毒理学实验ppt讲解课件.ppt
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1、二、内容二、内容(一)实验动物的选择(一)实验动物的选择 1、物种的选择:啮齿类、非啮齿类、物种的选择:啮齿类、非啮齿类 基本原则:基本原则:代谢、生化、毒理学特征与人最接近的代谢、生化、毒理学特征与人最接近的 自然寿命不太长的自然寿命不太长的 易于饲养和实验操作的易于饲养和实验操作的 经济且易于获得的经济且易于获得的2、品系的选择:遗传学控制分类、品系的选择:遗传学控制分类 近交系:纯品系,近交系:纯品系,经至少连续20代的全同胞兄妹之间或亲代与子代之间交配培育而成的动物 杂交群:杂交群:F1代,代,两个不同近交系之间进行有计划的交配.杂交所产生的第一代动物,即F1代动物 封闭群:封闭群:5
2、年内,随机交配。年内,随机交配。一个种群动物位于固定地点,5年以上不从外部引进任何新种,仅在群内随机交配繁殖遗传均一性:遗传均一性:一种毒物固定使用同种品系一种毒物固定使用同种品系3、微生物学和寄生虫控制的选择、微生物学和寄生虫控制的选择 级:普通动物,开放系统饲养级:普通动物,开放系统饲养 级:清洁动物,屏障系统饲养级:清洁动物,屏障系统饲养 级:级:SPF动动,屏障动动,屏障/隔离系统饲养隔离系统饲养 级:无菌动物,隔离系统饲养级:无菌动物,隔离系统饲养4、个体选择、个体选择 性别:性别:年龄:急性、慢性年龄:急性、慢性以体重估计:组内、组间差异以体重估计:组内、组间差异 生理状态:雌生理
3、状态:雌-未产未孕,避免妊娠、激未产未孕,避免妊娠、激素影响素影响 健康状况:健康动物健康状况:健康动物健康动物辨认:健康动物辨认:l 健康动物辨认:外观体形丰满,被毛浓密有光泽、紧贴体表,眼健康动物辨认:外观体形丰满,被毛浓密有光泽、紧贴体表,眼睛明亮,行动迅速、反应灵活,食欲及营养状况良好。睛明亮,行动迅速、反应灵活,食欲及营养状况良好。(1)眼:明亮,瞳孔双侧等圆,无分泌物。眼:明亮,瞳孔双侧等圆,无分泌物。(2)耳,耳道无分泌物溢出,耳壳无脓疮。耳,耳道无分泌物溢出,耳壳无脓疮。(3)鼻:无喷嚏,无浆性粘液分泌物。鼻:无喷嚏,无浆性粘液分泌物。(4)皮肤:无创伤、无脓疮、疥癣、湿疹。皮
4、肤:无创伤、无脓疮、疥癣、湿疹。(5)颈部:要求颈项端正,如有歪斜提示可能存在内耳疾患,不颈部:要求颈项端正,如有歪斜提示可能存在内耳疾患,不应选作实验动物。应选作实验动物。(6)消化道:无呕吐、腹泻,粪便成形,肛门附近被毛洁净。消化道:无呕吐、腹泻,粪便成形,肛门附近被毛洁净。(7)神经系统:无震颤、麻痹。若动物神经系统:无震颤、麻痹。若动物(大鼠、小鼠大鼠、小鼠)出现圆圈动出现圆圈动作或提尾倒置呈圆圈摆应放弃该动物。作或提尾倒置呈圆圈摆应放弃该动物。(8)四肢及尾:四肢、趾及尾无红肿及溃疡。四肢及尾:四肢、趾及尾无红肿及溃疡。(二)动物性别鉴定(二)动物性别鉴定(1)大鼠、小鼠:主要依肛门
