分子生物学第七章教程文件课件.pptx
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- 分子生物学 第七 教程 文件 课件
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1、(Source:Lyer,V,The transcriptional program in the response ofhuman fibroblasts to serum.Science 283(1 Jan 1999)f.1,p.83)第7 章基因突变与交换Source:StanleyN.Cohen/Photo Researchers,IncGene Mutation&Crossing-Over7.1.Point mutation 的类型与机理7.3.保证遗传稳定的机制7.4.基因重组交换的分子机制7.2.诱发突变 dNt deletion or insertion=3x dNt=3x d
2、Ntn xAmino acidFramshift conversion(取代)PuPutransition(转换)transvertion(颠换)PyPyPyPu南京大学田大成等发现的遗传突变新机制Nature,doi:10.1038/nature07175,Dacheng Tian,Jian-Qun Chen第一,基因组各区域的突变率很不相同,自发突变的数量是由Indel的数量和密度所决定第二,生物多样性最初变异来源主要是由Indel诱导产生第三,自然选择在很大程度上是通过对Indel的选择而实现第四,生物通过调节自身变异能力而适应环境的能力,突变在进化中的作用比人们原先想象的要大得多相当巨
3、。conversioneffect-Samesense mut.-Missense mut.-Nonsense mut.GAA(E)GAG(E)GAA(E)AAA(K)GAA(E)TAA(stop)突变的表达类型-获得突变型是遗传学研究的重要前提-非条件型突变;allelein DNA level(RFLP,RAPD)allelein phenotype(红花/白花,糯/非糯)条件型突变;突变的表现=突变基因型+诱导条件(光,温敏感不育,Ts,su-)突变的表达类型 无效突变 Null mutation:完全消除了基因功能的突变(缺失)功能丧失型突变(loss-of-function muta
4、tion)无效突变或其他阻止基因功能的突变 功能获得型突变(gain-of-function mutation)突变使蛋白质获得新的功能 沉默突变(silent mutation)没有明显表型效应改变的突变7.1.2.突 变 发 生 的 机 理(自发突变,诱发突变)7.1.2.1.自发突变7.1.2.1.1.碱基异构式引起DNA复制过程的错误a)碱基异构式A(amino)G(keto)A(imino)G(enol)C(a)G(k)C(i)G(e,i)T(keto)T(enol-2)orT(enol-4)b)碱基异构式引起DNA复制的错配(来源:分子生物学(2007),郑用琏,第321页)碱基异
5、构式引起DNA复制的错配(来源:分子生物学(2007),郑用琏,第321页)碱基异构式引起DNA复制的错配A(i,anti)A(a,syn)A(i,anti)G(k,syn)G(e,i,anti)G(k,syn)G(e,i,anti)A(a,syn)正确配对 A(a)错误配对 A(a)A(i)T(k)C(i)C(a)G(k)G(k)G(e)C(a)T(e)T(k)A(a)T(k)A(a,anti)T(k,anti)碱基异构式引起DNA的错配突变A(a)C(i)C(i)A(a,anti)G(k,syn)syn)G(k)C(a)C(a,anti)G(k,anti)w.t.mut.维持遗传的稳定性随
6、机引起其他各类基因的突变7.1.2.2.增变基因(mutatorgene)but be wronged增变基因类别;DNApolymerase 相关基因3 5editing function mutation错配修复系统的基因MCE(mismatch correctionenzyme)DNA损伤修复系统基因错配修复功能丧失 突变率升高修复过程是基因突变的重要来源7.1.2.3 不对称交换内源转座子(Retro-transposon,Helitron)Indel(Source:Lyer,V,The transcriptional program in the response ofhuman f
7、ibroblasts to serum.Science 283(1 Jan 1999)f.1,p.83)Crossing-Over第7 章基因突变与交换7.2.诱发突变Source:StanleyN.Cohen/Photo Researchers,IncGene Mutation&7.2.1.物理诱变a)电离辐射诱变;Co60()()rayCs137()()rayH3()ray()()ray穿透性(外照射处理)()()ray非穿透性(内标记处理)P32,S35()ray卫星搭载诱变;高真空,强辐射,微重力dNt电荷及结构改变卫星搭载育种太空蔬菜微重力高辐射强射线(来源:不详)U.V.C T T
