基因敲除技术课件.ppt

1、2022-8-21分子生物学研究方法 2022-8-22 分子生物分子生物学研学研究之所以究之所以从从2020世世纪纪中叶中叶开开始得到高速始得到高速发发展，其主要的原因之一是展，其主要的原因之一是现现代分代分子生物子生物学研学研究方法，特究方法，特别别是基因操作和基因工是基因操作和基因工程技程技术术的的进进步。步。DNADNA分子的切割分子的切割与连与连接、核酸分子接、核酸分子杂杂交、交、凝凝胶电胶电泳、泳、细细胞胞转转化、核酸序列分析化、核酸序列分析以及基因以及基因的人工合成、的人工合成、定点突定点突变变和和PCRPCR扩扩增增等，是分子等，是分子生物生物学研学研究的核心技究的核心技术术。

2、一、重组DNA技术2022-8-23 4040年代明确了年代明确了遗传遗传的物的物质质基基础础是是DNA DNA 5050年代揭示了年代揭示了DNA DNA 分子的分子的双双螺旋螺旋结构结构模型和模型和半保留半保留复复制，解制，解决决了基因的自我了基因的自我复复制和制和遗传遗传信信息息传递问题传递问题 。5050年代末和年代末和6060年代提出了年代提出了“中心法中心法则则”和操和操纵纵子子学说学说，并并成功地破成功地破译译了了遗传遗传密密码码，从从而而阐阐明了明了遗传遗传信息的流向和表信息的流向和表达问题达问题。1重重组组DNADNA技技术诞术诞生的理生的理论论基基础础2022-8-242

3、2关键关键性性实验实验技技术问术问世世为为重重组组DNADNA技技术术奠奠基基 1)DNA1)DNA分子的切割分子的切割与连与连接技接技术术限制性核酸内切酶和连接酶的陆续发现，才使分子生物学家有了进行DNA操作的基本工具。2)2)载载体体构构建和大建和大肠肠杆菌杆菌转转化体系的建立化体系的建立 1970年M.Mandel和A.Hige发现，大肠杆菌的细胞经过氯化钙适当处理之后，便能吸收噬菌体的DNA。1972年美国斯坦福大学S.Cohen报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞也能摄取质粒DNA。大肠杆菌转化体系的建立，对重组DNA技术的创立具有特别重要的意义。3)Southern3)Southern

4、杂杂交、交、DNADNA序列分析和聚合酶序列分析和聚合酶链链反反应应 2022-8-25 重重组组DNADNA技技术术(recombinant DNA technique):(recombinant DNA technique):是按照人是按照人们们意愿，在体外意愿，在体外对对DNADNA分子分子进进行重行重组组,再再将将重重组组分子分子导导入受体入受体细细胞，使其在胞，使其在细细胞中胞中扩扩增和繁殖，以增和繁殖，以获获得得该该DNADNA的大量拷的大量拷贝贝。3 3重重组组DNADNA技技术术的的概概念念2022-8-264 4 重重组组DNADNA技技术术的基本步的基本步骤骤 1)1)四大

5、要素四大要素 外源基因外源基因 载载体体 工具酶工具酶 受体受体细细胞胞 2022-8-272)2)重重组组DNADNA技技术术的基本步的基本步骤骤 目的基因的目的基因的获获得得与载与载体的制体的制备备 目的基因目的基因与载与载体体DNADNA的的连连接接 重重组组DNADNA分子分子导导入受体入受体细细胞胞 重重组组体的体的筛选与筛选与重重组组DNADNA的的鉴鉴定定 克隆基因的表克隆基因的表达达及表及表达产达产物的物的检测与检测与分离分离纯纯化化 2022-8-28重重组组DNADNA技技术术操作的主要步操作的主要步骤骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源

6、基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNADNA目的基因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交2022-8-295 5重重组组DNADNA技技术术的意的意义义 重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟 重组DNA技术缩短了进化时间 重组DNA技术使人能对生物进行定向改造 体外大量扩增、研究其结构、功能及调控机制，从而拓宽了分子生物学的研究领域，这对医学上各种疾病等病因的查明、诊断及治疗具有重大意义

7、。2022-8-210酶酶类类功能功能限制性核酸限制性核酸内内切酶切酶识别并识别并在特定位点切在特定位点切开开DNADNADNADNA连连接酶接酶通通过过磷酸二磷酸二酯键酯键把把两个两个或多或多个个DNADNA片段片段连连接成一接成一个个DNADNA分子分子DNADNA聚合酶聚合酶按按55到到33方向加入新的核方向加入新的核苷苷酸，酸，补补平平DNADNA双链双链中的中的缺口缺口反反转录转录酶酶按照按照RNARNA分子中的分子中的碱碱基序列，根据基序列，根据碱碱基互基互补补原原则则合成合成DNADNA链链多核多核苷苷酸激酶酸激酶把磷酸基把磷酸基团团加到多聚核加到多聚核苷苷酸酸链链的的5-OH5

