呼吸系统疾病Diseasesoftherespiratorysystem课件.ppt

1、免疫组化基本技术免疫组化基本技术 倪倪 灿灿 荣荣第一部分第一部分 组织与细胞材料的制备组织与细胞材料的制备内容：组织与细胞材料内容：组织与细胞材料 的取材和保存的取材和保存主要内容主要内容一、人体组织标本的取材一、人体组织标本的取材二、动物组织标本的取材二、动物组织标本的取材三、取材注意事项三、取材注意事项四、细胞标本的准备四、细胞标本的准备五、组织的固定、脱水、透明和包埋五、组织的固定、脱水、透明和包埋六、切片六、切片七、组织与细胞材料的保存七、组织与细胞材料的保存 概概 述述 免疫组织化学（免疫组织化学（Immunohistochemistry;IHC）技术是一门综合性技术，除了具备技术

2、是一门综合性技术，除了具备优质、高效，特异的一抗，敏感的检测方法，优质、高效，特异的一抗，敏感的检测方法，稳定的显示系统外，还需要掌握组织标本或稳定的显示系统外，还需要掌握组织标本或标本的取材、固定、包埋、切片，以及标本的取材、固定、包埋、切片，以及IHC前的处理，内源性酶的消除方法，非特异背前的处理，内源性酶的消除方法，非特异背景的消除方法，怎样防止景的消除方法，怎样防止IHC染色过程中的染色过程中的脱片。脱片。一、人体组织标本的取材一、人体组织标本的取材 手术切除标本，各种活检穿刺手术切除标本，各种活检穿刺标本和尸体解剖标本。标本和尸体解剖标本。1.1.手术切除标本的取材：手术切除标本的取

3、材：抗原在组织中的分布常不均一，取材抗原在组织中的分布常不均一，取材时应考虑：主要病灶，病灶与正常组织交时应考虑：主要病灶，病灶与正常组织交界处，远离病灶的正常组织。界处，远离病灶的正常组织。组织大小：组织大小：长长1cm宽宽1cm厚厚0.20.3cm。2.2.各种小组织的活检取材：各种小组织的活检取材：它不仅体积小，取材困难，不易取到它不仅体积小，取材困难，不易取到主要病灶，因此对标本的处理应特别慎重，主要病灶，因此对标本的处理应特别慎重，及时固定，包埋时要平整。及时固定，包埋时要平整。3.3.穿刺标本的取材：穿刺标本的取材：光镜（光镜（HEHE、特殊染色、特殊染色、IHCIHC、ISHIS

4、H）电镜（透射电镜、免疫电镜）电镜（透射电镜、免疫电镜）4.4.尸检组织的取材尸检组织的取材 病人死亡后，一般要在数小时后才能病人死亡后，一般要在数小时后才能做尸检，因此，及时取材，尽早固定是开做尸检，因此，及时取材，尽早固定是开展展IHC检测的关键。检测的关键。二、动物组织标本的取材二、动物组织标本的取材 动物的处死方式一般为活杀，组织标动物的处死方式一般为活杀，组织标本来源较新鲜，本来源较新鲜，10min内即可完成固定和冷内即可完成固定和冷冻保存，脑组织和神经组织应采用灌注固冻保存，脑组织和神经组织应采用灌注固定后，再进行后固定。定后，再进行后固定。动物处死方法：动物处死方法：1.麻醉法麻

5、醉法 乙醚或乙醚或4戊巴比妥静注戊巴比妥静注 2.空气栓塞法空气栓塞法 3.断头法断头法 4.击头法击头法 5.股动脉放血法股动脉放血法三、组织取材注意事项三、组织取材注意事项 1.组织要求离体后组织要求离体后30min内浸入固定液，内浸入固定液，尤其是开展分子生物学工作。动物组织取尤其是开展分子生物学工作。动物组织取材要求心脏还在跳动时取材。材要求心脏还在跳动时取材。2.注意防止人为因素的影响注意防止人为因素的影响 刀和剪要快，刀要足够长。刀和剪要快，刀要足够长。3.组织块的大小组织块的大小 厚为厚为0.10.10.3cm0.3cm，大小可根据需要而定，大小可根据需要而定4.动物和人体组织的

6、取材位置动物和人体组织的取材位置 要视研究目的，观察部位而定要视研究目的，观察部位而定5.取材时间取材时间 原则上，应尽快取材，但比较大的手原则上，应尽快取材，但比较大的手术标本如胃、肺、肠等器官，最好先固定术标本如胃、肺、肠等器官，最好先固定后取材。后取材。6.注意包埋方向注意包埋方向 7.边缘标记边缘标记 8.保持材料的清洁保持材料的清洁 9.切除不需要的部分切除不需要的部分10.明确编号，登记明确编号，登记11.骨组织还需脱钙骨组织还需脱钙四、细胞材料的准备四、细胞材料的准备 细胞的取材和制片法：细胞的取材和制片法：1.印片法：印片法：常用于活检或手术切除标本。常用于活检或手术切除标本。

