创新药物学-特殊毒性评价课件.pptx

1、第一节：特殊毒性评价的目的和意义第二节：评价原则第三节：内容和步骤第四节：致突变试验第五节：生殖毒性试验第六节：致癌试验第七节：其他特殊毒性试验特殊毒性评价毒理学一般毒性评价急性毒性长期毒性局部毒性特殊毒性评价遗传毒性致癌性生殖毒性依赖性特殊毒性：主要包括遗传毒性、致癌毒性和生殖毒性等，是新药安全性评价的主要内容之一，同时也是临床前研究与评价中的重要内容之一。特殊毒性研究就是研究对遗传物质是否有损伤，是否会引起肿瘤衰老及畸胎等。特殊毒性试验存在着种属差异性、定性差异、定量差异等。特殊毒性研究的意义：可减少或避免致癌毒性、遗传毒性和生殖毒性的产生和发展。第二节 评价原则一、应遵循试验研究管理规范

2、药物的遗传、生殖和致癌毒性试验属于安全性评价研究，根据中华人民共和国药品管理法的规定，必须执行药物非临床研究质量管理规范二、具体问题具体分析原则特殊毒性试验的设计应该在对受试物认知的基础上，遵循具体问题具体分析的原则。根据药物的理化性质、已有的药理毒理研究信息、适应症和适用人群特点，临床用药方案选择合理的试验方法，设计适宜的试验方案，并综合上述信息对试验就过进行全面的分析第三节 内容和步骤一、内容一、内容按照新药审评的基本要求，特殊毒性的评价包括以下内容：（一）遗传毒性（致突变）试验微生物回复突变试验、哺乳动物培养细胞染色体畸变试验和整体试验（常选用微核试验）。作用于生殖系统的药物，需进行动物

3、显性致死试验（二）致癌试验所有新化合物都必须进行致癌试验，并要与已知致癌化合物进行比较研究，包括短期致癌试验和长期致癌试验（三）生殖毒性（致畸）试验在动物生殖过程中的不同阶段给予受试物，观察其对受试动物生殖能力及其子代发育的影响二、步骤药物特殊毒性的评价是一个长期、细致的过程，不仅在新药上市前需进行必要的临床前动物实验，而且上市后还需经临床的观察。实验室、临床，反复印证，多次循环，才能使药物的毒性获得比较正确的评价。特殊毒性实验的步骤一般包括以下几个方面：（一）实验条件的遵循根据中华人民共和国药品管理法的规定，毒性试验研究必须执行药物非临床研究质量管理规范。（二）受试物的选择受试物应能充分代表

4、临床试验样品和上市药品。一般用中试或中试以上规模的样品，并注明其名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及调配方法等。外用药物和注射剂一般以制剂作为受试物。（三）动物分组和剂量设计实验组的组数及每组动物数的设定，应以能够科学合理的解释所获得的实验结果，恰当地反应有生物学意义的作用，并符合统计学要求为原则。一般可设三个剂量组，同时应考虑采用合理的空白或阴性对照。必要时还应设阳性对照。小动物每组一般不少于10只，大动物每组一般不少于6只。动物一般要求雌雄各半。选择剂量时，要参考其他毒性试验的结果，还要参考拟推荐临床适用剂量和国外同类药物的毒性剂量综合进行。（四）给药途径整体动物实验，首先应考虑与

5、临床拟用给药途径一致。如果有多个临床拟用途径时，分别采用相应的给药途径。对于在动物实验中难以实施的特殊给药途径，可根据受试物的特点选择，并说明理由。（五）给药频率和期限根据特殊毒性的实验特点，选择适宜的给药频率和期限，应根据具体情况合理设计给药次数（六）检测指标的合理确定根据特殊毒性试验要求，合理确定检测指标。（七）实验结果分析和综合评价根据详细的实验记录，对数据进行定性和定量分析，并选用合适的统计方法。根据统计结果，并结合个体数据和其他安全性试验、有效性试验结果，对其进行综合评价。（八）资料整理应规范新药的特殊毒性研究就是要保证临床用药的安全性。试验完成后，要严格按照试验目的和意义、基本原则