8、-OH末端末端末端末端转转移酶移酶在在双链双链核酸的核酸的33末端加上多聚末端加上多聚单单核核苷苷酸酸DNADNA外切酶外切酶从从DNADNA链链的的33末端逐末端逐个个切除切除单单核核苷苷酸酸 噬菌体噬菌体DNADNA外切酶外切酶从从DNADNA链链的的55末端逐末端逐个个切除切除单单核核苷苷酸酸碱碱性磷酸性磷酸酯酯酶酶切除位于切除位于DNADNA链链55或或33末端的磷酸基末端的磷酸基团团6 6重重组组DNADNA实验实验中常中常见见的主要工具酶的主要工具酶2022-8-211限制性核酸限制性核酸内内切酶切酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G限制性核酸限制性核酸内内切酶切酶

9、(restriction (restriction endonucleaseendonuclease,RE),RE)一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶 2022-8-212第一第一个个字母取自字母取自产产生生该该酶的酶的细细菌菌属属名，用大名，用大写写；第二、第三第二、第三个个字母是字母是该细该细菌的菌的种种名，用小名，用小写写；第四第四个个字母代表株；字母代表株；用用罗马数罗马数字表示字表示发现发现的先后次序。的先后次序。命名命名Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶202

10、2-8-2137 7重重组实验组实验中的主要中的主要载载体体定定义义：为为携携带带目的基因，目的基因，实现实现其无性繁殖其无性繁殖或表或表达达有意有意义义的蛋白的蛋白质质所采用的一些所采用的一些DNADNA分子。分子。2022-8-214克隆克隆载载体体(cloning vector)(cloning vector)为为使使插插入的外源入的外源DNADNA序列被序列被扩扩增而特意增而特意设计设计的的载载体体称为称为克隆克隆载载体。体。表表达载达载体体(expression vector)(expression vector)为为使使插插入的外源入的外源DNADNA序列可序列可转录转录翻翻译译成

11、成多多肽链肽链而特意而特意设计设计的的载载体体称为称为表表达载达载体。体。2022-8-215载载体的体的选择标选择标准准 能自主能自主复复制制；具有具有两个两个以上的以上的遗传标记遗传标记物，便于重物，便于重组组体的体的筛选筛选和和鉴鉴定；定；有克隆位点有克隆位点（外源（外源DNADNA插插入点），常具有多入点），常具有多个单个单一酶切位点，一酶切位点，称为称为多克隆位点；多克隆位点；分子量小分子量小，以容以容纳较纳较大的外源大的外源DNADNA。2022-8-216 噬菌体噬菌体载载体：体：双链双链DNADNA病毒，病毒，约约50kb,50kb,两两端有端有一一个个1212个个核核苷苷酸酸

12、5 5 端突出粘性末端端突出粘性末端 -噬噬菌体菌体 黏粒、黏粒、YACYAC、BAC BAC：高容量高容量载载体体2022-8-217不同克隆载体所容纳的外原DNA片段的大小 质质粒：粒：10kb10kb 噬菌体：噬菌体：23kb23kb 黏粒：黏粒：45kb45kb BACBAC：350kb350kb YACYAC：1000kb1000kb2022-8-218 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNADNA 克克 隆隆 过过 程程2022-8-219二、常见的DNA操作技术 1 1 细细菌菌转转化化 细细菌菌转转化：化：将将一一种细种细菌的菌的DNADNA导导入到另外一入到另外一种细

13、种细菌菌株而菌菌株而导导致性致性状状特征特征发发生生遗传遗传改改变变的生命的生命过过程。程。这种这种提供提供转转化化DNADNA的菌株叫做的菌株叫做供体菌株，供体菌株，而接受而接受转转化化DNADNA的寄主菌株的寄主菌株则称则称做做受体菌株。受体菌株。细细菌菌转转化方法：化方法：CaClCaCl2 2法和法和电电刺激法刺激法2022-8-2201）CaCl2法 原理：原理：大大肠肠杆菌在低杆菌在低温温（0 0 ）预处预处理理的低渗的低渗CaClCaCl2 2溶液中，溶液中，细细胞膨胞膨胀胀，膜透性改，膜透性改变变，易易与与外源外源DNADNA粘附粘附并并在在细细胞表面形成胞表面形成复复合物。合