8、 Ab)b)非电离辐射UltraUltra VioletViolet lightlight(U.V)(U.V)-pyrimidine dimer(TT dimer)is generated bycovalent links between adjacent TT共价键(来源:分子生物学(2007),郑用琏,第309页)U.V.deaminationoxidationCUA(a)U.V.H2OH+OH-C(i)A(a)C(a)U.V.depurination(来源:分子生物学(2007),郑用琏,第309页)遗传多型性的概念(genetic polymorphism/hetergeneity)A
9、llele(结构基因,DNA区域)Multiple allelesAllele in DNAinversioninsertionPoint mutationdeletionRepetitive copiesTesting allele in DNAelectrophoresis pattern1980Botstein 限制性片段长度的多型性RFLP(RestrictinFragment Length Polymorphism)VNTR(various number of tandem repeats)1985 K.B.Mullis 基于聚合酶链式反应的多型性PCR-based polymorp
10、hism1996 E.Lander单核苷酸多型性SNP(single nucleotide polymorphism)7.2.2.生物技术定点诱变(来源:不详)基因的定点诱变 oligo-dNt 介导的定点诱变合成与目标基因某区段互补并含突变位点的oligo-dNt错配位点不能在3-endrenaturationrenaturationreplicationreplication twotwo timestimes(来源:分子生物学(2007),郑用琏,第314页)设计两突变引物(mut.P1&mut.P2)两通用引物(commonP1&commonP2)第一次两种PCR产物混合,变性,复性其
11、中一对双链分子不能进行第二次PCR另一对双链分子的PCR产物为诱变基因 引物重叠延伸的PCR诱变cP1mP1mP2cP2Mutants.DNAshuffling 技术的基因诱变Digestionligationtransformationselection转座子介导的突变体库的构建定向选择表型鉴定AIMSTi质粒介导的突变体库的构建定向选择表型鉴定 gfp插入突变体库的构建具有标签的植物突变体T-DNA-mediated Gene trapLBGene trapRB 是经过改造的质粒、转座子载体插入到基因组中使被插入位点正常基因功能丧失,通过载体携带的报告基因的表达及载体的保守序列识别插入位点
12、并分离基因。根据结构和表现“陷阱效应”的插入位点:增强子陷阱(enhancertrap)启动子陷阱(promoter trap)基因陷阱(genetrap)Ti质粒介导的基因突变(来源:分子生物学(2007),郑用琏,第318页)GUS assay in rice flower organs(I)(来源:分子生物学(2007),郑用琏,第319页)GUS assay in rice flower organs(II)(来源:不详)Mutant Information:BZ2 Mu ActivatorBz2(来源:不详)Ac/Ds(来源:分子生物学(2007),郑用琏,第81页)大型Mu插入突变
13、体库(来源:不详)QPM(来源:不详)7.2.3.化学诱变a)干扰碱基合成的化学诱变剂6-MercaltopurineSH干扰嘌呤合成5-Amino UracilOH2NO干扰嘧啶合成b)b)basebase anologsanologs leadsleads basebase mispairingmispairing(5-BrU)BrBr(来源:分子生物学(2007),郑用琏,第309页)BrU(k)ReplicationBrU(e)GCATreplicationerrorA/T5-BrU(k)G/C5-BrU(e)incorporationerrorG/CA/T(来源:分子生物学(2007
14、),郑用琏,第311页)A(a)T(k)5-BrU(e)T(k)A(a)5-BrU(k)G(k)C(e)5-BrU(e)mispairingA(a)5-BrU(k)G(k)C(a)G(k)A(a)ReplicationReplication errorerrorIncorporationIncorporation errorerrorG(k)5-BrU(k)mispairing5-BrU(e)CGInosineUracilXanthineCACHNO2deaminationc)Base modifyingchemical mutagenHNO2(Nitrous acid NA)A(来源:分子生
15、物学(2007),郑用琏,第312页)Base modifyingchemicalmutagenNH2OH(Hydroxylamine HA羟胺)HNHHOC(a)HAHNHHHOHNHHOA(a)NHOHNHHOC(i)N HHHEMS(Ethyl methane sulfonate)CH3SO-CH2CH3d)Alkylation agent mutagensOMMSOOCH3SO-CH3OSM(Sulfur Mustards gas 硫芥子气)HSCH2CH2ClCH2CH2Cl-TA X AAAAGCe)e)Mutageninsertion-framshiftMutageninsert