5、与生殖孔间的距离大鼠、小鼠:主要依肛门与生殖孔间的距离区分,间距大者为雄性,小者为雌性。成年雄鼠区分,间距大者为雄性,小者为雌性。成年雄鼠卧位可见到辜丸,雌性在腹部可见乳头。卧位可见到辜丸,雌性在腹部可见乳头。(2)豚鼠;用一只于抓住豚鼠颈部,另一只手扒豚鼠;用一只于抓住豚鼠颈部,另一只手扒开靠生殖器孔的皮肤,雄性动物在圆孔中露出性开靠生殖器孔的皮肤,雄性动物在圆孔中露出性器官的突起,雌性动物则显示三角形间隙,成年器官的突起,雌性动物则显示三角形间隙,成年雌性豚鼠胸部有两个乳头。雌性豚鼠胸部有两个乳头。(三)动物抓取(三)动物抓取 正确地抓取固定动物,既不损害动物健康、不影正确地抓取固定动物,
6、既不损害动物健康、不影响观察指标,又防止被动物咬伤响观察指标,又防止被动物咬伤(1)小鼠:先用右手抓取鼠尾提起,置于鼠笼或实小鼠:先用右手抓取鼠尾提起,置于鼠笼或实验台上向后拉,在其向前爬行时,用左手拇指和验台上向后拉,在其向前爬行时,用左手拇指和食指抓住小鼠的两耳和颈部皮肤,将鼠体置于左食指抓住小鼠的两耳和颈部皮肤,将鼠体置于左手心中,把后肢拉直,以无名指按住鼠尾,小指手心中,把后肢拉直,以无名指按住鼠尾,小指按住后腿即可。按住后腿即可。尾静脉注射时,可使用特殊的固定装置进行固定尾静脉注射时,可使用特殊的固定装置进行固定,如尾静脉注射架或如尾静脉注射架或粗的玻璃试管。如要进行手术或心脏采血应
7、先行麻醉再操作粗的玻璃试管。如要进行手术或心脏采血应先行麻醉再操作,如进行如进行解剖实验则必须先行无痛处死后再进行。解剖实验则必须先行无痛处死后再进行。(2)大鼠:大鼠的抓取基本同小鼠,只是大大鼠:大鼠的抓取基本同小鼠,只是大鼠比小鼠性情凶猛,不易用袭击方法抓取。鼠比小鼠性情凶猛,不易用袭击方法抓取。为避免咬伤,可带上帆布或棉纱手套。采为避免咬伤,可带上帆布或棉纱手套。采用左手固定法,用拇指和食指捏住鼠耳,用左手固定法,用拇指和食指捏住鼠耳,余下三指紧捏鼠背皮肤,置于左掌心中。余下三指紧捏鼠背皮肤,置于左掌心中。(3)豚鼠:豚鼠胆小易惊,在抓取时要稳、豚鼠:豚鼠胆小易惊,在抓取时要稳、准、迅速
8、。用手掌迅速扣住鼠背,抓住其准、迅速。用手掌迅速扣住鼠背,抓住其肩胛上方,以拇指和食指环握颈部,另一肩胛上方,以拇指和食指环握颈部,另一只手托住臀部即可。只手托住臀部即可。(4)兔:用右手抓住兔颈部的毛皮提起,然兔:用右手抓住兔颈部的毛皮提起,然后左手托住其臀部或腹部,让其体重的大后左手托住其臀部或腹部,让其体重的大部分重量集中在左手上。注意不要抓取双部分重量集中在左手上。注意不要抓取双耳或抓提腹部。耳或抓提腹部。(四)实验动物称重、编号、标记(四)实验动物称重、编号、标记n项圈项圈n耳缘孔口标记:耳缘孔口标记:n染色法:苦味酸、品红染色法:苦味酸、品红 耳缘孔口标记:耳缘孔口标记:用耳号钳在
9、耳上打洞或者用剪刀在耳边缘剪缺口,左耳为十位,右耳为个位。(五)动物随机分组:随机数字表(五)动物随机分组:随机数字表(六)染毒途径和方法(六)染毒途径和方法1.经口(胃肠道)染毒经口(胃肠道)染毒 喂饲:不易挥发、不易水解、无异味、不影响营养喂饲:不易挥发、不易水解、无异味、不影响营养 吞咽胶囊:吞咽胶囊:灌胃:灌前禁食空腹,不饮水,灌胃容积灌胃:灌前禁食空腹,不饮水,灌胃容积0.10.2ml/10g小鼠、大鼠或豚鼠:左手抓住鼠背部及颈部皮肤将动小鼠、大鼠或豚鼠:左手抓住鼠背部及颈部皮肤将动物固定,右手持注射器,将灌胃针插入动物口中,沿物固定,右手持注射器,将灌胃针插入动物口中,沿咽后壁徐徐
