分子生物学-蛋白检测技术课件.ppt

1、蛋白的检测技术蛋白的检测技术 (1)SDS-PAGE (2)Western blot (3)ELISA (4)蛋白芯片蛋白芯片 (5)蛋白测序蛋白测序(略略)(6)双向电泳双向电泳-新基因的获取技术新基因的获取技术 (7)蛋白质磷酸化分析蛋白质磷酸化分析1、SDS-PAGE 电泳电泳1、原理2、用途SDS：阴离子去污剂阴离子去污剂 变性剂变性剂氨基酸侧链与氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。胶束。蛋白质蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不量，消除了不 同分子之间

2、原有的电荷差异。同分子之间原有的电荷差异。与与强还原剂强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。性化。q 不连续的电泳缓冲体系。上层为上层为浓缩胶浓缩胶,可将样品压缩可将样品压缩到同一起跑线到同一起跑线,下层为下层为分离胶分离胶,可获得更高的分辨率可获得更高的分辨率.q SDS蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶成分凝胶成分M丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺 MSDSM配胶的Tris缓冲液MTEMEDM过硫酸铵MTris-甘氨酸电泳缓冲液Staking

3、gelSeparating gelSDS-PAGE 电泳用途电泳用途1.蛋白分子量的测定蛋白分子量的测定2.蛋白浓度的测定蛋白浓度的测定3.蛋白的鉴定蛋白的鉴定(通过通过1来实现来实现)2、Western blot名称名称检测对象检测对象探针探针检测原理检测原理处理过程处理过程用途用途Southern blotDNA标记单链核标记单链核酸酸核酸复性中核酸复性中碱基配对专碱基配对专一性一性琼脂糖电泳琼脂糖电泳后转膜后转膜基因检测基因检测（拷贝数）（拷贝数）Northern blotRNA标记单链核标记单链核酸酸核酸复性中核酸复性中碱基配对专碱基配对专一性一性变性琼脂糖变性琼脂糖电泳后转膜电泳后转

4、膜基因表达的基因表达的检测（表达检测（表达量）量）Western blot蛋白蛋白抗体抗体抗原抗体抗原抗体特异性结合特异性结合SDS-PAGE后转膜后转膜基因表达产基因表达产物物蛋白蛋白的检测的检测Western Blotting 方法一:直接法 优点：1.快速（一种抗体）2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带 缺点：1.免疫反应性降低 2.无信号二级放大 3.抗体标记费时昂贵,使用不方便Western Blotting 方法二:间接法 优点：1.免疫特异性不受标记影响 2.信号放大灵敏度高（多个二抗结合位点）3.多种标记的二抗可供选择 4.可选择不同的Marker 缺点：1.交叉反应引起的非

5、特异性条带 2.额外的二抗孵育以及条件优化间接Western Blotting操作流程:Western blot 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳l转膜l封闭l一抗杂交l二抗杂交l底物显色不可小看不可小看“蛋白标准蛋白标准”-分子量标准的选择 预混分子量标准预混分子量标准 高分子量标准高分子量标准 低分子量标准低分子量标准 宽分子量标准宽分子量标准 预染分子量标准预染分子量标准 单色预染单色预染 多色预染多色预染 修饰分子量标准修饰分子量标准预混分子量标准预混分子量标准 高分子量标准高分子量标准 低分子量标准低分子量标准 宽分子量标准宽分子量标准预染分子量标准预染分子量标准 单色预染

6、单色预染 多色预染多色预染不可不加不可不加-内参的选择内参的选择 原因：校正蛋白质定量、上原因：校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差样过程中存在的实验误差 种类：种类：GAPDH、beta-actin、beta-tubulin 用法：用法：二抗孵育时加入二抗孵育时加入HRP标记内参标记内参抗体抗体 分子量相差不大分子量相差不大 分子量大小相差比较明显分子量大小相差比较明显 即酶联免疫吸附测定法即酶联免疫吸附测定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)3.ELISA胶体金免疫层析技术胶体金免疫层析技术（colloidal gold immunoch

7、romatography assay,GICA）胶体金颗粒对蛋白质有很强的吸附功能，而不被坏其生物活性，可以与蛋白质等（葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白）等非共价结合，形成胶体金标记物。衬板样品垫金标垫吸收垫膜胶体金免疫层析试纸条的构成夹心法反应原理夹心法反应原理C 阴性B 阳性GICA有三种反应模式：夹心法，间接法，竞争抑制法。测定尿液标本中的测定尿液标本中的HCG。检测时，当被检尿样虹吸通过胶体金标记抗体时，形成抗原抗体胶体金复检测时，当被检尿样虹吸通过胶体金标记抗体时，形成抗原抗体胶体金复合物，复合物继续爬行，通过包被的抗合物，复合物继续爬行，通过包被的抗-HCG亚基亚基Mcab时，形成双抗体

8、时，形成双抗体夹心胶体金复合物，在包被线处呈现色带，过量的胶体金抗体继续爬行，夹心胶体金复合物，在包被线处呈现色带，过量的胶体金抗体继续爬行，和羊抗鼠对照线形成胶体金免疫复合物，呈现色带。和羊抗鼠对照线形成胶体金免疫复合物，呈现色带。早早孕早早孕4、蛋白芯片、蛋白芯片6、双向电泳、双向电泳 双向电泳双向电泳是蛋白质组学中对蛋白质组进行研究的主要分是蛋白质组学中对蛋白质组进行研究的主要分离方法，同时能分离成百上千种蛋白质。离方法，同时能分离成百上千种蛋白质。蛋白质在蛋白质在第一向第一向根据根据电荷电荷的不同（等电聚焦），的不同（等电聚焦），第二向第二向根据根据分子量分子量的不同进行分离（的不同进

9、行分离（SDS-PAGE）。分离后对）。分离后对蛋白质进行染色，根据实际分析情况，分别进行考马斯蛋白质进行染色，根据实际分析情况，分别进行考马斯亮兰染色、银染或荧光染色。扫描后用相关软件亮兰染色、银染或荧光染色。扫描后用相关软件（PDQUEST等）进行图谱分析，分析差别点等。双向等）进行图谱分析，分析差别点等。双向电泳与质谱技术联用，还可以进一步分析差别点蛋白的电泳与质谱技术联用，还可以进一步分析差别点蛋白的特性。特性。等电聚焦电泳等电聚焦电泳双向电泳双向电泳7、蛋白质磷酸化分析、蛋白质磷酸化分析 蛋白磷酸化是一种重要的细胞信号调控方式蛋白磷酸化是一种重要的细胞信号调控方式 一般在丝氨酸一般在丝氨酸,苏氨酸和酪氨酸上磷酸化苏氨酸和酪氨酸上磷酸化.蛋白激酶蛋白激酶-磷酸化磷酸化;蛋白质磷酸酯酶蛋白质磷酸酯酶-去磷酸化去磷酸化.A.一般通过双向电泳和质谱分析一般通过双向电泳和质谱分析.B.也可通过磷酸化抗体也可通过磷酸化抗体Western blot检测检测