16、ion-framshift扁平分子AOAO(Acridine(Acridine Orange)Orange)EBEB(Ethidium(Ethidium Bromide)Bromide)-TAAAAAGC-A-TTAO TTTTCG-AAAGC-分子插入-ATTTTTCG-AOEB-ATTTCG-TAAAGC-ATXTTTTCG-TAXAAAAGC-AT EB TTTTCG-Targeting Induced Local Lesions In GenomeTILLING靶向诱导基因组局部突变突变型鉴定为主的正向遗传学研究定向筛选突变基因为主的反响遗传学研究基本技术:引物分别被两种700nm/8
17、00nm荧光标记,PCR扩增PCR产物变性,复性,mut单链与w.t单链形成异源双链根据基因组信息合成的特异引物CEL1错配碱基内切酶切割异源双链化学诱变获得大量的突变体双色变性PAGE检测电泳7.3.保证遗传稳定的机制(来源:不详)复制过程中的错配修复基因的回复突变致死突变DNA的损伤修复密码的简并多倍体7.3.1.复制过程中的错配修复机制(=10-11)+-A-C-DNAmismatchDNApol(=10-8)经第二次校正 =10-11MRSMismatchRepairSystem7.3.1.1.Mismatch repair systemDNApolymeraseligasedam g
18、enem6A甲基化酶MCE(mismatch correctenzyme)3 subunits mutH,L,S识别新生链中非m6A 的GATC序列Scanning 新生链中错配碱基酶切含错配碱基的新生DNA区段3-C-CTAG-CTAG-55DNA中的GATC(palindromicseq.)为m6A甲基化敏感位点平均每2kb左右有一GATCseq.MCE scanning-T-GATC-GATC-33-5少梯度多(m6A)新生链MCE scanningendonucleasePolymeraseligaseGATCGATCCTAGGATCCTAGGATCCTAGCTAGCTGATCCTAG
19、TGATCCTAGAT7.3.1.2.ung system(尿嘧啶-N-糖苷酶系统)-TAGC-ATCG-TAGC-AUCG-TAGC-ung-aseAUCG-TAGC-A CG-UApurinase(内切酶)DNApolligase-TAGC-ATCG-TT-AA-7.3.2.DNA的损伤修复7.3.2.1.photo reactivation Beforereplication&Error-free 400 nm Blue light&phR gene(photo-reactivationenzyme)-TT-AA-TT-AA-可见光激活-TT-AA-phR 471aa7.3.2.2.7.
20、3.2.2.ExisionRepairExisionRepairBeforeReplication Error-freeUvrA,B,C geneEndonucleasesExonuclease切补修复 DNApol Ligase(来源:不详)E.coli存活%U.V 计量w.t.UvrA+RecA+RecA+uvr a-rec a-uvr a-Rec-A.gene 以某种方式参与DNA损伤修复7.3.2.3.7.3.2.3.RecombinativeRepairRecombinativeRepairTTAATTAATTTTAATTTTAATTTT变性Rupp.Howard-FlandersU
21、.V.复制D.S.DNA提取变性S.S.DNATTAATTAATTAA继续复制E.colik12w.t.uvr-a/Rec-AUvr-A/rec-auvr-a/rec-a500830.2320050201.3Genotype(尔格/mm2)TT数量/107bp存活率为对照37%的U.V.计量 存在与重组有关的暗修复机制 与Rec-A基因引起的strandtransfer有关 TTdimer未被修复,仅表现在后代群体中TTdimer浓度的稀释 链的非准确转移,导致突变机率的增加RecombinativeRepairRecombinativeRepair(strand(strand transfe
22、rtransfer repair)repair)AfterreplicationrepairError-proneRecA,DNA polymeraeligasegenes be needed(来源:不详)7.3.2.4.7.3.2.4.SOSSOS repairrepair(U.V.(U.V.reactivationreactivation oror WW reactivation)reactivation)JeanWeigleE.coli8010100mut.100%50%10%Damaged DNA of phage be repaired in E.coliA SOS repairin
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