7、将新鲜标本沿病灶中心剖开，将病灶区轻将新鲜标本沿病灶中心剖开，将病灶区轻压于载玻片上，吹干后立即固定压于载玻片上，吹干后立即固定20203030minmin。优点：优点：操作简单，抗原保存好操作简单，抗原保存好缺点：缺点：细胞厚薄不均，细胞厚薄不均，IHC染色易引起背染色易引起背 景染色。景染色。2.穿刺吸取法穿刺吸取法 3.沉淀法沉淀法 主要用于胸水、腹水、尿主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多而细胞较少的标本。液、脑脊液等体液多而细胞较少的标本。（1 1）常规细胞玻片制片法）常规细胞玻片制片法 （2 2）单核细胞分离法）单核细胞分离法3.3.制备细胞玻片应注意制备细胞玻片应注意 （1

8、1）易脱片；）易脱片；（2 2）细胞应集中在直径）细胞应集中在直径0.60.61.0cm1.0cm的圆圈内，总数的圆圈内，总数10105 5-10-106 6；（3 3）富于粘液的标本，未经处理）富于粘液的标本，未经处理不宜做不宜做IHCIHC。4.活细胞标本的制备法活细胞标本的制备法 培养的活细胞可分贴壁和悬浮二种。贴壁培养的活细胞可分贴壁和悬浮二种。贴壁细胞可将细胞可将 （1 1）细胞大量培养后，经消化将细胞制成）细胞大量培养后，经消化将细胞制成悬液（悬液（10106 6）涂在涂有切片粘合剂的载玻片上，）涂在涂有切片粘合剂的载玻片上，凉干后固定。凉干后固定。（2 2）将细胞直接培养在盖玻片

9、上。）将细胞直接培养在盖玻片上。（3 3）将细胞直接培养在）将细胞直接培养在6 6孔或孔或9 9孔板上，经孔板上，经固定后可行固定后可行IHCIHC。五、组织标本的固定五、组织标本的固定 1.目的目的 (1)(1)防止组织细胞的死后变化，防止自溶防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。和腐败，以保持组织细胞的固有形态。(2)(2)使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。原有的结构与生活时相仿。（3 3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起）使组织中的各

10、种物质沉淀和凝固起 来而产生不同的折射率，造成光学来而产生不同的折射率，造成光学 上的差异，以便染色后易于鉴别和上的差异，以便染色后易于鉴别和 观察。观察。（4 4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制片。增加组织硬度、便于制片。（5 5）防止细胞过度收缩或膨胀而失）防止细胞过度收缩或膨胀而失 去其原有形态结构。去其原有形态结构。（6 6）经过固定的组织能对染料产生）经过固定的组织能对染料产生 不同的亲和力而着色清晰，便不同的亲和力而着色清晰，便 于辨认。于辨认。2.2.固定液的种类固定液的种类 (1)(1)甲醛固定液甲醛固定液 1010福尔马

11、林福尔马林 1010中性福尔马林中性福尔马林 1010中性缓冲福尔马林中性缓冲福尔马林(2)4(2)4多聚甲醛固定液多聚甲醛固定液(3)(3)Bouin Bouin S S液及改良液及改良Bouin Bouin S S液液(4)(4)Zenker Zenker S S液液 重铬酸钾重铬酸钾 25mg25mg 氯化汞氯化汞 10g 10g 冰醋酸冰醋酸 50ml50ml 蒸馏水蒸馏水 800800mlml(5)(5)Zamboni Zamboni S S液液 多聚甲醛多聚甲醛 20g20g 饱和苦味酸饱和苦味酸 150ml150ml PB PB液至液至 1000ml1000ml(6)PLP(6)

12、PLP固定液：过碘酸固定液：过碘酸-赖氨酸赖氨酸-多聚甲醛多聚甲醛固定液。该固定剂较适合于富含糖类组织，固定液。该固定剂较适合于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。(7)PLPD(7)PLPD固定液固定液 取取PLPPLP固定液固定液25ml25ml，加，加 入入2.5%2.5%重铬酸钾重铬酸钾2525mlml。(8)Kanovsky(8)Kanovsky S S液液(9)(9)MethacarnMethacarn固定液固定液 甲醇甲醇60ml60ml，氯仿，氯仿 30ml30ml，醋酸，醋酸10ml10ml，混均后，混均后44保存备保存备

13、 用，对核内抗原的保存效果较好。用，对核内抗原的保存效果较好。(10)PEG(10)PEG液液(11)0.4%(11)0.4%对苯醌对苯醌(12)(12)碳二亚酰胺碳二亚酰胺-戊二醛（戊二醛（ECG-GECG-G）液）液(13)(13)丙酮及醇类固定剂丙酮及醇类固定剂 丙酮、乙醇丙酮、乙醇 类固定剂其固定原理主要是对蛋白类固定剂其固定原理主要是对蛋白 质的沉淀而发生固定作用。质的沉淀而发生固定作用。3.3.固定方法的选择及注意事项固定方法的选择及注意事项 (1)(1)大小大小 2cm2cm2cm2cm0.3cm0.3cm (2)(2)及时固定及时固定(3)(3)固定时间固定时间 固定时间要视组