14、物。然后然后4242热热刺激，外源刺激，外源DNADNA就可能被就可能被细细胞吸胞吸收。收。将转将转化后的化后的细细胞在胞在选择选择性培性培养养基上培基上培养养，筛选阳筛选阳性克隆。性克隆。2022-8-221大肠杆菌大肠杆菌载体载体0CaCl2选择性培养基上培养选择性培养基上培养筛选阳性克隆筛选阳性克隆得到大量目的基因得到大量目的基因CaCl2法法2022-8-2222）电击法 原理：原理：电电脉冲脉冲在在细细胞表面造成小凹陷，胞表面造成小凹陷，形成形成纳纳米米级级疏水孔洞。疏水孔洞。随随着着电压电压增加，疏水孔增加，疏水孔洞洞变变成成亲亲水孔洞。水孔洞。这样这样，介，介质质中的中的DNAD

15、NA就易于就易于通通过过孔洞孔洞进进入入细细胞胞质质。电击转电击转化化与温与温度有度有关关，最好在，最好在0 044进进行。行。2022-8-2233）体外包装法 原理：原理：利用噬菌体能利用噬菌体能够将够将DNADNA注入到寄注入到寄主主细细胞中的特点。胞中的特点。包装的基因工程噬菌体包装的基因工程噬菌体颗颗粒能粒能够够借助借助细细菌菌表面的噬菌体接受器位点表面的噬菌体接受器位点将将DNADNA注入受体注入受体细细菌，菌，并并在在细细胞中得到繁殖和表胞中得到繁殖和表达达。2022-8-224噬菌体作噬菌体作载载体体将将DNADNA注入注入到寄主到寄主细细胞中的方法胞中的方法插插入型入型替替换

16、换型型限制性限制性内内切酶切割切酶切割加入外源加入外源DNADNADNA连连接酶接酶连连接接噬菌体外噬菌体外壳壳蛋白包装蛋白包装感染感染细细菌通菌通过过受体蛋白受体蛋白将将外源外源DNADNA注入宿主注入宿主细细胞胞内内2022-8-2252 2、PCRPCR技技术术聚合酶聚合酶链链式反式反应应 (Polymerase Chain Reaction,PCR)(Polymerase Chain Reaction,PCR)是一是一种种在体外快速在体外快速扩扩增特定基因或增特定基因或DNADNA序列的方法。序列的方法。它它可以在可以在试试管中建立反管中建立反应应，经数经数小小时时之后，就能之后，就能

17、将极将极微量的微量的目的基因或某一特定的目的基因或某一特定的DNADNA片段片段扩扩增增数数十万乃至千百万倍。十万乃至千百万倍。经经n n次次扩扩增后增后,一一个个DNADNA分子可分子可变为变为2 2n n个个DNADNA分子。分子。2022-8-226 原理：原理：先先将将含有所需含有所需扩扩增分析序列的增分析序列的靶靶DNADNA双链经热变双链经热变性性处处理解理解开为两个开为两个寡聚寡聚核核苷苷酸酸单链单链，然后加入一，然后加入一对对根据已知根据已知DNADNA序列由人序列由人工合成的工合成的引物引物。引物。引物与与互互补补DNADNA结结合后，以合后，以靶靶DNADNA单链为单链为模

18、板，模板，经经反反链杂链杂交交复复性（退火），性（退火），在在TaqTaq DNA DNA聚合酶的作用下以聚合酶的作用下以4 4种种三磷酸三磷酸脱氧脱氧核核苷苷（dNTPdNTP）为为原料按原料按55到到33方向方向将将引物延引物延伸、自伸、自动动合成合成新的新的DNADNA链链、使、使DNADNA重新重新复复制制成成双链双链。然后又。然后又开开始第二次循始第二次循环扩环扩增。增。2022-8-227 新合成的新合成的DNADNA链链含有引物的互含有引物的互补补序列，序列，并并又可作又可作为为下一下一轮轮聚合反聚合反应应的模板。如此重的模板。如此重复复上述上述DNADNA模板加模板加热变热变性

19、性双链双链解解开开引物退火引物退火复复性性在在DNADNA聚合酶作用下的引物延伸的循聚合酶作用下的引物延伸的循环过环过程程，使每次循，使每次循环环延伸的模板又增加延伸的模板又增加1 1倍，亦即倍，亦即扩扩增增DNADNA产产物增加物增加1 1倍，倍，经经反反复复循循环环，使，使靶靶DNADNA片段片段指指数数性性扩扩增。增。2022-8-228 PCRPCR反反应应五要素：五要素：参参加加PCRPCR反反应应的物的物质质主要有五主要有五种种即即引物引物、酶、酶、dNTPdNTP、模板和、模板和MgMg2+2+。2022-8-2292022-8-230待待扩扩增的增的DNADNA片段片段+dNT

