分子生物学-DNA检测技术课件.pptx

1、DNA 技术技术1.琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳2.PCR技术技术3.荧光定量荧光定量PCR技术技术4.Southern blot5.双双脱氧法测序脱氧法测序1.琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳1.1 原理原理：1.2 用途用途：琼脂糖凝胶电泳的原理琼脂糖凝胶电泳的原理DNA电泳迁移电泳迁移：电荷效应分子筛效益电荷效应分子筛效益 （1）DNA带负电，电场中，向正极移动；带负电，电场中，向正极移动；（2）决定移动速度三因素：）决定移动速度三因素：DNA大小，电荷数，大小，电荷数，构构型（型（超螺旋超螺旋 线性线性 开环开环）；）；（3）线性线性DNA分子移动速度与其分子质量的对数成分子移动速度与其分

2、子质量的对数成反比（反比（分子量越大，跑得越慢分子量越大，跑得越慢）；）；琼脂糖琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的片段的能力能力 凝胶类型及浓度凝胶类型及浓度 分离分离DNA的大小范围（的大小范围（bp）0.3%琼脂糖琼脂糖 50 0001 000 0.7%琼脂糖琼脂糖 20 0001 000 1.4%琼脂糖琼脂糖 6 000300 4.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 1 000100 10.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 50025 20.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 501琼脂糖凝胶电泳的原理琼脂糖凝胶电泳的原理检测检测原理原理：溴化溴化乙锭（乙锭（EB）可插入双链）可插入双链DN

3、A分子中，分子中，在紫外光照射下，发射荧光在紫外光照射下，发射荧光。EB:先染与后染先染与后染 核酸凝胶电泳技术核酸凝胶电泳技术溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出荧光，易于鉴定。琼脂糖凝胶电泳用途琼脂糖凝胶电泳用途1）DNA分子量测定（分子量测定（距离距离 分子量分子量）2）基因，克隆的鉴定（通过基因，克隆的鉴定（通过1完成完成）如何知道如何知道DNA大小呢？大小呢？加标准分子量加标准分子量DNA Marker，测定，测定分子量分子量加标准浓度的加标准浓度的DNA，测定浓度，测定浓度500琼脂糖凝胶电泳

4、用途琼脂糖凝胶电泳用途3）不同不同长度的基因片断的长度的基因片断的分离分离 鉴定鉴定DNA重组重组4）DNA浓度的测定浓度的测定 （荧光的强度与（荧光的强度与DNA含量成正比）含量成正比）荧光强度荧光强度=碱基长度碱基长度*分子个数，（总碱基数越多，插入分子个数，（总碱基数越多，插入EB越越多）多）琼脂糖凝胶电泳操作注意细节琼脂糖凝胶电泳操作注意细节1）根据片段大小配制根据片段大小配制不同浓度的胶不同浓度的胶（改变分辨率），（改变分辨率），片段越小片段越小，需要胶需要胶浓度越大浓度越大。2）胶要现制先用胶要现制先用3）选择合适的选择合适的Marker4）配胶的缓冲液与电泳缓冲液要是配胶的缓冲液

5、与电泳缓冲液要是同一种同一种，且浓度一致（，且浓度一致（1倍）倍）5）点样时要加入点样时要加入loading buffer，并注意，不要将样点到点样孔，并注意，不要将样点到点样孔之外（飘样），也不要将胶戳漏（漏样）之外（飘样），也不要将胶戳漏（漏样）6）根据片段大小及电泳检测目的，选择合适的电压及电泳时间根据片段大小及电泳检测目的，选择合适的电压及电泳时间7）EB染色。染色。2.PCR(聚合酶链式反应聚合酶链式反应)技术技术 5 3 3 5 PCR的基本原理的基本原理变性、复性、半保留变性、复性、半保留复制复制 PCR三步曲三步曲变性变性 9097退火退火 4555延伸延伸 72 DNA解链解

6、链（变性）（变性）引物与模板引物与模板DNA相结合相结合（退火）（退火）DNA合成（合成（链的延伸链的延伸）三步。）三步。经不断重复循环之后，反应混合物中所含有的经不断重复循环之后，反应混合物中所含有的双链双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应是区段的拷贝数，理论上的最高值应是2n,实得实得1.8n.94加热，淬火加热，淬火5060，退火，退火引物与模板引物与模板DNA相相结合结合PCR扩增，扩增，72左右左右,按每按每分钟分钟1000个碱基对设计个碱基对设计循环往复循环往复94 30s55 30s72 1 min94 5