14、织块的厚固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。(4)(4)组织固定后必须彻底冲洗。组织固定后必须彻底冲洗。六、组织脱水、浸蜡及包埋六、组织脱水、浸蜡及包埋 1.1.目的目的 由于石蜡不溶于水和醇类试剂，只由于石蜡不溶于水和醇类试剂，只溶解在二甲苯类试剂中。因而溶解在二甲苯类试剂中。因而,组织经固定和水洗组织经固定和水洗后含大量水分后含大量水分,需用乙醇类试剂进行脱水需用乙醇类试剂进行脱水,水脱完水

15、脱完后后,组织内含有大量的乙醇组织内含有大量的乙醇,还必须用能溶解乙醇还必须用能溶解乙醇的二甲苯来置换的二甲苯来置换,最后经浸蜡最后经浸蜡,组织细胞内被大量组织细胞内被大量石蜡支称石蜡支称,才使组织能用于石蜡切片。才使组织能用于石蜡切片。2.2.脱水剂的种类：脱水剂的种类：非石蜡溶剂的脱水剂和非石蜡溶剂的脱水剂和脱水兼石蜡溶剂的脱水剂。脱水兼石蜡溶剂的脱水剂。常用的脱水剂常用的脱水剂:(1):(1)乙醇；乙醇；(2)(2)丙酮；丙酮；(3)(3)正丁醇；正丁醇；(4)(4)淑丁醇；淑丁醇；(5)(5)环乙酮；环乙酮；(6)(6)松脂醇；松脂醇；(7)(7)二氧陆环。二氧陆环。3.3.常用的透明

16、剂：常用的透明剂：(1)(1)二甲苯；二甲苯；(2)(2)甲苯；甲苯；(3)(3)苯；苯；(4)(4)香柏油；香柏油；(5)(5)苯甲酸甲酯；苯甲酸甲酯；(6)(6)氯仿；氯仿；(7)(7)冬青油冬青油;(8);(8)苯胺油苯胺油4.4.原则原则 脱水方法甚多，一般需逐级进行脱水方法甚多，一般需逐级进行脱水，否则可引起组织强烈收缩，组织变脱水，否则可引起组织强烈收缩，组织变形。形。在脱水完全的前提下，组织的透明必在脱水完全的前提下，组织的透明必须彻底，但不能过长，否则会引起组织切须彻底，但不能过长，否则会引起组织切片困难。片困难。5.5.常规石蜡包埋过程常规石蜡包埋过程(1)(1)脱水：脱水：

17、7575、8585乙醇，乙醇，9595、乙醇，无水乙醇乙醇，无水乙醇、。(2)(2)透明：二甲苯透明：二甲苯、二甲苯、二甲苯、二甲苯、二甲苯(3)(3)浸蜡：石蜡浸蜡：石蜡、石蜡、石蜡、石蜡、石蜡(4)(4)石蜡包埋：修蜡块，标号石蜡包埋：修蜡块，标号6.6.根据本实验室经验各种不同类型组织根据本实验室经验各种不同类型组织 的石蜡包埋条件的石蜡包埋条件(1)(1)大动物组织大动物组织（狗、兔、小儿尸检）脱（狗、兔、小儿尸检）脱水、透明和浸蜡时间水、透明和浸蜡时间 75 75乙醇乙醇3030120min120min，8585乙醇乙醇3030120min120min，9595乙醇乙醇 2h 2h，

18、9595乙醇乙醇 2h 2h，9595乙醇乙醇过夜，无水乙醇过夜，无水乙醇303060min60min，无水乙醇，无水乙醇303060min60min，无水乙醇无水乙醇60min60min120min120min，二甲苯，二甲苯、和和各各15min15min（可视观察结果而定），（可视观察结果而定），石蜡石蜡30min30min，石蜡，石蜡112h2h，石蜡，石蜡223 3h h。(2)(2)小动物组织脱水、透明和浸蜡时间小动物组织脱水、透明和浸蜡时间 7575乙醇乙醇30min30min，8585乙醇乙醇30min30min，9595乙醇乙醇1h1h，1h1h，过夜或过夜或2h2h，无水乙，

19、无水乙醇醇、和和各各30min30min，二甲苯，二甲苯15min,15min,10min10min，10min10min（肉眼观察），石蜡（肉眼观察），石蜡30min30min，石蜡，石蜡30min30min，石蜡，石蜡112 2h h。(3)(3)活检或手术切除标本的脱水透明和浸活检或手术切除标本的脱水透明和浸 蜡时间蜡时间 7575乙醇乙醇30min30min，8585乙醇乙醇1h1h，9595乙醇乙醇1h1h，1h1h和和4h4h或过夜，无水乙或过夜，无水乙醇醇30min30min，112h2h和和4h4h，二甲苯，二甲苯30min30min，30min30min和和11h h。七、组