20、P+TrisHCldNTP+TrisHCl缓缓冲液冲液+两条两条引物引物+TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶 +Mg+Mg 2+2+95变性变性3060退火退火3072延伸延伸1 l双链双链DNADNA变变性，性，形成形成单链单链模板模板DNADNA；l使引物使引物与两条单链与两条单链模模板板DNADNA发发生退火作用生退火作用并并结结合在合在靶靶DNADNA区区段段两两端端的互的互补补序列位置上序列位置上 在在DNADNA聚合酶的聚合酶的作用下，作用下，从从引物的引物的3-3-端加入端加入脱氧脱氧核核苷苷三磷酸，三磷酸，并并沿着模沿着模板按板按5 35 3方向延方向延伸，合成新生伸，合

21、成新生DNADNA互互补链补链。2022-8-2312022-8-2323 3、cDNAcDNA噬菌体文噬菌体文库库原理：原理：cDNAcDNA是是从从mRNAmRNA反反转录来转录来的的DNADNA。cDNAcDNA组组成特点成特点是其中不含有是其中不含有内内含子含子和和其他其他调调控序列控序列，做，做cDNAcDNA克隆克隆时应时应是是先先从获从获得得mRNAmRNA开开始，在此基始，在此基础础上，通上，通过过反反转录转录酶酶作用作用产产生生一一条与条与mRNAmRNA相互相互补补的的DNADNA链链，然后除掉，然后除掉mRNAmRNA，以第一，以第一条条DNADNA链为链为模板模板复复制

22、出第二制出第二条条DNADNA链链（双链双链）；再）；再进进一步把此一步把此双链插双链插入原核或入原核或真真核核载载体。体。2022-8-233高高质质量量mRNAmRNA的制的制备备反反转录转录生成生成cDNAcDNA与与噬菌粒噬菌粒载载体分子相体分子相连连接接噬菌粒的包装噬菌粒的包装 cDNAcDNA噬菌粒文噬菌粒文库库的主要步的主要步骤骤：2022-8-2341）高质量mRNA的制备用用试剂试剂盒提取盒提取总总RNA加入加入与与生物素相生物素相连连的寡聚的寡聚(dTdT)引物引物温温育育加入加入与与微磁球相微磁球相连连的抗生的抗生物素蛋白物素蛋白用磁用磁场场吸附通吸附通过过寡聚寡聚(dT

23、dT)引引物物与与抗生物素蛋白及强力微抗生物素蛋白及强力微磁球相磁球相连连的的mRNAmRNA洗洗脱脱得到得到mRNAmRNA2022-8-235以寡聚以寡聚dTdT或或随随机机6 6核核苷苷酸酸为为引物引物反反转录转录酶酶cDNA第一第一链链以以cDNAcDNA第一第一链为链为模板合成模板合成cDNAcDNA第第二二链链加接加接头头准准备备与载与载体体连连接接2022-8-2363）与噬菌体载体分子相连接带带有接有接头头的的cDNA噬菌粒噬菌粒DNA经内经内切酶切割切酶切割含有含有cDNAcDNA插插入片段的重入片段的重组组噬菌粒噬菌粒DNADNA2022-8-2374）噬菌粒的包装含有含有

24、cDNAcDNA插插入片段的重入片段的重组组噬菌粒噬菌粒DNADNA体外蛋白体外蛋白质质外外壳壳的包装反的包装反应应有侵染和有侵染和复复制能力的成熟噬菌体制能力的成熟噬菌体进进行基因行基因组学组学的的研研究究含有某含有某种组织种组织或器官的噬菌粒文或器官的噬菌粒文库库2022-8-2382022-8-2394 基因敲除技术概概念：念：基因敲除技基因敲除技术术（gene knockout)gene knockout)又又称称基因打基因打靶靶（gene targetinggene targeting）。）。这种这种技技术术是通是通过过基因工程的方法基因工程的方法将将一一个结构个结构已知但功能未知的

25、基因去除，或用其他序列相近的基已知但功能未知的基因去除，或用其他序列相近的基因取代（又因取代（又称称基因敲入），基因敲入），然后然后从从整体整体观观察察实验动实验动物，物，从从而而推推测测相相应应基因的功能。基因的功能。这种这种人人为为地把地把实验动实验动物某一物某一种种有功能有功能的基因完全缺失的技的基因完全缺失的技术称为术称为基因敲除技基因敲除技术术。2022-8-2401 1）完全基因敲除）完全基因敲除完全基因敲除是指完全基因敲除是指通通过过同源重同源重组组法法完全消除完全消除细细胞或者胞或者动动物物个个体中的体中的靶靶基因活性。基因活性。原理原理:应应用用DNADNA同源重同源重组组原