6、、基本内容和要求、数据统计及可行性分析、试验中注意的问题等内容进行资料整理。第四节 致突变实验 致突变实验，亦为遗传毒性试验，可分为体外和体内实验。体外遗传毒理实验方法包括鼠伤寒沙门菌诱变性实验、体外哺乳动物细胞染色体畸变实验、姐妹染色单体交换实验、SOS显色实验体内实验包括动物体内骨髓细胞微核试验、哺乳动物骨髓细胞染色体畸变实验、显色致死实验和小鼠睾丸染色体畸变实验。但没有任何单一实验方法能检测出所有的遗传毒性物质。因此，通常采用体外和体内遗传毒性实验标准组合方法，即体外实验和体内实验相结合、真核细胞与原核细胞相结合等，以减少遗传毒性药物的假阴性结果。这些实验相互补充，既可以提高遗传物质的检

7、测能力，又为综合考虑实验结果奠定基础。一：鼠伤寒沙门菌回复突变实验二：体外哺乳动物细胞染色体畸变实验三：SOS显色实验四：动物体内骨髓细胞微核试验五：显性致死实验一、鼠伤寒沙门菌回复突变实验一、鼠伤寒沙门菌回复突变实验该实验是鼠伤寒沙门菌组氨酸营养缺陷型回复突变实验的简称，又称Ames实验。（一）试验原理 本实验采用鼠伤寒沙门菌组氨酸缺陷突变株作为指示微生物，检测药物的致突变性。人工诱导的鼠伤寒沙门菌突变株在其组氨酸操纵子中有一个突变，突变菌株必须依赖外源性组氨酸才能生长，而在无组氨酸的选择性培养基上不能存活，诱导剂可使其基因发生回复突变，使它在缺乏组氨酸的培养基上也能生长。计数诱发的回变菌落

8、数即可判断药物的诱变能力。（二）培养基制备1.营养肉汤 营养肉汤用于在液体条件增值培养细菌。以获得用于实验的细菌培养液。成分 牛肉浸膏 5g 蛋白胨 10g NaCl 5g 置烧瓶内加三重蒸馏水1000ml，依次加入上述成分，加热助溶。特别注意等一种成分溶解后，再加另一种成分，待完全溶解后，冷却至室温（1530），用1mol/L NaOH调整PH为7.07.2。分装于试管内，封口，高压灭菌后，置4冰箱放置备用。注意保存不得超过6个月。2.营养琼脂培养基 用于分离、鉴定菌种及制作斜面保存菌种。成分 营养肉汤 琼脂 2g 三重蒸馏水 100g 将上述配料置入试验容器中，加热溶解琼脂，经高压灭菌20

9、分钟，冷至70左右，倒入平皿，每皿25ml左右。3.上层培养基 0.5mmol/L氢氯组氨酸/生物素混合液：称取L-氢氯组氨酸（分子质量：209.63Da）10.48mg，放入100ml容量瓶中。取D-生物素（分子质量：244.31Da）12.216mg加入一烧杯中，放入20ml三重蒸馏水，加热煮沸至生物素完全溶解后，移入容量瓶内。并溶解组氨酸，反复冲洗盛生物素的烧杯34次，依次移入容量瓶中，最后用双蒸水将溶液体积补至100ml，混匀后，4冰箱保存备用。成分 琼脂粉 0.6g NaCl 0.5g 0,5mmol/L氢氯组氨酸/生物素混合液 10ml 三重蒸馏水 补至100ml 上述成分依次加入

10、三角烧瓶中，棉塞封口，高压灭菌15分钟，备用。4.底层基本培养基 成分 VB液（10）50ml 葡萄糖水溶液（20%）50ml 琼脂 7.5g 取VB液（10）50ml，加入三重蒸馏水400ml,用1mol/LNaOH调整ph为7.0。然后加入琼脂7.5g，高压灭菌20分钟后，待冷至80左右时，趁热加入20葡萄糖50ml,用两个500ml三角烧瓶来回混匀4-5次，浇制平板。5.两种富含组氨酸的主平板 制备底层培养基后，冷却至50，加入不同成分，混匀，倒入平皿内，冷后可制得主平板。（三）测定步骤1.选择菌株 2.细胞培养 3.冷冻保存4.主平板保存 5.斜面保存 6.菌株的分离培养7.实验菌株的