20、织切片七、组织切片 切片可分石蜡切片、冰冻切片、火切片可分石蜡切片、冰冻切片、火棉胶切片，棉胶切片，IHCIHC切片要求不同与常规切切片要求不同与常规切片，需连续有序，防止脱片等特殊要求。片，需连续有序，防止脱片等特殊要求。1.1.切片前的准备工作切片前的准备工作(1)(1)载玻片的清洁：载玻片的清洁：市售载玻片需经清市售载玻片需经清洁液泡洁液泡24h24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干涂胶，如需开展原位杂交，还需凉干涂胶，如需开展原位杂交，还需将玻片将玻片240240烤烤2 2h h。(2)(2)切片粘合剂的种类切片粘合剂的种类 多聚赖氨酸（分子量多聚赖氨酸（分子量3

21、00KD300KD）：）：0.5%0.5%浓度。浓度。APESAPES试剂（试剂（3-3-氨基、丙基三氧基硅烷）：干氨基、丙基三氧基硅烷）：干净载玻片净载玻片丙酮丙酮5min APES5min APES（1ml+50ml1ml+50ml丙酮）：丙酮）：用镊子夹住浸入用镊子夹住浸入APESAPES试剂试剂1 13 3次次纯丙酮洗二次纯丙酮洗二次干燥玻片干燥玻片用铝箔包好，室温或用铝箔包好，室温或44保存备用。保存备用。铬矾明胶液：铬矾明胶液：铬矾铬矾0.5g 0.5g 明胶明胶5 5g Hg H2 2O O2 2 1000ml 1000ml甲醛明胶液：甲醛明胶液：4040甲醛甲醛2.5ml 2.

22、5ml 明胶明胶0.50.5g Hg H2 2O O2 2 100ml 100ml2.2.石蜡切片：石蜡切片：3.3.冰冻切片：冰冻切片：IHCIHC冰冻切片，冰冻切片，ISHISH冰冻切片冰冻切片 (恒冷箱冰冻切片机和开放式冰冻切片机恒冷箱冰冻切片机和开放式冰冻切片机)4.4.切片要求及注意事项：切片要求及注意事项：(1)(1)连续切片按序贴在玻片的下连续切片按序贴在玻片的下1/31/3。(2)52(2)526060烤片烤片18h18h。(3)(3)切片厚切片厚2 24 4m m。(4)(4)切片刀要快切片刀要快 (5)(5)编上号编上号 (6)(6)切片可在切片可在44保存数年（石蜡切片）

23、保存数年（石蜡切片）(7)(7)冰冻切片后需凉干后立即固定冰冻切片后需凉干后立即固定(8)(8)冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组 织需经庶糖处理织需经庶糖处理24h24h，冰冻切片。，冰冻切片。(9)(9)冰冻切片固定后冰冻切片固定后-80-80保存备用保存备用八、组织与细胞材料的保存八、组织与细胞材料的保存 1.1.冷冻保存：冷冻保存：-80-80，-145-145，-198-198 组织应在离体组织应在离体30min30min内，快速取材，放内，快速取材，放入专用冷冻管中，并编上号，登记在册。入专用冷冻管中，并编上号，登记在册。2.2.新鲜组织经适当固定后，

24、装入冻存管新鲜组织经适当固定后，装入冻存管 中，中，-80-80冻存。冻存。3.3.蜡块的保存蜡块的保存4.4.活细胞的保存活细胞的保存 可根据需要将细胞直可根据需要将细胞直接培养在盖玻片上，接培养在盖玻片上，9 9孔板上的细胞可孔板上的细胞可经固定后经固定后-80-80保存备用，大容量培养保存备用，大容量培养的细胞收集冻存在液氮中。的细胞收集冻存在液氮中。第二部分第二部分 IHCIHC的一些基本技术的一些基本技术主要内容主要内容一、实验的设计一、实验的设计二、石蜡切片的脱蜡至水二、石蜡切片的脱蜡至水三、内源性酶的消除方法三、内源性酶的消除方法四、四、IHC的非特异性染色的非特异性染色五、抗原

25、的暴露和修复五、抗原的暴露和修复六、抗体的购置及注意事项六、抗体的购置及注意事项七、抗体最佳稀释度的测定和保存七、抗体最佳稀释度的测定和保存 八、显示系统及衬染剂的选择和配制八、显示系统及衬染剂的选择和配制 九、九、IHC常用缓冲液常用缓冲液一、实验的设计一、实验的设计 1.查阅相关文献，列出要做的查阅相关文献，列出要做的IHC指标，根据经费情况，选择相指标，根据经费情况，选择相关公司购置特异性抗体和检测试剂。关公司购置特异性抗体和检测试剂。2.2.列出列出IHCIHC实验操作流程，选择何种实验操作流程，选择何种IHCIHC前前 处理方式。处理方式。3.3.通过预实验寻找第一抗体的最佳稀释度，