26、理，用原理，用设计设计的同源片段替代的同源片段替代靶靶基因片段，基因片段，从从而而达达到基因敲除的目的。到基因敲除的目的。2022-8-241基本路基本路线线:表型分析表型分析构建载体构建载体同源重组同源重组筛选已击中的筛选已击中的ES细胞细胞显微注射显微注射回交得到回交得到X被敲除的动物被敲除的动物ES细胞的获得细胞的获得 得到纯合体得到纯合体2022-8-242正正负双负双向向选择选择：neoneo:正向正向选择选择基因，基因，插插入入载载体体靶靶DNADNA的外的外显显子；子；HSK-HSK-tktk:负负向向选择选择基因，目的片基因，目的片断断外外侧侧，不能在，不能在选择选择培培养养基

27、上生基上生长长。2022-8-2432 2）条条件型基因敲除件型基因敲除 条条件件型型基因剔除是指某一基因剔除是指某一特定特定细细胞胞类类型型或或细细胞胞发发育的育的特定特定阶阶段段剔除某一特定基因的技剔除某一特定基因的技术术。常用的常用的条条件型基因敲除有：件型基因敲除有：噬菌体的噬菌体的Cre/LoxpCre/Loxp系系统统、Gin/Gin/GixGix系系统统酵母酵母细细胞的胞的FLP/FRTFLP/FRT系系统统、R/RSR/RS系系统统2022-8-244 原理：原理：通通过过常常规规基因打基因打靶靶在基因在基因组组的的靶靶位点上位点上装上装上两个两个同向排列的同向排列的1oxP1

28、oxP，并并以此以此两侧两侧装接上装接上loxPloxP 的的(“(“loxPloxP floxed”)floxed”)ESES 细细胞胞产产生生“loxPfloxedloxPfloxed”小鼠小鼠,然后，通然后，通过将过将“loxPloxP floxedfloxed”小鼠小鼠与与CreCre 转转基因鼠基因鼠杂杂交，交，产产生生靶靶基因基因发发生特生特定方式修定方式修饰饰的的条条件性突件性突变变小鼠。小鼠。2022-8-245 在在“loxPloxP floxedfloxed”小鼠，小鼠，虽虽然然靶靶基因的基因的两两侧侧已各装上了一已各装上了一个个loxPloxP，但，但靶靶基因基因并没并没

29、有有发发生生其他的其他的变变化，故化，故“1oxP 1oxP noxednoxed”小鼠表型仍同小鼠表型仍同野生型的一野生型的一样样。但。但当它与当它与CreCre 转转基因小鼠基因小鼠杂杂交交时时，产产生的子代中生的子代中将将同同时带时带有有“loxPloxP floxedfloxed”靶靶基因和基因和CreCre 基因。基因。CreCre 基因表基因表达产达产生的生的CreCre 重重组组酶就酶就会会介介导靶导靶基因基因两侧两侧的的1oxP 1oxP 间发间发生切除生切除反反应应，结结果果将将一一个个loxPloxP 和和靶靶基因基因切除。切除。这样这样，靶靶基因的修基因的修饰饰(切除切除

30、)是以是以CreCre 的表的表达为达为前提的。前提的。2022-8-246 CreCre 的表的表达达特性特性决决定了定了靶靶基因的修基因的修饰饰(切切除除)持性：即持性：即CreCre 在在哪哪一一种组织细种组织细胞中表胞中表达达，靶靶基因的修基因的修饰饰(切除切除)就就发发生在生在哪种组织细哪种组织细胞胞；而；而CreCre 的表的表达达水平水平将将影影响靶响靶基因在此基因在此种组织细种组织细胞胞中中进进行修行修饰饰的效率。所以只要控制的效率。所以只要控制CreCre 的表的表达达特特异异性和表性和表达达水平就可水平就可实现对实现对小鼠中小鼠中靶靶基因修基因修饰饰的特的特异异性和程度。性

31、和程度。2022-8-2472022-8-248构构建打建打靶载靶载体体同源重同源重组组筛选筛选中中靶靶ESES显显微注射微注射杂杂交交删删除除neoneor r基因基因特定特定阶阶段段诱导诱导CreCre酶酶切除目的片段切除目的片段动动物物观观察分析察分析Cre-loxPCre-loxP 重重组组系系统进统进行行条条件性基因剔除的程序件性基因剔除的程序：体外培体外培养养2022-8-249三、基因克隆技术简介1 1 RACE(rapidRACE(rapid amplification of amplification of cDNAcDNA ends)ends)一一种种通通过过PCRPCR进