7、 min72 10min30-32 cyclesPCR反反 应应 程程 序序需要摸索需要摸索Taq E 1kb/min,目标目标DNA长度不长度不一样，所需时间一样，所需时间也不同。也不同。？PCR扩增引物的设计引物常规设计原则引物常规设计原则1.长度：长度：7 nt,一般一般nt左右左右;(仅仅binding,不含接头不含接头)2.G+C 含量含量3.避免聚嘌呤或聚嘧啶或有回文对称结构；避免聚嘌呤或聚嘧啶或有回文对称结构；4.引物自身不能互补（引物自身不能互补（3个）个）5.引物之间不能互补（引物之间不能互补（5 个）个）6.引物端不能错配引物端不能错配,不能修饰，尽量不用不能修饰，尽量不用

8、A,不能超过个连不能超过个连续的续的G或或C；引物常规设计原则引物常规设计原则7.端可变化修饰，附加酶切位点；端可变化修饰，附加酶切位点；8.两引物的两引物的Tm值应比较接近；值应比较接近；9.正链引物：正链引物：mRNA序列照抄；序列照抄；负链引物：先写出负链引物：先写出mRNA序列的互补序列，然后翻转重写。序列的互补序列，然后翻转重写。10解链温度解链温度Tm=4(G+C)+2(A+T)=20nt Tm一般一般最佳最佳 PCR反应中结合温度（反应中结合温度（anneaning temperature）T=Tm-5反应体系反应体系P+P-模板模板dNTPTaq10*bufferddH2O聚合

9、酶链式反应（聚合酶链式反应（PCRPCR）技术）技术普通普通PCR能不能定量检测？能不能定量检测？检测结果能不能准确、精确？检测结果能不能准确、精确？如果不精确大的话，有无其他方法？如果不精确大的话，有无其他方法？3.3.荧光定量荧光定量PCRPCR技术技术实时定量实时定量PCRPCR实时荧光定量实时荧光定量 PCR（real time quantitative PCR，Q-PCR）：通过对通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量光定量 PC

10、R 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图条荧光扩增曲线图。实时定量实时定量PCRPCR一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段荧光背景信号阶段 荧光信号指数

11、扩增阶段荧光信号指数扩增阶段 平台期平台期只有在只有在荧光信号指数扩增荧光信号指数扩增阶段，阶段，PCR 产物量的对数值与起产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。量分析。实时荧光定量实时荧光定量pcr技术中的一些重要因素：技术中的一些重要因素：Ct值值:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。数。Ct值与起始模板的关系值与起始模板的关系:每个模板的每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，的对

12、数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。可利用值越小。可利用来计算出该样品的起始拷贝数来计算出该样品的起始拷贝数。SYBR荧光染料：荧光染料：在在PCR反应体系中，加入过量反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，荧光染料，SYBR荧光染荧光染料特异性地掺入料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与信号的增加与PCR产物的增加完全同步。产物的增加完全同步。荧光染料和荧光探针荧光染料和荧光探针SYBR Green I作探针的实时作探针的实时定量

13、定量PCR实验实验过程图示过程图示 TaqMan荧光探针：荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸该探针为一寡核苷酸(50bp-150bp)，两端分别标记一个，两端分别标记一个报告荧报告荧光基团光基团和一个和一个淬灭荧光基团淬灭荧光基团。探针完整时，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩扩增时，增时，Taq酶的酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧

14、光信号，团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与的累积与PCR产物形成完全同步。产物形成完全同步。荧光染料和荧光探针荧光染料和荧光探针TaqMan探探针 实 时 定针 实 时 定量量PCR技术技术 4.4.Southern blotSouthernSouthern印迹是将印迹是将DNADNA片断从电泳凝胶上直接转移至膜支持物片断从电泳凝胶上直接转移至膜支持物（如硝酸纤维素膜、尼龙膜）上，使（如硝酸纤维素膜、尼龙膜）上，使DNADNA片断固定的技术。片断固定的技术

15、。1 1、DNADNA经限制性内切酶消化成一系列片段经限制性内切酶消化成一系列片段，进行，进行琼脂糖凝琼脂糖凝胶电泳，各片段因分子量不同而彼此胶电泳，各片段因分子量不同而彼此分开；分开；2 2、经、经碱处理凝胶，使碱处理凝胶，使DNADNA的片段被变性、中和并通过毛细的片段被变性、中和并通过毛细作用在高盐缓冲液中在原位将单链核酸转印到硝酸纤维膜作用在高盐缓冲液中在原位将单链核酸转印到硝酸纤维膜上，烘干、固定。上，烘干、固定。分子生物学中使用的标记方法分子生物学中使用的标记方法H3PO4=H+H2PO4-=H+HPO42-=H+PO43-DNA双链分开，探针结合双链分开，探针结合缓冲液：缓冲液：