11、鉴定 8.诱变性实验（四）受试验所诱发的回变菌落数增加为自发对照的2倍或以上，并有剂量效应关系。或每测试点（菌落数）为自发对照的2倍或以上，呈现可重复的并有统计学意义的增加。符合上述一条即可判为阳性。二：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验二：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验（一）原理 在细胞分裂的中期进行染色体畸变的观察和分析。为收集足够的中期细胞相，在收获细胞前，用秋水仙碱或乙酰甲基秋水仙碱处理，以阻断微管蛋白的聚合，抑制细胞分裂时纺锤体的形成。使分裂间期和前期的细胞停留在中期相。低渗处理细胞，使染色体均匀散开，然后固定、染色，可在油镜下观察。（二）测定步骤 1.细胞 常选用中国仓鼠CHL细胞株，

12、需定期检查核型及是否有支原体污染等。-80或液氮保存。2.浓度设置 至少设3个浓度组。高浓度以40%细胞生长抑制为基准，中、低浓度组可采用倍量稀释法，最低浓度不得小于有效浓度。3.代谢活化 采用药酶诱导剂处理后的哺乳动物肝微粒体酶（S9）进行体外代谢活化实验，即在加S9mix和不加S9mix平行的条件下测试。4.药物作用时间 在非代谢活化条件下，药物和细胞分别作用24小时和48小时收获细胞；而在代谢活化条件下，药物和细胞接触至少6小时以上。5.对照 每批实验必须设空白对照、溶剂对照、阳性对照和S9平行对照。6.收获时间 在第一次实验，细胞应在有和无代谢活化条件下染毒36小时，并在染毒开始后约1

13、.5倍的正常周期时采样。7.染色体制备 在收获前以秋水仙素或秋水仙碱处理细胞培养物24小时。8.染色体分析（1）染色体数目畸变：非整倍体、多倍体 （2）染色体结果异常（三）结果评定三：三：SOS显色实验显色实验（一）原理 遗传毒物损伤细菌DNA会诱发一系列表现，包括修复增加、诱导活性增高、原噬菌体诱导以及细胞分裂中止，这些功能统称为SOS应答，它由细胞染色体上基因的SOS调节网络调控。(二)操作步骤1.SOS比色实验（定量实验）2.-半乳糖苷酶测定3.碱性磷酸酶（AP）测定4.对照5.酶活性测定与计算 酶活性=1000A420/t6.判断标准 如果一个化合物实验结果满足下列条件，就可以认为对大

14、肠埃希菌SOS修复系统具有诱导性。诱导因子大于1.5；-半乳糖苷酶活性比试剂对照组显著增高；受试物浓度与诱导因子之间存在剂量反应关系；结果具有重复性。四：动物体内骨髓细胞微核试验四：动物体内骨髓细胞微核试验（一）原理微核实验是用于染色体损伤和干扰细胞有丝分裂的化学毒物的快速检测方法。一般认为微核是细胞内染色体断裂或纺锤体受影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质。所以，微核实验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。（二）实验动物小鼠是微核实验的常用动物，也可用大鼠。通常用712周龄，体重2530g的小鼠或体重为150200g的大鼠。每组用两

15、种性别的动物至少各5只或每组雄小鼠不少于6只。（三）剂量及分组受试物应设三个剂量组，高剂量组原则上以1/2LD50为基准，分别取1/4LD50和1/8LD50作为中、低剂量组，亦可参照药物的ED50，或临床拟用剂量来设计。（四）操作步骤1.受试物配制 2.实验动物的处理3.标本制备 4.阅片（五）结果评价 实验组与对照组相比，实验结果微核率有明显的剂量关系并有统计学意义时，即可确认为阳性结果。若统计学上差异有显著性，但无剂量反应关系时，则需进行重复实验。结果能重复者可确定为阳性。五：显性致死实验五：显性致死实验（一）原理发育中的精子或卵子受药物作用后可发生染色体损伤，使受精卵在发育过程中死亡，