32、进行行cDNAcDNA末端快速克隆末端快速克隆的技的技术术，是以，是以mRNAmRNA为为模板反模板反转录转录成成cDNAcDNA第一第一链链后用后用PCRPCR技技术扩术扩增出增出某某个个特特异异位点到位点到33或或5 5 端端之之间间未知序列的方法。未知序列的方法。2022-8-250mRNAmRNA的的获获取取去磷酸化去磷酸化加寡聚接加寡聚接头头（55）反反转录转录合成第一合成第一条条cDNAcDNA 5 5 RACE RACE，扩扩增增5 5未知序列未知序列3RACE3RACE扩扩增增3 3 未知序列未知序列5 5 已知的接已知的接头头序列；序列；基因特基因特异异反向序列反向序列3 3

33、 寡聚寡聚dTdT下游序列；下游序列；基因特基因特异异反向序列反向序列2022-8-2512 cDNA差示分析法(cDNA-RDA法)差差减杂减杂交交与与RT-PCRRT-PCR方法相方法相结结合，通合，通过过降降低低cDNAcDNA群体群体复杂复杂性和更性和更换换cDNAcDNA两两端接端接头头等方法，特等方法，特异扩异扩增目的基因片段增目的基因片段2022-8-252主要步主要步骤骤是：是：mRNAmRNA逆逆转录为转录为cDNAcDNA，用用4 4 碱碱基基识别识别酶消化，酶消化，与与接接头头1 1连连接，接，PCR PCR 扩扩增；去除接增；去除接头头1 1，扩扩增增子接上接子接上接头

34、头2 2，与驱与驱逐逐子子杂杂交，交，PCRPCR扩扩增；去增；去除接除接头头2 2，加上接，加上接头头3 3，再再与与driverdriver杂杂交，再交，再扩扩增，增，筛选筛选出目的片段、出目的片段、克隆、克隆、测测序。序。2022-8-2533 3 酵母酵母双杂双杂交体系交体系（Yeast tow-hybrid Yeast tow-hybrid systemsystem）Two-hybrid system Two-hybrid system也叫也叫interaction trapinteraction trap（相互作（相互作用陷井），是用陷井），是9090年代初年代初发发展起展起来来的

35、分离基因的新方法，的分离基因的新方法，可用于可用于分离分离能能与与已知已知靶靶蛋白蛋白质质（target proteintarget protein）相互）相互作用的基因。作用的基因。2022-8-254 基本原理：基本原理：真真核生物的核生物的转录转录因子大多是由因子大多是由两个结构两个结构上分上分开开、功能上、功能上独独立的立的结构结构域域组组成的。如成的。如GAL4GAL4的的N N端端1-147aa1-147aa是是DNADNA结结合域（合域（BDBD），其），其C C端端768-881aa768-881aa是是转录转录激活域（激活域（ADAD）。一般情）。一般情况况下，下，ADAD能

36、能与与GAL4GAL4效效应应基因基因启动启动子上游的特定子上游的特定DNADNA区区段（段（UASUAS）相）相结结合，而此合，而此时时，ADAD则则推推动动了了转录转录起始。起始。若用基因工程的方法，若用基因工程的方法，将将GAL4 ADGAL4 AD和和BDBD分分别别克隆到不同的克隆到不同的载载体上，体上，导导入同一入同一细细胞株中表胞株中表达达，效，效应应基因无法被激活基因无法被激活,但可把但可把来来自不同自不同转转录录因子的因子的ADAD或或BDBD区区域域连连成一成一个个功能基因。功能基因。2022-8-2552022-8-256 主要主要实验过实验过程：程：a.a.选择选择缺失

37、缺失GAL4GAL4编码编码基因的酵母寄主菌株基因的酵母寄主菌株 b.b.研研究的究的猎猎物物(或或称靶称靶蛋白蛋白)蛋白的基因蛋白的基因与编码与编码ADAD的序列的序列结结合合 c.c.诱饵诱饵(bait)(bait)蛋白的基因蛋白的基因与编码与编码BDBD的序列的序列结结合合,形形成成两两段融合基因段融合基因 d.d.将将共共转转化的酵母菌株涂布于化的酵母菌株涂布于选择选择培培养养基上，基上，筛筛选选表表达达相互作用的相互作用的杂种杂种蛋白（激活蛋白（激活报报告基因告基因转录转录）的的阳阳性菌落。性菌落。2022-8-257酵母双杂交系统的应用：发现新蛋白和蛋白的新功能 研究抗原和抗体的作

38、用（细胞内）筛选药物的作用位点 建立基因组蛋白连锁图2022-8-258 局限性：局限性：双杂双杂交系交系统统分析蛋白分析蛋白间间的相互作用定位于的相互作用定位于细细胞核胞核内内，而而许许多蛋白多蛋白间间的相互作用依的相互作用依赖赖于于翻翻译译后加工后加工如糖基化、二硫如糖基化、二硫键键形成等，形成等，这这些反些反应应在核在核内内无法无法进进行。行。另外有些蛋白的正确折另外有些蛋白的正确折叠叠和功能有和功能有赖赖于其他非酵母蛋于其他非酵母蛋白的白的辅辅助，助，这这限制了某些限制了某些细细胞外蛋白和胞外蛋白和细细胞膜受体蛋胞膜受体蛋白等的白等的研研究。究。酵母酵母双杂双杂交系交系统统的一的一个个