26、通过预实验寻找第一抗体的最佳稀释度，应设置何种对照。应设置何种对照。4.每批实验应用同一稀释度的一抗，孵育每批实验应用同一稀释度的一抗，孵育 时间和温度，同一的显色时间。时间和温度，同一的显色时间。5.列出阳性判定的标准列出阳性判定的标准6.预期达到的目标预期达到的目标二、石蜡切片脱蜡至水二、石蜡切片脱蜡至水 冰冻切片从冰冻切片从-80-80取出，凉干或电吹风取出，凉干或电吹风吹干后可直接进行免疫组化标记。石蜡切吹干后可直接进行免疫组化标记。石蜡切片需经如下脱蜡才能做片需经如下脱蜡才能做IHCIHC。二甲苯二甲苯10min10min，二甲苯，二甲苯10min10min，二甲苯二甲苯10min1

27、0min，无水乙醇，无水乙醇2min2min，9595乙醇乙醇2min2min，8585乙醇乙醇2min2min，7575乙醇乙醇2min2min，流水冲洗。，流水冲洗。三、内源性酶的消除方法三、内源性酶的消除方法(一一)内源性过氧化物酶的消除方法：内源性过氧化物酶的消除方法：1.0.3%3%H2O2甲醇液甲醇液20min 2.1 H2O2 20min 3.3苯肼溶液苯肼溶液 37 1h 4.0.075%盐酸甲醇液盐酸甲醇液 30min5.DAB-H5.DAB-H2 2O O2 2溶液中加溶液中加0.0050.005M NaN3M NaN36.6.过碘酸过碘酸-硼酸钠：硼酸钠：0.5%0.5%

28、过碘酸过碘酸10min10min，经洗后经洗后1 1硼酸钠处理硼酸钠处理1010minmin。7.20mol/L-100mol/L7.20mol/L-100mol/L抗坏血酸抗坏血酸30306060minmin。(二二)内源性碱性磷酸酶的消除方法内源性碱性磷酸酶的消除方法 1.101.10醋酸醋酸 10min10min 2.0.5mol/L 2.0.5mol/L碳酸氢钠（碳酸氢钠（pH9.0pH9.0）20min20min 3.1mol/L 3.1mol/L左旋咪唑左旋咪唑 2020minmin(三三)内源性生物素的消除方法内源性生物素的消除方法 1.1.用用2-2-甲基甲基-D-D苷露糖饱和

29、生物素苷露糖饱和生物素 2.2.先用先用2525g/mlg/ml卵白素孵育卵白素孵育15min15min，PBSPBS洗洗10min10min，移至生物素饱和液中处理，移至生物素饱和液中处理15min15min，PBSPBS洗洗1515minmin。四、四、IHCIHC的非特异性染色的非特异性染色 1.1.特异性抗体不纯特异性抗体不纯 2.2.抗体免疫球蛋白所带电荷与检测抗体免疫球蛋白所带电荷与检测组织所带电荷差异很大，可引起非特异组织所带电荷差异很大，可引起非特异染色。染色。3.3.IgGIgG的交叉反应的交叉反应4.4.共同抗原决定簇共同抗原决定簇5.5.单一决定簇抗体的异质性单一决定簇抗

30、体的异质性6.6.特异性抗原弥散特异性抗原弥散7.7.IgGIgG受体干扰受体干扰8.8.鼠源性抗体检测鼠源性组织鼠源性抗体检测鼠源性组织解决方法：解决方法：1.1.用正常二抗血清吸附用正常二抗血清吸附 2.2.将组织用酶消化或抗原修复将组织用酶消化或抗原修复 3.3.二抗用木瓜酶将抗体结合部二抗用木瓜酶将抗体结合部FabFab切除切除 4.4.高度稀释特异性一抗高度稀释特异性一抗五、酶消化和抗原修复五、酶消化和抗原修复 1.1.为什么要进行酶消化和抗原修复？为什么要进行酶消化和抗原修复？(1)(1)固定液的影响固定液的影响 自自18931893年年Ferdinand Ferdinand Bl

31、umBlum创立组织固定以来，为了避免组织固创立组织固定以来，为了避免组织固定液对抗原决定簇的影响，已经寻找到几定液对抗原决定簇的影响，已经寻找到几十种固定液，目的就是为了对一定抗原起十种固定液，目的就是为了对一定抗原起到保护作用，同时还能获得良好的组织形到保护作用，同时还能获得良好的组织形态结构。态结构。目前无一种固定液适用于所有的抗原，从目前无一种固定液适用于所有的抗原，从组织细微结构的保存，稳定、简便和廉价组织细微结构的保存，稳定、简便和廉价综合评估上，甲醛最优。综合评估上，甲醛最优。甲醛使蛋白质发生凝固，自身和之甲醛使蛋白质发生凝固，自身和之间会发生交联，交联时会使蛋白质的四间会发生交

