核酸的研究方法课件.ppt
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1、第十五章第十五章 核酸的研究方法核酸的研究方法一、核酸的分离、提纯和定量测定一、核酸的分离、提纯和定量测定二、核酸的超速离心二、核酸的超速离心三、核酸的凝胶电泳三、核酸的凝胶电泳四、核酸的核苷酸序列测定四、核酸的核苷酸序列测定五、五、DNADNA聚合酶链反应(聚合酶链反应(PCRPCR)六、六、DNADNA的化学合成的化学合成楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国一、核酸的分离、纯化和定量测定一、核酸的分离、纯化和定量测定尽可能保持其天然状态,防止降解和变性。尽可能保持其天然状态,防止降解和变性。条件温和,防止过酸、过碱、剧烈搅拌。条件温和,防止过酸、过碱、剧烈
2、搅拌。抑制核酸酶。抑制核酸酶。(一)(一)DNADNA分离分离真核真核DNADNA以核蛋白(以核蛋白(DNPDNP)形式存在,)形式存在,DNPDNP溶于水或溶于水或高盐溶液(高盐溶液(1mol/L NaCl1mol/L NaCl),但不溶于低盐溶液),但不溶于低盐溶液(0.14mol/L NaCl0.14mol/L NaCl),据此,采用高盐提取,低盐),据此,采用高盐提取,低盐沉淀,可将沉淀,可将DNPDNP与与RNARNA核蛋白分开,提取出核蛋白分开,提取出DNPDNP。楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国DNPDNP可用水饱和的酚抽提,去除蛋白质。还可
3、用氯仿可用水饱和的酚抽提,去除蛋白质。还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。异戊醇去除蛋白质。水相中的水相中的DNADNA可被可被0.3M NaAC-70%0.3M NaAC-70%乙醇沉淀。乙醇沉淀。(二)(二)RNARNA的分离的分离RNaseRNase 的灭活:的灭活:玻璃器皿:玻璃器皿:140-200140-200,8h8h塑料器皿:塑料器皿:0.1%DEPC0.1%DEPC,3737,过夜,过夜提取液加盐酸胍或异硫氰酸胍提取液加盐酸胍或异硫氰酸胍反应体系中加反应体系中加RNasinRNasin等特异的等特异的RNaseRNase抑制剂抑制剂楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学
4、系 范树国范树国用用0.14mol/L NaCl0.14mol/L NaCl使使DNPDNP沉淀,上清中即为沉淀,上清中即为RNARNA核核蛋白(蛋白(RNPRNP)。盐酸胍、苯酚等去蛋白。)。盐酸胍、苯酚等去蛋白。异硫氰酸胍异硫氰酸胍/苯酚苯酚/氯仿法氯仿法异硫氰酸胍异硫氰酸胍/氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法蛋白质:蛋白质:1.33g/ml1.33g/mlDNADNA:1.71g/ml1.71g/ml左右左右RNARNA:1.89g/ml1.89g/mlmRNAmRNA的制备:的制备:oligo(dToligo(dT)纤维素(琼脂糖凝胶)亲合层析法纤维素(琼脂糖凝胶)亲合层析法楚雄
5、师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国(三)核酸含量的测定方法(三)核酸含量的测定方法核酸纯度的鉴定可通过测定样品在核酸纯度的鉴定可通过测定样品在260 nm260 nm和和280nm280nm的光吸收比值,进一步的鉴定可通过琼脂糖凝胶电的光吸收比值,进一步的鉴定可通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳。泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳。磷的测定磷的测定 RNARNA中含磷量为中含磷量为9.09.0,DNADNA中含磷量为中含磷量为9.29.2,因此每测得,因此每测得1g1g磷就相当于含有磷就相当于含有11g11g核酸。含核酸。含磷量的测定是用浓硫酸将核酸消化,使其有机磷变磷
6、量的测定是用浓硫酸将核酸消化,使其有机磷变成无机磷,然后与钼酸铵定磷试剂作用,生成蓝色成无机磷,然后与钼酸铵定磷试剂作用,生成蓝色的钼蓝。在一定浓度范围内,蓝色的深浅和磷含量的钼蓝。在一定浓度范围内,蓝色的深浅和磷含量成正比,可在成正比,可在660nm660nm比色测定。从磷的标准曲线可比色测定。从磷的标准曲线可知样品中磷的含量,从而求出核酸的含量。知样品中磷的含量,从而求出核酸的含量。楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国核糖和脱氧核糖的测定核糖和脱氧核糖的测定 RNARNA中核糖的测定用苔黑酚(中核糖的测定用苔黑酚(3 3,5-5-二羟甲苯)法,利二羟甲苯)
7、法,利用用RNARNA与浓盐酸和与浓盐酸和3 3,5-5-二羟甲苯作用生成绿色物质,二羟甲苯作用生成绿色物质,在在670 nm670 nm比色测得光吸收值。再从标准曲线中查得对比色测得光吸收值。再从标准曲线中查得对应的应的RNARNA的含量。的含量。DNADNA中脱氧核糖的测定用二苯胺法,利用中脱氧核糖的测定用二苯胺法,利用DNADNA在酸性条在酸性条件下(冰醋酸和少量浓硫酸)与二苯胺作用生成蓝色件下(冰醋酸和少量浓硫酸)与二苯胺作用生成蓝色化合物,在化合物,在595 nm595 nm比色测得光吸收值。再从标准曲线比色测得光吸收值。再从标准曲线中查得对应的中查得对应的DNADNA的含量。的含量
8、。楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国紫外吸收的测定紫外吸收的测定 实验室中最常用的是首先测定样实验室中最常用的是首先测定样品在品在260 nm260 nm和和280 nm280 nm的光吸收值(的光吸收值(A A值),从值),从A A260260A A280280的比值可判断样品的纯度。纯的比值可判断样品的纯度。纯DNADNA的的A A260260/A/A280280应为应为1.81.8,纯,纯RNARNA应为应为2.02.0。样品中如含有杂蛋白及苯酚,。样品中如含有杂蛋白及苯酚,A A260260/A/A280280比值即明显降低。不纯的样品不能用紫外吸比
9、值即明显降低。不纯的样品不能用紫外吸收法作定量测定。对于纯的样品,只要读出收法作定量测定。对于纯的样品,只要读出260mm260mm的的A A值即可算出含量。通常以值即可算出含量。通常以1A1A值相当于值相当于50g/mL50g/mL双螺旋双螺旋DNADNA或或40g/mL40g/mL单链单链DNADNA(或(或RNARNA)或)或20g/mL20g/mL寡核苷寡核苷酸计算。这个方法既快速,又准确,而且不会浪费样酸计算。这个方法既快速,又准确,而且不会浪费样品。品。楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国二、核酸的超速离心二、核酸的超速离心不同构象的核酸(线形、环
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