的结构与有机合成微生物铁转运因子的结构与有机合成”获得博士学位。获得博士学位。毕业后，尝试写小说，但因毕业后，尝试写小说，但因“不能使一部分人物具有不能使一部分人物具有不幸的遭遇不幸的遭遇”而失败，又因而失败，又因厌恶天天宰杀实验小鼠厌恶天天宰杀实验小鼠而而两次丢掉工作。两次丢掉工作。他有一条知名的可能引起不少同学共鸣的学习曲线：他有一条知名的可能引起不少同学共鸣的学习曲线：刚开始时，对拓宽自身知识面表现出极大的兴趣刚开始时，对拓宽自身知识面表现出极大的兴趣知知识迅速上升，然后徘徊不前，最终进入失

41、望和不安阶识迅速上升，然后徘徊不前，最终进入失望和不安阶段段辞职辞职以后去一家小咖啡馆当了两年经理。以后去一家小咖啡馆当了两年经理。1979年加入西特年加入西特斯公司，负责斯公司，负责DNA合成。合成。正是费时费力的正是费时费力的DNA合成（单引物，以算术级数增合成（单引物，以算术级数增长），激发了他的思维。长），激发了他的思维。1983年年8月，穆利斯第一次在公司正式作了一个有关月，穆利斯第一次在公司正式作了一个有关PCR原理原理的学术报告。人们对这个报告的反应冷谈，的学术报告。人们对这个报告的反应冷谈，只有少数几个实验技术人员有些兴趣。穆利斯回忆说，只有少数几个实验技术人员有些兴趣。穆利斯

42、回忆说，“绝大多数人要么在我结束报告之前就离开了会场，绝大多数人要么在我结束报告之前就离开了会场，要么故意留下来给我出难题。他们认为这些肯定是胡要么故意留下来给我出难题。他们认为这些肯定是胡说八道。说八道。”普遍的观点是，虽然我不够聪明，没看出普遍的观点是，虽然我不够聪明，没看出问题的要害所在，但肯定有理由证明这个方法不行，问题的要害所在，但肯定有理由证明这个方法不行，要不为什么从前没人想到呢？要不为什么从前没人想到呢？PCRPCR技术的原理技术的原理首先将双链首先将双链DNADNA分子在临近沸点的温度下加热分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链分离成两条单链DNADNA分子，分子，DNAD

43、NA聚合酶以单链聚合酶以单链DNADNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸和实验中提供的引物序列合成新生的苷三磷酸和实验中提供的引物序列合成新生的DNADNA互补链。互补链。DNA DNA解链（变性）解链（变性）引物与模板引物与模板DNADNA相结合（退火）相结合（退火）DNADNA合成（链的延伸）三步。合成（链的延伸）三步。经不断重复循环之后，反应混合物中所含有的双链经不断重复循环之后，反应混合物中所含有的双链DNADNA分子数，即两条引物结合位点之间的分子数，即两条引物结合位点之间的DNADNA区段的拷区段的拷贝数，理论上的最高值应是贝数，理论

44、上的最高值应是2 2n n,实得实得1.81.8n n.将含有待扩增将含有待扩增DNADNA样品的反应混合物放置在高样品的反应混合物放置在高温（温（9494）环境下加热）环境下加热1 1分钟，使双链分钟，使双链DNADNA变变性，形成单链模板性，形成单链模板DNADNA。94加热，淬火加热，淬火降低反应温度（退火，约降低反应温度（退火，约5050），约），约1 1分分钟，使寡核苷酸引物与两条单链模板钟，使寡核苷酸引物与两条单链模板DNADNA结合在靶结合在靶DNADNA区段两端的互补序列位置上。区段两端的互补序列位置上。5060，退火，退火引物与模板引物与模板DNA相相结合结合将反应混合物的温