32、联，交联时会使蛋白质的四级和三级结构的折叠方向发生改变，使级和三级结构的折叠方向发生改变，使蛋白质苯环结构上的抗原决定簇发生改蛋白质苯环结构上的抗原决定簇发生改变，而影响检测。变，而影响检测。(2)(2)抗体制备的影响抗体制备的影响2.2.酶消化酶消化 (1)(1)原理：原理：1)1)去除覆盖于抗原决定簇表面的杂去除覆盖于抗原决定簇表面的杂蛋白蛋白 2)2)断交联断交联(2)(2)蛋白酶的种类蛋白酶的种类 胰蛋白酶胰蛋白酶0.05%0.05%0.10.1胰蛋白酶加入胰蛋白酶加入等量的氯化钙，用等量的氯化钙，用0.10.1N NaoHN NaoH调调pHpH至至7.87.8。消化时间消化时间37

33、 3037 30minmin。胃蛋白酶胃蛋白酶 0.4%0.4%胃蛋白酶，用胃蛋白酶，用0.1N HCI0.1N HCI稀稀释，消化时间释，消化时间37 3037 30180180minmin。蛋白酶蛋白酶K K 20 20g/mlg/ml，用，用pH8.0 0.5M pH8.0 0.5M TrisTris-HCI-HCI配制，消化时间配制，消化时间37 2037 204040minmin。链酶蛋白酶链酶蛋白酶 0.1%0.1%，用，用pH 7.4,0.5M pH 7.4,0.5M Tris-HclTris-Hcl稀释，消化时间稀释，消化时间37 137 14 4h h。无花果蛋白酶无花果蛋白

34、酶 0.1%0.1%浓度，用浓度，用0.2M 0.2M pH7.4 PBSpH7.4 PBS稀释，消化时间稀释，消化时间37 3037 306060minmin。菠萝蛋白酶菠萝蛋白酶 其浓度为其浓度为0.4%0.4%1 1，溶，溶在在0.01M0.01M，pH7.4 PBSpH7.4 PBS中，中，3737消化消化3030120120minmin。尿素尿素 浓度浓度3 3M 37 5M 37 530min30min(3)(3)原则及注意事项原则及注意事项 胃蛋白酶和菠萝蛋白酶主要用于细胞胃蛋白酶和菠萝蛋白酶主要用于细胞间质抗原的检测前消化，其余蛋白酶均为间质抗原的检测前消化，其余蛋白酶均为细胞

35、内抗原的显示消化。细胞内抗原的显示消化。在配制和使用时应考虑到酶激活的最在配制和使用时应考虑到酶激活的最佳佳pHpH值，消化温度、浓度和孵育时间。值，消化温度、浓度和孵育时间。3.3.热诱导的抗原修复：热诱导的抗原修复：抗原修复抗原修复(Antigen(Antigen Retrieval;AR)Retrieval;AR)是以高温、高压对常规固定是以高温、高压对常规固定的石蜡切片进行抗原修复或复原的一种非的石蜡切片进行抗原修复或复原的一种非蛋白酶消化以提高抗原抗体阳性检测的一蛋白酶消化以提高抗原抗体阳性检测的一种方法和技术手段。种方法和技术手段。(1)(1)依据：依据：4040年代美国学者年代美

36、国学者Fraenkel-Fraenkel-conratconrat等实验证实，甲醛和蛋白水解交联等实验证实，甲醛和蛋白水解交联过程中氨基酸侧链上的某些基团过程中氨基酸侧链上的某些基团(抗原决定抗原决定簇簇)如咪唑、吲哚等基团受到影响，通过如咪唑、吲哚等基团受到影响，通过120120高温或强碱处理后，可使交联打开。高温或强碱处理后，可使交联打开。(2)(2)修复方式：修复方式：微波微波969610min10min2 2；直接加温直接加温100100，15min15min；水浴锅水浴锅100100，15min15min；高压锅高压锅/消毒锅消毒锅120120，5min5min；真空加热真空加热10

37、min10min；直接烤片法。直接烤片法。(3)(3)修复介质：修复介质：0.01M pH6.00.01M pH6.0柠檬酸缓柠檬酸缓冲液冲液(CB)(CB)；0.05mTris-HCL(pH1-120.05mTris-HCL(pH1-12系系列列););0.01M pH7.0 PBS;0.01M pH7.0 PBS;2%2%硫酸铝；硫酸铝；2 2硝酸铝；硝酸铝；生理盐水；生理盐水；蒸馏水。蒸馏水。认为修复介质种类和溶液的摩尔浓度对修认为修复介质种类和溶液的摩尔浓度对修复效果影响较小，而复效果影响较小，而pHpH值则影响较大。缓值则影响较大。缓冲液以冲液以CBCB和和TrisTris-HCL-

38、HCL较常见。较常见。(4)(4)温度与修复时间的关系：许多的实验结温度与修复时间的关系：许多的实验结果表明，温度高修复时间短，呈正相关。果表明，温度高修复时间短，呈正相关。例如，例如，Ki-67Ki-67、P-gpP-gp的检测，利用同一切片，的检测，利用同一切片，达到相同的染色结果如下步骤：达到相同的染色结果如下步骤：100 100 20min20min；90 40min90 40min；80 60min80 60min；70 20h70 20h。(5)(5)选择最佳的修复方法选择最佳的修复方法根据下表选择最佳的修复方法根据下表选择最佳的修复方法柠檬酸柠檬酸Buffer pH1-2 Ph6