16、引起显性致死的染色体损伤主要包括单纯的染色体断裂或具有重组的染色体断裂。有的染色体损伤的卵裂球可形成畸形的桑葚胚或胚芽，由于受损程度不同，有的在到达子宫前死亡，有的在子宫着床后不久死亡。因此，显性致死的主要观察指标是受孕、植入前丢失和胚胎早期死亡。（二）动物与分组1.实验动物 要求用810周龄、体重3035g的小鼠或200g以上的大鼠。需3050只雄鼠、500600只未交配的雌鼠。2.剂量和分组 一般设三个实验剂量组，一个阳性对照组和一个阴性对照组。每组10只雄鼠。实验中高剂量为最大耐受剂量（MTD）(三)操作步骤1.给药与交配 可采用腹腔注射、灌胃、吸入等给药途径。当天开始交配，用1只雄鼠与

17、23只雌鼠同笼，每6天更换雌鼠，1天后让雄鼠与第二批雌鼠交配，如此进行56批。2.观察结果 将雌鼠于开笼的第17天脱臼处死，剖腹检查。3.数据统计分析（四）注意事项1.动物 雌性动物应选择健康、成年未生育过的动物。每组每周至少有20只受孕母鼠的要求。2.剂量 剂量太小，不易获得阳性结果；剂量太大，会使动物死亡或降低雄鼠的交配能力。可通过预实验选择合剂量。3.条件 应满足SPF级饲养条件。本实验最好在春、秋季进行，以提高动物交配受孕率。第五节第五节 生殖毒性试验生殖毒性试验一般生殖毒性试验致畸敏感期试验围生期试验生殖毒性试验（一）实验目的：检测受试物与动物接触后，对动物的性腺功能、交配能力等的影

18、响。（二）动物及剂量选择：一般选择大鼠或小鼠，也可选用家兔。一.一般生殖毒性试验（三）剂量设计一般设3个剂量，另设空白对照组，受试物中含有溶剂时有时需要设溶剂对照组，以检验溶剂对动物生殖的影响，为了更确切地说明试验结果必要时设阳性对照组。每组雌雄各20只以上动物，雌性动物可多一些，以保障有一定的子代数量，顺利完成子代的试验。（四）给药及给药周期给药期应充分考虑生殖细胞发育的过程，最少应给予一个生殖细胞的发育周期，雌性动物至少两个性周期。雄性小、大鼠一般在出生后3540天开始给药，给药后6080天后开始交配，雌性动物应给药两周后开始交配，并继续给药至多数器官形成，一般为妊娠后6天。（五）试验过程

19、将大鼠或小鼠按雌、雄2:1或1:1的比例，每天下午45点以后同笼自然交配，为了提高受精的成功率，可以对雌性动物进行动情期诱导，将一只雄鼠与雌鼠同笼隔离，同笼隔离生活两天，然后再交配，以使雌鼠发情期一致。为了增加受孕成功率，也可做阴道分泌物涂片检查，以保证雌鼠在动情期进行交配。家兔妊娠一般依靠子宫触摸来确定，多在妊娠后十几天才能确定，但在确定之前就要分组给药。（六）药后观察每日观察亲代动物的生存情况，包括精神、行为、活动，观察动物的可视黏膜、皮毛等，特别注意观察妊娠动物有无流产，定期称量动物的体重，称量动物的饮食，测量动物的饮水。雄兔交配完成后处死，去附睾精子进行精子计数、精子活动能力检查。计算

20、附睾、睾丸重量及系数，睾丸进行组织学检查，重点观察曲细精管内精子的发育过程。记录仔鼠出生24小时的死、活仔鼠数，仔鼠体重，性别，观察性别及外观畸形，部分仔鼠可进行胎儿形态学检查，包括内脏和骨骼检查。（七）结果及统计合理的试验设计能在该试验中得到大量的药物与动物机体作用的信息，包括母体反应、交配情况、受孕情况、子代生长发育情况。（一）实验目的检测妊娠动物在胚胎器官形成期接触受试物，受试物对胚胎发育的影响。（二）动物及给药剂量可选用大鼠、小鼠、和家兔来进行，一般选择小鼠。受试物一般设3个剂量组，另设一空白对照组。（三）给药方法胚胎对药物的敏感性因不同种动物胚胎的发育阶段而异，应选择在器官形成期。二