39、重要的重要的问题问题是是 假假阳阳性性。由于某些蛋白本身具有激活。由于某些蛋白本身具有激活转录转录功能或在酵母中表功能或在酵母中表达时发挥转录达时发挥转录激活作用，激活作用，使使DNADNA结结合合结构结构域域杂杂交蛋白交蛋白在无特在无特异异激活激活结构结构域的情域的情况况下可激活下可激活转录转录。另外某些。另外某些蛋白表面含有蛋白表面含有对对多多种种蛋白蛋白质质的低的低亲亲和力和力区区域，域，能能与与其其他蛋白形成他蛋白形成稳稳定的定的复复合物，合物，从从而引起而引起报报告基因的表告基因的表达达，产产生生 假假阳阳性性 结结果。果。2022-8-259 19861986年提出，根据年提出，根

40、据目的基因在染色体上的目的基因在染色体上的位置位置进进行的，无需行的，无需预预先知道基因的先知道基因的DNADNA顺顺序，序，也无需也无需预预先知道其表先知道其表达产达产物的有物的有关关信息，但信息，但必必须须建立建立遗传遗传分离群体分离群体 主要用于主要用于与遗传与遗传病相病相关关基因等致病基因的克基因等致病基因的克隆隆4 4 基因的基因的图图位克隆法位克隆法 （Map-based cloningMap-based cloning）2022-8-260 通通过对许过对许多不同的生多不同的生态态型及大量限制性型及大量限制性内内切酶和切酶和杂杂交探交探针针的分析，找出的分析，找出与与目的基因距目

41、的基因距离最近的离最近的RFLPRFLP标记标记。在。在RFLPRFLP作作图图中，中，连锁连锁距距离是根据重离是根据重组组率率来计来计算的，算的，1cm1cm（厘米）相（厘米）相当当于于1%1%的重的重组组率。人率。人类类基因基因组组中，中，1cm1000kb;1cm1000kb;拟拟南芥菜中，南芥菜中，1cm290kb;1cm290kb;小小麦麦中，中，1cm3500kb1cm3500kb。2022-8-261主要包括以下6个步骤：1.1.筛选与筛选与目目标标基因基因连锁连锁的分子的分子标记标记。利用利用目目标标基因的近等基因系或分离群体分基因的近等基因系或分离群体分组组分析法（分析法（B

42、SABSA）进进行行连锁连锁分析，分析，筛选筛选出目出目标标基因所在局部基因所在局部区区域的分子域的分子标记标记。2.2.构构建建并筛选并筛选含有大含有大插插入片段的基因入片段的基因组组文文库库。用用与与目目标标基因基因连锁连锁的分子的分子标记为标记为探探针筛选针筛选基因基因组组文文库库，得，得到到阳阳性克隆。性克隆。3.3.构构建目的基因建目的基因区区域跨域跨叠叠克隆群。克隆群。以以阳阳性克性克隆的末端作隆的末端作为为探探针针基因基因组组文文库库，并进并进行染色体步行，直到行染色体步行，直到获获得具得具有目有目标标基因基因两侧两侧分子分子标记标记的大片段跨的大片段跨叠叠群。群。2022-8-

43、262 4.4.目的基因目的基因区区域的精域的精细细作作图图。通通过过整合已有的整合已有的遗传图谱遗传图谱和和寻寻找新的分子找新的分子标记标记，提高目的基因，提高目的基因区区域域遗传图谱遗传图谱和物和物理理图谱图谱的密的密谱谱的密度的密度 5 5.目的基因的精目的基因的精细细定位和染色体登定位和染色体登陆陆。利利用用侧侧翼分子翼分子标记标记分析和混合分析和混合样样品作品作图图精确定位目的基因。接着以精确定位目的基因。接着以目目标标基因基因两侧两侧的分子的分子标记为标记为探探针针通通过过染色体登染色体登陆获陆获得含目得含目标标基因基因的的阳阳性克隆。性克隆。6.6.外外显显子的分离、子的分离、鉴

44、鉴定定。阳阳性克隆中可能含有多性克隆中可能含有多个个候候选选基因。用基因。用筛选筛选cDNAcDNA文文库库，外，外显显子捕捉和子捕捉和cDNAcDNA直直选选法等法等技技术术找到找到这这些候些候选选基因，再基因，再进进行共分离，行共分离，时时空表空表达达特点，同源性特点，同源性比比较较等分析确定目等分析确定目标标基因。基因。2022-8-2632022-8-2642022-8-2651、基因表达系列分析技术（serial analysis of gene expression,SAGE）基因表基因表达达系列分析系列分析（Serial Analysis of Serial Analysis o