39、 Ph10-11Tris-HCL Buffer pH1-2 Ph7-8 Ph10-11微波微波100 10min2 切片切片1 切片切片2 切片切片3压力锅压力锅120 10min 切片切片4 切片切片5 切片切片6微波或水浴锅微波或水浴锅90 30min 切片切片7 切片切片8 切片切片9 切片切片10作阳性对照，不作任何处理作阳性对照，不作任何处理(6)AR(6)AR应注意的问题：高温应注意的问题：高温ARAR因其机理尚因其机理尚不清楚，对某些存在的问题或现象不可能不清楚，对某些存在的问题或现象不可能用设计对照的方法加以解决或解释清楚，用设计对照的方法加以解决或解释清楚，例如，有些抗体在冰

40、冻切片上不表达，或例如，有些抗体在冰冻切片上不表达，或表达率很低，但石蜡切片用表达率很低，但石蜡切片用ARAR后，却能很后，却能很好地表达；好地表达；某些应表达在胞浆或膜上的抗原，经过量某些应表达在胞浆或膜上的抗原，经过量修复后，绝大部分表达在核内；某些应表修复后，绝大部分表达在核内；某些应表达在核内的抗原，经过量修复后出现在细达在核内的抗原，经过量修复后出现在细胞浆内。因此对结果的判断要作出客观的胞浆内。因此对结果的判断要作出客观的分析。在操作过程中还应注意如下问题：分析。在操作过程中还应注意如下问题：热处理后应注意自然冷却；热处理后应注意自然冷却；热处理液不要让其煮干；热处理液不要让其煮干

41、；不要任何抗原的检测都使用该方法；不要任何抗原的检测都使用该方法；一批抗原的检测其温度和时间一定保一批抗原的检测其温度和时间一定保 持一致；持一致；形态学结构的改变：一般经高温修复后形态学结构的改变：一般经高温修复后胞浆无明显的破坏，而对细胞核内影响较胞浆无明显的破坏，而对细胞核内影响较大，会出现核破裂，苏木素淡染等现象。大，会出现核破裂，苏木素淡染等现象。如果在常用的修复液无法得到阳性结果，如果在常用的修复液无法得到阳性结果，或经修复后抗原定位发生改变，可改用某或经修复后抗原定位发生改变，可改用某些不常用的修复液，或加一些螯合剂，如些不常用的修复液，或加一些螯合剂，如EDTAEDTA和和EG

42、TAEGTA等可改善某些抗原的修复。等可改善某些抗原的修复。六、抗体的购置及注意事项六、抗体的购置及注意事项 1.1.抗体的购置抗体的购置 目前商品化抗体已有目前商品化抗体已有上千种，一种抗体可以有数家公司生产，上千种，一种抗体可以有数家公司生产，其质量的好坏也存在很大差异，首先应选其质量的好坏也存在很大差异，首先应选择一家好的生产公司，根据文献提供的信择一家好的生产公司，根据文献提供的信息，选择所需试剂的型号。息，选择所需试剂的型号。2.2.购置抗体的注意事项购置抗体的注意事项 (1)(1)种属：单克隆抗体，多克隆抗体种属：单克隆抗体，多克隆抗体 (2)(2)能否用于石蜡切片能否用于石蜡切片

43、 (3)(3)稀释度稀释度 (4)(4)特异性，交叉反应特异性，交叉反应 (5)(5)用何种组织前处理形式用何种组织前处理形式 (6)(6)包装单位，价格包装单位，价格3.3.抗体的大致分类抗体的大致分类 (1)(1)癌基因与抗癌基因标记物；癌基因与抗癌基因标记物；(2)(2)细胞凋亡标记物；细胞凋亡标记物；(3)(3)各种信号传导标记物各种信号传导标记物 (4)(4)各种正负调控基因标记物各种正负调控基因标记物 (5)(5)细胞增殖及调控标记物；细胞增殖及调控标记物；(6)(6)凝集素类标记物凝集素类标记物 (7)(7)激素受体标记物激素受体标记物 (8)(8)病毒性标记物病毒性标记物 (9

44、)(9)各类肿瘤标记物各类肿瘤标记物 (10)(10)耐药基因标记物耐药基因标记物七、抗体最佳稀释度的测定和保存七、抗体最佳稀释度的测定和保存 1.1.直接测定法直接测定法一抗稀释度一抗稀释度 特异性染色特异性染色 非特异性染色非特异性染色 1:50 +1:100 +1:200 +1:400 +1:500 +()阴性对照阴性对照 ()()2.2.棋盘法棋盘法3.3.抗体稀释液抗体稀释液 抗体稀释液是从事抗体稀释液是从事IHCIHC工作实验室必备，其制备方法如下：工作实验室必备，其制备方法如下：1 1克克明胶明胶(红、绿红、绿)溶在溶在300ml 0.2M pH7.6 TBS300ml 0.2M