45、度上升到将反应混合物的温度上升到7272左右保温左右保温1-1-数分钟，在数分钟，在DNADNA聚合酶的作用下，从引聚合酶的作用下，从引物的物的3-3-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板分子按模板分子按5353方向延伸，合成新生方向延伸，合成新生DNADNA互补链。互补链。PCR扩增，扩增，72左右左右,按每按每分钟分钟1000个碱基对设计个碱基对设计循环往复循环往复应用实例：应用实例：实验中通过对拟南芥基因芯片数据分析实验中通过对拟南芥基因芯片数据分析,鉴定鉴定出一个受干旱胁迫诱导的出一个受干旱胁迫诱导的cDNA。干旱、紫外。干旱、紫外线、脱落酸、高盐以及水杨酸等胁

46、迫条件处理线、脱落酸、高盐以及水杨酸等胁迫条件处理后表达量均有显著提高后表达量均有显著提高,特别是干旱处理特别是干旱处理3h后后表达量极表达量极显著显著提高。提高。多序列比对和系统进化分析发现该基因含多序列比对和系统进化分析发现该基因含有典型的有典型的AP2/EREBP DNAAP2/EREBP DNA结合结构域，且结合结构域，且属于属于DREBDREB亚家族。由于其亚家族。由于其N N端富含谷氨酰端富含谷氨酰氨残基氨残基,将它命名为将它命名为QRAP2(Glutamine-QRAP2(Glutamine-rich AP2)rich AP2)。常规常规PCRPCR技术能扩增两引物之间的技术能扩

47、增两引物之间的DNADNA区段，区段，然而，有时我们也希望扩增位于靶然而，有时我们也希望扩增位于靶DNADNA区区段之外的未知段之外的未知DNADNA序列，这就需要应用序列，这就需要应用反反向向PCRPCR（reverse PCRreverse PCR）技术）技术。用一种在靶序列上没有酶切位点的核酸限制用一种在靶序列上没有酶切位点的核酸限制性内切酶消化性内切酶消化DNADNA；产生大小不同的线性产生大小不同的线性DNADNA片段群体，其中靶片段群体，其中靶DNADNA区段的区段的DNADNA分子长度不超过分子长度不超过23kb23kb，经连，经连接后重新环化；接后重新环化；按靶序列设计的一对引

48、物与互补序列退火结按靶序列设计的一对引物与互补序列退火结合，其延伸方向如箭头所指；合，其延伸方向如箭头所指；反向反向PCR的基本操作程的基本操作程序。波纹线表示靶序。波纹线表示靶DNA区段，箭头表示限制性区段，箭头表示限制性内切酶位点，分别用方内切酶位点，分别用方框表示靶框表示靶DNA区段的左区段的左侧和右侧序列。侧和右侧序列。RACERACE技术（技术（rapid amplification of cDNA rapid amplification of cDNA endsends）(Page 183)(Page 183)在已知在已知cDNAcDNA序列基础上克隆序列基础上克隆55或或33端缺

49、失端缺失序列的技术。根据已知序列设计基因片段内序列的技术。根据已知序列设计基因片段内部特异引物，由该片段向外侧进行部特异引物，由该片段向外侧进行PCRPCR扩增得扩增得到目的序列。用于扩增到目的序列。用于扩增55端的方法称为端的方法称为5RACE5RACE，用于扩增，用于扩增33端的称为端的称为3RACE3RACE。5 RACE5 RACE 在反转录酶的作用下，以基因片段内部特异在反转录酶的作用下，以基因片段内部特异性引物（性引物（GSP1GSP1）启始）启始cDNAcDNA第一条链合成。第一条链合成。RNaseRNase降解模板链降解模板链mRNAmRNA，纯化第一链。，纯化第一链。用末端转

50、移酶在用末端转移酶在cDNAcDNA链链33端加入连续的端加入连续的dCTPdCTP。以连有以连有oligo(dG)oligo(dG)的锚定引物和基因片段内的锚定引物和基因片段内部特异的部特异的nestednested引物进行引物进行PCRPCR扩增，得到目的扩增，得到目的片段，用片段，用nest PCRnest PCR检测。检测。3RACE1、用、用oligo(dT)锚定锚定引物启始引物启始cDNA第一第一链的合成链的合成.2、降解模板、降解模板mRNA.3、用通用锚定引物、用通用锚定引物UAP和基因片段内部和基因片段内部特异引物进行特异引物进行PCR扩扩增得到目的增得到目的3片段，片段，用