21、二.致畸敏感期试验致畸敏感期试验（四）观察指标1.母鼠 观察记录母鼠的精神、行为、饮食、体重，注意观察有无流产等。2.仔体 计数胚胎数量、性别，记录仔体重量，进行外观检查，记录有无血肿，头部有无异常等。（五）骨骼检查进行外观检查后随机抽取1/2胎鼠进行骨骼检查，将胎鼠置入75%乙醇中固定2天，再在氢氧化钾溶液中透明，经茜素红染色后进行骨骼检查。（六）仔体内部脏器检查进行外观检查后随机抽取1/2胎鼠进行头部及内部脏器检查，将胎鼠在Bouin液中固定，胸腔脏器可在非固定胎鼠上进行检查；其余脏器在固定后的胎鼠上检查。（七）结果及统计应记录交配率、剖检母体动物数、孕期母体增重等。通过统计，最后确定受试

22、物是否有致畸作用时还要考虑剂量关系，本实验室该种动物正常畸胎率和畸形率等。（一）实验目的在母体怀孕胚胎器官形成期后给药，主要观察胎儿在母体内发育情况、胎儿出生后发育情况、母体分娩情况、带乳情况等。（二）动物及给药剂量基本原则同致畸敏感期实验。（三）给药方法大鼠一般在妊娠后的15天开始给药，直至分娩后的第28天。小鼠则在妊娠后的15天开始，至分娩后21天。家兔在妊娠后22天开始，至分娩后的31天。三.围生期试验（四）药后观察1、一般观察 2.仔鼠 出生后24小时计算死、活仔鼠数，仔鼠体重，性别等。3.下一代断乳前发育情况4.观察子代肢体反射的出现5.下一代断乳后运动和学习能力的测定6.下一代生殖

23、行为试验（五）结果及统计记录母鼠体重、饮水、食料量、产仔数、仔鼠存活率等，对仔鼠的生理发育、断乳后的行为能力、学习能力作综合性评价。第六节第六节 致癌试验致癌试验致癌试验的研究，也是药物安全性评价的重要方面。外源性化学物致癌性的评价方法与模型，大致可分为：1、短期致突变性和致癌性筛选实验2、体外转化实验3、促癌剂与共致癌剂评价4、有限致癌实验5、转基因动物模型6、长期致癌实验（一）基本原理体外细胞转化以致癌物诱发细胞核型改变为内因，细胞的恶性转化为检测终点，在此过程中发生细胞形态、细胞生长能力、生化表型及动物体内成瘤能力的改变。一般认为，相对于体内致癌作用来说，细胞转化实验比其他短期测试更加可

24、靠。由于对转化集落形态的判定存在主观误差，因此在形态表型转化实验之后，应结合染色体数目和结构、细胞生长能力、动物体内成瘤能力等的变化进行分析，以动物接种致瘤实验结果最为可靠。一、叙利亚地鼠胚胎细胞体外恶性转化试验所以，细胞体外恶性转化试验观察受试物与细胞接触后，导致细胞恶性转化的危险，观察细胞转化成具有肿瘤细胞性质的突变细胞。该试验可检测遗传性致癌物和非遗传性致癌物，直接反映体外对受试细胞的致癌作用。（二）叙利亚地鼠胚胎细胞制备孕后1214天叙利亚地鼠，打击头部致死，酒精消毒，无菌条件下分离子宫，取出胎鼠，去除四肢、头、内脏，洗净，将躯干剪成1mm3的小块，用胰蛋白酶消化，过尼龙网去除残渣，滤

25、过液体离心，弃去上清液，沉淀物中加入细胞培养液，调整细胞浓度，培养3天后收获细胞，对收获的细胞进行转化的敏感性试验，对已知阳性物转化试验符合要求的细胞用液氮冻存，备用。（三）细胞转化培养冻存的细胞进行复苏培养，将冻存细胞进行滋养层细胞培养和靶细胞培养，培养24小时后可细胞染毒，进行细胞转化试验。受试物的剂量可根据受试物对细胞的毒性来确定，一般以引起半数细胞死亡的剂量（浓度）作为最高剂量，并依次半量递减，试验一般设57个浓度。在有些情况下，剂量可不依此设计，如受试物受溶解度（包括使用无细胞转化作用的助溶剂）的限制，有时达不到半数细胞死亡的浓度。还有一些低细胞毒的物质，在明显高于临床可能接触剂量的