45、 pH7.6 TBS中，加温，搅拌使其溶解，待其冷却后，中，加温，搅拌使其溶解，待其冷却后，加入加入1 1克牛血清白蛋白和克牛血清白蛋白和100mg NaN3100mg NaN3，44保存。保存。4.4.抗体的保存抗体的保存 商品化一抗或自制一抗商品化一抗或自制一抗均需加入防腐剂，在均需加入防腐剂，在44中保存一年其质量中保存一年其质量不会有太多的改变，如一次购置量大，可不会有太多的改变，如一次购置量大，可10l/10l/支分装，标上号，支分装，标上号，-40-40保存备用。保存备用。用抗体稀释液稀释一抗可在用抗体稀释液稀释一抗可在44中保存一年。中保存一年。八、显示系统及衬染剂的选择和配制八

46、、显示系统及衬染剂的选择和配制 (一一)显示系统显示系统 目前用于目前用于IHC的标记酶主要有的标记酶主要有HRP，AKP，其显示系统分别为：，其显示系统分别为：1.HRP1.HRP常用的发色基因：常用的发色基因：(1)3(1)3、3-3-二氨基联苯胺盐酸盐二氨基联苯胺盐酸盐(3(3、3-3-diaminbezidinediaminbezidine;DAB);DAB);(2)3-(2)3-氨基氨基-9-9-乙基卡吧唑乙基卡吧唑(3-(3-amino-amino-9-ethlylcarbazde9-ethlylcarbazde;AEC);AEC);(3)(3)四甲基联苯胺；四甲基联苯胺；(4)(

47、4)盐酸对苯二胺；盐酸对苯二胺；(5)4-(5)4-氯氯-1-1-萘酚；萘酚；(6)(6)高香草酸高香草酸(7)(7)萘酚派若宁萘酚派若宁2.AKP2.AKP常用的发色基团：常用的发色基团：(1)BCIP(1)BCIP（5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚基磷酸吲哚基磷酸)NBT(NBT(硝基四氮唑蓝硝基四氮唑蓝)；(2)(2)萘酚萘酚AS-BIAS-BI磷酸盐快红或磷酸盐快红或快蓝。快蓝。3.3.配制方法配制方法 (1)DAB:50mg DAB(1)DAB:50mg DAB溶在溶在0.010.01M pH7.6 M pH7.6 100ml Tris-Hcl100ml Tris-Hcl中，

48、加入中，加入0.03%0.03%H H2 2O O2 2，显，显色色8 812min12min，终产物为不溶性棕褐色颗粒，终产物为不溶性棕褐色颗粒状。状。(2)AEC:(2)AEC:取取40mg AEC40mg AEC溶在溶在5ml5ml二甲基甲酰二甲基甲酰胺中，待完全溶解后，加入胺中，待完全溶解后，加入0.05mol/L 0.05mol/L pH5.5pH5.5醋酸盐缓冲液醋酸盐缓冲液50ml50ml，最后加入，最后加入0.03%0.03%H H2 2O,O,终产物为红色可溶性。终产物为红色可溶性。(3)4-(3)4-氯氯-萘酚：取萘酚：取100mg 4cl-1-100mg 4cl-1-萘酚

49、溶萘酚溶于于10ml10ml无水乙醇中，待完全溶解后加入无水乙醇中，待完全溶解后加入0.05M pH7.6 TB 190ml,0.05M pH7.6 TB 190ml,过滤后加入过滤后加入0.03%0.03%H H2 2O O2 2。(二二)衬染剂的选择和配制衬染剂的选择和配制 IHCIHC染色后必须进行衬染，以衬托出染色后必须进行衬染，以衬托出组织形态结构，使形态与机能密切相关，组织形态结构，使形态与机能密切相关，以利于结果的分析。以利于结果的分析。1.1.苏木素衬染色剂苏木素衬染色剂 (1)Mayer(1)Mayer氏苏木素：取氏苏木素：取1g Mayer1g Mayer氏氏苏木素加温溶于

50、苏木素加温溶于100ml100ml蒸馏水中，再加入蒸馏水中，再加入50g50g碘酸钠和碘酸钠和50g50g钾明矾，溶解后加入枸橼钾明矾，溶解后加入枸橼酸和水合氯醛，溶解后过滤。酸和水合氯醛，溶解后过滤。(2)Harris(2)Harris氏苏木素：取氏苏木素：取2.5g Harris2.5g Harris氏氏苏木素溶于苏木素溶于25ml25ml无水乙醇中，另将钾明矾无水乙醇中，另将钾明矾加温溶于加温溶于500ml500ml蒸馏水中，待钾明矾全部蒸馏水中，待钾明矾全部溶解，再将二液混合在一起，加入氧化汞，溶解，再将二液混合在一起，加入氧化汞，溶解溶解30min30min，冷却后过滤，使用时加醋酸