实验四PCR产物的T载体克隆和转化[可修改版ppt]课件.ppt
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1、实验四PCR产物的T载体克隆和转化重组重组DNA技术操作步骤技术操作步骤 基本原理基本原理目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体细胞导入受体细胞外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 主要步骤主要步骤:制备目的基因和选择相关载体制备目的基因和选择相关载体 目的基因和有关载体进行连接目的基因和有关载体进行连接 重组的重组的DNA导入受体细胞导入受体细胞 DNA重组体的筛选和鉴定重组体的筛选和鉴定 DNA重组体的扩增、表达和其他研究重组体的扩增、表达和其他研究 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的
2、DNA 克克 隆隆 过过 程程(三)(三)PCR扩增特定基因扩增特定基因(四)人工合成(四)人工合成一、目的基因的获得一、目的基因的获得分分(一)从基因组文库中获得(一)从基因组文库中获得(二)从(二)从cDNA文库中获得文库中获得组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组基因组DNA文库文库存在于转化细胞内存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNA的集合的集合从基因组从基因组DNA文文库获取目的基因库获取目的基因限制酶切位点限制酶
3、切位点限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色体色体DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文库基因文库用随机切割的真核生物染色体用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库片段构建基因文库 mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体
4、载体 受体菌受体菌 复制复制 从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。序列。几种常用克隆载体的比较几种常用克隆载体的比较注:注:+表示可用;表示可用;-表示不可用表示不可用比较内容比较内容 质质 粒粒 噬菌体噬菌体 黏性质粒黏性质粒 M13噬菌体噬菌体克隆容量克隆容量 10 kb 22 kb 4050 kb 1 kb基因组基因组DNA文库文库 -+-cDNA文
5、库文库 +-亚克隆亚克隆 +-+序列分析序列分析 +-+E.coli表达表达 +-二、载体的选择与准备二、载体的选择与准备选选三、三、DNADNA分子的体外连接分子的体外连接接接(一)黏性末端(一)黏性末端(二)人工接头的使用(二)人工接头的使用(三)加入同聚体尾(三)加入同聚体尾(四)平端连接(四)平端连接(一)黏性末端(一)黏性末端(二)人工接头(二)人工接头(三)加入同聚体尾(三)加入同聚体尾待克隆待克隆DNADNA片段片段重组质粒重组质粒混合、退火混合、退火空白质粒空白质粒(四)平端连接(四)平端连接5 3 3 5 载体载体DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或
6、机械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 3 5 5 3 3 5 3 A(A)nA A(A)nA-核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+dATP末端转移酶末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体5 3 5 四、外源四、外源DNADNA导入宿主细胞导入宿主细胞转转受体菌条件:受体菌条件:安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态(competent)导入方式:导入方式:转化转化(transformation)转染转染(transfe
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