26、情况下，也可达不到半数细胞死亡的浓度。（四）观察报告将细胞固定、染色、分别计算集落形成率和转化率公式如下：集落形成率（%）=（集落数/接种细胞数）100%集落转化率（%）=（转化集落数/集落数）100%（五）判定1、有明确的剂量效应；2、若无剂量效应，但在2个或2个以上的浓度中发生细胞转化；3、在单一剂量下出现3个或3个以上的转化集落时。符合上述任一条件者可判为阳性，否则为阴性。如判定有困难时，应进一步对细胞进行核型分析、软琼脂接种等观察判定，必要时可做动物接种生瘤试验。二、啮齿类致癌实验二、啮齿类致癌实验（一）基本原理啮齿类致癌实验（RCB）是在受试物的结构活性关系、多种体外致突变实验与短期

27、动物致癌实验等多种实验的基础上进行的致癌实验，是判断化学物是否是动物致癌物的唯一依据。RCB基本实验步骤为：每日经一定途径给各个组动物一定剂量的受试物，接触期为动物预期寿命的大部分时间。接触期间每天观察各种症状并间隔一定时间称量体重和做必要的实验检查。实验结束时处死动物，进行大体解剖及适当的组织病理学检查观察其肿瘤发生情况。（二）实验设计1、实验人员及其职责 在开展RCB之前，毒理学家、实验动物专家、病检人员、统计人员、化学分析人员应密切合作，详细收集相关的实验资料，并撰写相应的实验方案。2、受试物（1）需进行RCB的药物：RCB耗时耗力，仅仅当人体的药物接触情况需要得到动物终身研究的资料以评

28、价其潜在致癌性时，才应进行致癌实验。确定某一新药是否需要进展长期致癌实验应考虑多个因素：用药期限及接触量相关因素 a.该类产品事先说明有与人相关的致癌性；b.构效关系提示其致癌可能性；c.重复给药毒性实验中有癌前瘤变证据；d.在组织中长期滞留，并导致局部组织反应或其他病理改变。遗传毒性适应症全身接触程度生物技术药物其他因素 预期的患者群，临床给药方案，动物与个体的药效学资料，重复给药毒性资料。（2）受试物必备资料（3）剂量水平（4）染毒途径：经皮、经口、吸入。3、实验动物（1）RCB的动物种属与品系（2）药物致癌实验的基本方案（3）动物性别与数量（4）实验开始时的动物年龄与染毒持续时间4、实验

29、动物的饲养5、临床观察与检查：至少要每天1次逐个检查每组动物，详细记录毒性产生的日期与表现，特别注意动物身体各部位肿物产生情况，详细记录出现肿物的部位与日期、大小及生长情况。6、病理学检查（1）大体解剖（2）病理组织学检查（三）实验的实施整个实验分为：前期计划阶段实验启动阶段活体实验阶段研究的完成阶段实验结果的汇总与统计分析（四）实验结果的评价根据各组肿瘤发生率、潜伏期和多发性等作出全面的科学评价，并提出判断为阳性或阴性结果的充分数据与分析。第七节 其他特殊毒性试验药物依赖性生理依赖性精神依赖性一.药物的生理依赖性试验（一）自然戒断试验自然戒断实验实验周期长。包括以下内容：1.动物2.剂量3.

30、给药途径4.给药期限5.观察动物反应的指标（二）催促实验催促实验戒断症状发作快、症状重且典型、持续时间短且省时、便于观察比较。内容包括：1.动物2.剂量3.给药途径4.给药期限5.观察指标二.药物的精神依赖性试验与生理依赖性实验评价相比，精神依赖性的影响因素很多，也增加了评价的难度。基本情况：（一）原理本试验模拟人的行为，通过压杆方式来获得药物，反映药物的强化效应，可信度较高且可进行定量比较。（二）实验方法常用大鼠和猴。试验过程中注意保持套管畅通。（三）结果评价通过观察是否形成自身给药行为来判断药物是否具有强化效应。本实验也可同时进行替代试验。通过更换受试药的剂量，比较他们在等效ED50 倍数剂量条件下的踏板次数，即可反映受试药的精神依赖性的强度。