10、插入食管。针插入时应无阻力,若感到阻咽后壁徐徐插入食管。针插入时应无阻力,若感到阻力或动物挣扎,应立即停止进针或将针拔出,以免损力或动物挣扎,应立即停止进针或将针拔出,以免损伤或穿破食管及误入气管。伤或穿破食管及误入气管。2.经呼吸道染毒经呼吸道染毒 静式吸入静式吸入 动式吸入动式吸入 气管内注入气管内注入3.经皮肤染毒经皮肤染毒 斑贴法(家兔)斑贴法(家兔)被毛的去除:剪毛、拔毛、脱毛被毛的去除:剪毛、拔毛、脱毛 浸尾法(大、小鼠)浸尾法(大、小鼠)4.注射染毒:静脉注射、肌肉注射、腹腔注注射染毒:静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射、皮内注射射、皮下注射、皮内注射(七)生物标本采集(七)
11、生物标本采集 1.血液采集:血液采集:大、小鼠鼠尾采血法大、小鼠鼠尾采血法 眼眶静脉丛采血法眼眶静脉丛采血法 腹主动脉或股动腹主动脉或股动(静静)脉采血法脉采血法 断头采血法断头采血法 家兔耳缘静脉采血法家兔耳缘静脉采血法 心脏采血法心脏采血法动物品种动物品种最大安全采血量最大安全采血量(ml)最小致死采血量最小致死采血量(ml)小鼠小鼠0.10.3大鼠大鼠1.02.0豚鼠豚鼠5.010.0家兔家兔10.040.0(八)动物处死(八)动物处死1.脊椎脱臼法脊椎脱臼法2.断头法断头法3.急性大失血法急性大失血法4.击打法击打法5.麻醉致死法麻醉致死法6.麻醉后急性放血法麻醉后急性放血法7.空气栓
12、塞法空气栓塞法8.化学药物致死法化学药物致死法9.开放性气胸法开放性气胸法 阴性对照组:生理盐水阴性对照组:生理盐水 阳性对照组:环磷酰胺阳性对照组:环磷酰胺40-60mg/kg 高剂量组:敌敌畏高剂量组:敌敌畏20mg/kg 中剂量组:敌敌畏中剂量组:敌敌畏10mg/kg 低剂量组:敌敌畏低剂量组:敌敌畏5mg/kg一、目的一、目的 掌握掌握LD50 计算方法和急性毒性分级标准计算方法和急性毒性分级标准 熟悉经口灌胃技术熟悉经口灌胃技术 了解急性毒性试验的设计原则了解急性毒性试验的设计原则 急性毒性:一次或多次接触,短时间产生急性毒性:一次或多次接触,短时间产生的毒性效应,包括一般行为和外观
13、改变,的毒性效应,包括一般行为和外观改变,大体形态改变以及死亡效应等。大体形态改变以及死亡效应等。农药的急性毒性分级:低、中、高、剧毒农药的急性毒性分级:低、中、高、剧毒 改良寇氏法:改良寇氏法:计算简便,准确率高,常用计算简便,准确率高,常用 霍恩法霍恩法 序贯法序贯法 Bliss法法 每组动物数相等每组动物数相等 各剂量组组距呈等比级数各剂量组组距呈等比级数 死亡呈正态分布死亡呈正态分布 最低剂量组死亡最低剂量组死亡80%健康动物健康动物按体重随机分组按体重随机分组一次或多次一次或多次经口给药经口给药观察中毒特征或死亡观察中毒特征或死亡剂量剂量-反反应关系应关系求出求出LD50 毒性分级毒
14、性分级 动物:昆明种小白鼠动物:昆明种小白鼠 器材:注射器、灌胃针、见到、镊子、试器材:注射器、灌胃针、见到、镊子、试剂瓶、标签笔、移液枪等(课下交还)剂瓶、标签笔、移液枪等(课下交还)试剂:敌敌畏,苦味酸试剂:敌敌畏,苦味酸1.动物选择动物选择2.剂量设计:剂量设计:5-8个剂量(一般不设对照组)个剂量(一般不设对照组)3.动物称重、编号、标记动物称重、编号、标记4.受试物配制受试物配制5.灌胃:灌胃:0.1-0.2ml/10g体重体重6.观察:急性毒性试验原始记录观察:急性毒性试验原始记录n剂量设计:剂量设计:预实验:文献预实验:文献LD50=50-92mg/kg 设置设置400、200、