16、NaOH胶：双链胶：双链DNA膜：单链膜：单链DNADNA的限制性酶切的限制性酶切Southern 印记印记DNA分子分子限制片段限制片段限制性酶切割限制性酶切割琼脂糖电泳琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜上转移至硝酸纤维素膜上与放射性标记与放射性标记DNA探针杂交探针杂交放射自显影放射自显影带有带有DNA片片段的凝胶段的凝胶凝胶凝胶滤膜滤膜用缓冲液用缓冲液转移转移DNA吸附有吸附有DNA片段的膜片段的膜Southern印迹法印迹法Albert Lasker Award for Clinical Medical ResearchAlec John Jeffreys and Edwin M.South

17、ernAlec John Jeffreys and Edwin M.Southern for development of two powerful technologies-Southern hybridization and DNA fingerprinting-that together revolutionized human genetics and forensic diagnostics.Alec John JeffreysUniversity of Leicester(UK)Edwin SouthernUniversity of Oxford(UK)Southern Hybri

18、dizationAn agarose gel is prepared and run according to the standard procedures,then it is stained and photographed to have a record of all the DNA fragments.The gel is prepared by first denaturing,then neutralizing,the DNA fragments in the gelSouthern hybridization has many steps and usually requir

19、es more than one day(or lab period)to complete.This procedure can be broken down into several sectionsPreparing the gel After neutralization,the gel is carefully measured.Once the gel dimensions are known,we can begin to assemble the materials needed for Southern transfer.The finished Southern appar

20、atus and the resultsThe completed Southern transfer apparatus.The DNA will transfer overnight.The membrane is removed,washed,and baked at 70C.The final procedure is developing the nylon membrane using nonradioactive probe detection.The Southern gel,showing all the DNA bands from cleaving Lambda with

21、 different restriction enzymes.Since we know the sequence that is complimentary to our probe,we should be able to determine which fragment will be detected by the probeThe Southern blot shows only one band in each lane.This band corresponds to the band on the gel which contains the Lambda sequence t

22、hat is complimentary to our probe.This sequence occurs only once in each digest and hence there is only one band per lane5.5.双脱氧法测序双脱氧法测序双脱氧法又称末端终止法，用于单链测序双脱氧法又称末端终止法，用于单链测序原理：原理：Atkinson发现用发现用 DNA pol 合成合成DNA时如在反应物中加时如在反应物中加入一定量的入一定量的 2,3ddTTP 时，因时，因ddT的的3碳原子不含碳原子不含OH,故故DNA不能延伸。不能延伸。1982年年Sanger 利用

23、此原理建立了利用此原理建立了双脱氧测序法双脱氧测序法。原。原理和加减法相似，但不再是加一种理和加减法相似，但不再是加一种dNTP或减一种或减一种dNTP,而是加入某一种双脱氧核苷，来终止聚合反应。用此而是加入某一种双脱氧核苷，来终止聚合反应。用此法测得法测得G4含含5577bp.回顾回顾DNA DNA 与与RNA RNA 戊糖戊糖(pentose)：1（构成（构成RNA）-D-核糖核糖(ribose)（构成（构成DNA）OHOCH2OHOH-D-脱氧核糖脱氧核糖(deoxyribose)2 3 4 5 OHOCHOHOHOH23,5-3,5-磷酸二酯键的形成磷酸二酯键的形成多核苷酸链多核苷酸链

24、 核酸就是由许多核酸就是由许多核苷酸核苷酸单位单位通过通过3,5-磷酸二酯磷酸二酯键键连接起来形成的不含连接起来形成的不含侧链的长链状化合物。侧链的长链状化合物。核酸是核酸是具有方向性具有方向性的长的长链状化合物，多核苷酸链状化合物，多核苷酸链的两端，一端称为链的两端，一端称为5-端，另一端称为端，另一端称为3-端。端。5端3端CGAhttp:/ 上上2）测序引物）测序引物1条条3）告知公司用的哪种质粒，正向还是方向测？）告知公司用的哪种质粒，正向还是方向测？1）靠近测序引物的）靠近测序引物的20-30bp序列不一定正确序列不一定正确2）大于）大于500bp如何测定？如何测定？3）大于）大于1000bp如何测定？如何测定？注意点：注意点：PCR产物测序产物测序dsDNAssDNAmRNAcDNA