45、f Gene ExpressionGene Expression，SAGESAGE）技）技术术在理在理论论上上来来说说可以可以检测检测到一到一个细个细胞胞内内所有所有转录转录体的表体的表达达，而且可以而且可以给给每一每一个转录个转录体定量，不管体定量，不管它它是低丰是低丰度度还还是高丰度。是高丰度。四、基因表达研究技术2022-8-266 1995 1995年年VelculescuVelculescu提出的，是近几提出的，是近几年年来发来发展起展起来来的一的一种种快速分析基因表快速分析基因表达达信息的技信息的技术术。它它通通过过快速和快速和详细详细分析成分析成千上万千上万个个ESTEST来寻来

46、寻找出表找出表达达丰度不同的丰度不同的SAGESAGE标签标签序列，序列，从从而接近完整地而接近完整地获获得得基因基因组组的表的表达达信息。信息。它它的的显显著著特点特点是能是能够够大量大量获获取基因取基因组组范范围围基因表基因表达达的的类别类别与与丰度丰度。2022-8-267 SAGESAGE技技术术已成功地已成功地应应用于特用于特异组异组织织或或细细胞的胞的转录组研转录组研究和究和mRNAmRNA群体群体间间差差异异表表达达基因的基因的鉴鉴定。定。基因表基因表达达系列分析（系列分析（SAGESAGE）以）以构构建建能能独独特代表基因特代表基因转录转录本序列的本序列的标签标签（tagtag

47、）为为宗旨宗旨，标签长标签长度度约约9 912 12 bpbp，同一，同一tag tag 在某在某组织组织中出中出现现的的频频度反度反应应了了该该tag tag 所代表基因在所代表基因在这种组织这种组织中的表中的表达达丰度。丰度。2022-8-268 SAGE SAGE的原理的原理 从从三方面保三方面保证证能唯一性的能唯一性的鉴鉴定定转录转录本本并并精确的反精确的反映其表映其表达达丰度。丰度。首先，首先，SAGESAGE从从每每个转录个转录本特定位置本特定位置唯一性的截取唯一性的截取101011bp11bp的的序列，序列，该该序列即序列即为为SAGESAGE标标签签。通。通过测过测序，特定序，

48、特定标签标签的出的出现数现数目就可以反映目就可以反映它它所所代表的代表的转录转录本的表本的表达达丰度。丰度。其次，其次，为为了克服了克服这种这种基于基于测测序的方法可能存在的通量限制，序的方法可能存在的通量限制，SAGESAGE采取了系列采取了系列化化处处理，理，从从而而测测得的每得的每个个序列可以包含序列可以包含25255050个标签个标签。最后，最后，同其他方法一同其他方法一样样，SAGESAGE也采用了聚合酶也采用了聚合酶链链反反应应（Polymerase Chain Reaction,PCRPolymerase Chain Reaction,PCR）扩扩增，但增，但是，特定的是，特定的

49、识别识别机制避免了可能机制避免了可能产产生表生表达谱达谱的的扩扩增偏增偏倚（倚（Amplification BiasAmplification Bias）。）。2022-8-269 具体的具体的实验实验路路线线：1.1.以以oligooligo（dTdT）为为引物反引物反转录转录合成合成cDNAcDNA，以一，以一种种限制性限制性内内切酶（切酶（锚锚定酶）酶切。定酶）酶切。2.2.将将cDNAcDNA等分等分为为A A和和B B两两部分，分部分，分别连别连接接接接头头A A或或接接头头B B。每一。每一种种接接头头都含有都含有标签标签酶酶切位点序列。酶酶切位点序列。3.3.用用标签标签酶酶切酶

50、酶切产产生生连连有接有接头头的短的短cDNAcDNA片段（片段（约约9-109-10碱碱基），混合基），混合并连并连接接两个两个cDNAcDNA池的短池的短cDNAcDNA片片段，段，构构成成双标签双标签后，以引物后，以引物A A和和B B扩扩增。增。4.4.用用锚锚定酶切割定酶切割扩扩增增产产物，抽提物，抽提双标签双标签（DitgaDitga）片段片段并并克隆、克隆、测测序。序。2022-8-270SAGE的主要过程分为三个阶段：第一第一阶阶段是段是SAGESAGE文文库库的的构构建。建。包括五包括五个个步步骤骤：1 1、双链双链cDNAcDNA的的获获得。得。2 2、生物素化的、生物素化的