15、100、50、25mg/kg 五个剂量,每剂量五个剂量,每剂量3只鼠。只鼠。找出找出LD100和和LD0 组距组距i=(lgLD100-lgLD0)/(n-1)n是实验组数;是实验组数;i是正式实验中两个相邻剂量是正式实验中两个相邻剂量组的剂量对数之差组的剂量对数之差 A:lg200=2.301 B:lgx=2.301-i C:lgy=2.301-2i D:lgz=2.301-3i E:lgw=2.301-4i F:lg50=1.690n1:k系列稀释法系列稀释法 最大剂量组浓度最大剂量组浓度C1(母液浓度)(母液浓度)C1=200mg/kg=2mg/10g0.2ml/10g2mg/0.2ml
16、=10mg/ml 每组最大体积每组最大体积m=20ml(设每只鼠需(设每只鼠需2ml)k:相邻两组剂量之比:相邻两组剂量之比=64.89/85.981=0.75 V总总=m/(1-k)=81.53ml(各组母液和)(各组母液和)敌敌畏原液浓度:敌敌畏原液浓度:1400mg/ml 稀释成稀释成10mg/ml,81.53ml的母液的母液 1400mg/ml*Vx=10mg/ml*81.53ml Vx=0.582ml V水水=81.53-0.582l 第第1组组 20mll 第第2组组 剩余母液剩余母液+20ml水水混匀后取混匀后取20mll 以此类推以此类推5.LD50计算:计算:LD50及及95
17、%可信区间可信区间 m=Xk-i(p-0.5)m:lgLD50 i:相邻两剂量组对数值的差 Xk:最大剂量的对数值P:死亡率 q:存活率 n:每组动物数p=各剂量组死亡率总和五、评价:毒性分级、毒性特征五、评价:毒性分级、毒性特征六、讨论:六、讨论:确定化学物对哺乳动物皮肤局部是否有刺确定化学物对哺乳动物皮肤局部是否有刺激作用或腐蚀作用及其程度,为制定防护激作用或腐蚀作用及其程度,为制定防护化学物对皮肤的刺激保护措施提供依据。化学物对皮肤的刺激保护措施提供依据。皮肤刺激性皮肤刺激性(Dermal Irritation):皮:皮肤涂敷受试样品后局部产生的可逆性炎性肤涂敷受试样品后局部产生的可逆性
18、炎性变化。变化。皮肤腐蚀性皮肤腐蚀性(Dermal Corrosion):皮肤:皮肤涂敷受试样品后局部引起的不可逆组织损涂敷受试样品后局部引起的不可逆组织损伤。伤。将受试物一次将受试物一次(或多次或多次)涂敷于受试动物的涂敷于受试动物的皮肤上,在规定的时间间隔内,观察动物皮肤上,在规定的时间间隔内,观察动物皮肤局部刺激作用的程度并进行评分。皮肤局部刺激作用的程度并进行评分。采用自身对照,以评价受试物对皮肤的刺采用自身对照,以评价受试物对皮肤的刺激作用。急性皮肤刺激性试验观察期限应激作用。急性皮肤刺激性试验观察期限应足以评价该作用的可逆性或不可逆性。足以评价该作用的可逆性或不可逆性。强酸或强碱物
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