液相色谱分析课件.ppt
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- 色谱 分析 课件
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1、2022-8-4第第第第第第3 3 3 3 3 3章章章章章章高效液相色谱分析高效液相色谱分析高效液相色谱分析高效液相色谱分析高效液相色谱分析高效液相色谱分析一、一、高效液相色谱法高效液相色谱法 的特点的特点二、流程及主要部件二、流程及主要部件三、三、影响分离的因素影响分离的因素四、四、高效液相色谱法高效液相色谱法 的主要分离类型的主要分离类型High Performance liquid Chromatograph,HPLC 2022-8-4 高效液相色谱高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。按照固定是以溶剂液体为流动相的色谱方法。按照固定相不同可分为:液液分配色谱;液固吸
2、附色谱;离子交换色谱;排阻色相不同可分为:液液分配色谱;液固吸附色谱;离子交换色谱;排阻色谱谱(凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱)等,应用非常广泛。等,应用非常广泛。早期液相色谱,包括早期液相色谱,包括Tswett的工作,都是在直径的工作,都是在直径15cm,长长0.55 m的的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速,填充的固定相颗粒直径多在玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速,填充的固定相颗粒直径多在150200 m范围内。即使这样,范围内。即使这样,流速仍然很低流速仍然很低(7时,该检测器不够灵敏。时,该检测器不够灵敏。4.4.4.电导检测器电导检测器电导检测器电导检测器电导检测器电导检测器(ele
3、ctrical conductivity detectorelectrical conductivity detectorelectrical conductivity detector)2022-8-4 在高效液相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/U较小,可以忽略不计,而只有两项,即:H=A+C u 如图所示:Hu曲线是一段斜率不大的直线。而在高的流动相流速下不致于使柱效损失太大,所以在实际操作中,流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要参数。流速大于流速大于0.5 cm/s时时,降低流速,柱效提高不是很大。3 3-2 -2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素影响色谱峰扩展及色谱分离的因素2022
4、-8-4A A A 涡流扩散项涡流扩散项涡流扩散项涡流扩散项涡流扩散项涡流扩散项 A=2dp dp:固定相的平均颗粒直径固定相的平均颗粒直径 :固定相的填充不均匀因子固定相的填充不均匀因子C C Cu u u 传质阻力项传质阻力项传质阻力项传质阻力项传质阻力项传质阻力项传质阻力包括固定相传质阻力传质阻力包括固定相传质阻力Cs和流动相传质阻力和流动相传质阻力Cm(包包 括在流动的流动相中的传质和滞留的流动相中的传质括在流动的流动相中的传质和滞留的流动相中的传质):C=(Cs+Cm+Csm)uDdCuDdCuDdCdHHHAHsmpsmmpmsfspsmms2222柱内色谱峰展宽引起柱内色谱峰展宽
5、引起H的变化:的变化:2022-8-4 影响色谱峰扩展的因素除此之外,还有柱外展宽的影响:影响色谱峰扩展的因素除此之外,还有柱外展宽的影响:影响色谱峰扩展的因素除此之外,还有柱外展宽的影响:柱前展宽柱前展宽柱前展宽:由进样引起。若将试样直接注入到色谱柱顶端填由进样引起。若将试样直接注入到色谱柱顶端填由进样引起。若将试样直接注入到色谱柱顶端填 料中心点,或注入到填料中心之内料中心点,或注入到填料中心之内料中心点,或注入到填料中心之内1-21-21-2mmmmmm处,可减小柱前处,可减小柱前处,可减小柱前 展宽,提高柱效。展宽,提高柱效。展宽,提高柱效。柱后展宽柱后展宽柱后展宽:由接管,检测器流通
6、池的死体积所引起由接管,检测器流通池的死体积所引起由接管,检测器流通池的死体积所引起。提高液相色谱的分离效率:装填柱子要均匀,填料粒度要小;选用低粘度的流动相或适当提高柱温以降低流动相粘度,有利于提高传质速率;在高的流动相流速下不致于使柱效损失太大,有利于实现快速分离。2022-8-4一、液一、液液分配色谱液分配色谱1.原理原理 根据各待测物在互不相溶的液体中溶解度不同,具有不根据各待测物在互不相溶的液体中溶解度不同,具有不同的分配系数。在色谱柱中,随着流动相的移动,这种分同的分配系数。在色谱柱中,随着流动相的移动,这种分配平衡需进行多次,造成各待测物的迁移速率不同,从而配平衡需进行多次,造成
7、各待测物的迁移速率不同,从而实现分离的过程。实现分离的过程。3 3-3-3 高效液相色谱的主要类型及分离原理高效液相色谱的主要类型及分离原理按分离原理,按分离原理,HPLCHPLC分离的主要类型?分离的主要类型?用于各种样品类型的分离和分析,无论是极性的和非极用于各种样品类型的分离和分析,无论是极性的和非极性的,水溶性和油溶性的,离子型的和非离子型的化合物。性的,水溶性和油溶性的,离子型的和非离子型的化合物。2.2.应用应用2022-8-43.固定相固定相 液液色谱的固定相选择较简单,常用的只有几种,如液液色谱的固定相选择较简单,常用的只有几种,如,-氧二丙腈氧二丙腈、聚乙二醇聚乙二醇、十八烷
8、十八烷(C18)、角鲨烷角鲨烷。固定相涂渍方法固定相涂渍方法:1)机械涂渍固定相:)机械涂渍固定相:将固定液通过机械混合的方法涂渍到表面多孔型将固定液通过机械混合的方法涂渍到表面多孔型(0.5-1.5%涂布量涂布量)或全多孔型载体上或全多孔型载体上(5-10%涂布量涂布量)。该种固定相最大的不足是固定液易流失、分离稳定性及该种固定相最大的不足是固定液易流失、分离稳定性及重现性差,不适合梯度淋洗。重现性差,不适合梯度淋洗。如何减少固定液的流失?如何减少固定液的流失?在柱前加一根很短的在柱前加一根很短的前置柱前置柱(该柱涂有与分析柱相同但有更高含量的该柱涂有与分析柱相同但有更高含量的固定液,使流动
9、相进入分析柱之前,预先被固定液饱和固定液,使流动相进入分析柱之前,预先被固定液饱和)或或将固定液健合将固定液健合到载体上到载体上。机械涂渍型和化学键合型。机械涂渍型和化学键合型。2022-8-42)化学键合固定相)化学键合固定相 通过化学反应将各种不同的有机基团键合到载体通过化学反应将各种不同的有机基团键合到载体(硅胶硅胶)表面所形成的柱填充剂,具有稳定、流失小、适于梯度淋洗表面所形成的柱填充剂,具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点。等特点。这种固定相分离机理:液液分配?这种固定相分离机理:液液分配?双重分离机制,即液液分配双重分离机制,即液液分配+吸附吸附 取决于化学键合的表面覆盖率。取决于
10、化学键合的表面覆盖率。高覆盖率:液液分配为主;低覆盖率:吸附为主。高覆盖率:液液分配为主;低覆盖率:吸附为主。化学键合固定相的类型:化学键合固定相的类型:2022-8-4化学键合固定相类型化学键合固定相类型化学键合固定相类型化学键合固定相类型化学键合固定相类型化学键合固定相类型 a.硅氧碳键型:硅氧碳键型:SiOC Si0HROHSiORH20 b.硅氧硅碳键型:硅氧硅碳键型:SiOSi C 稳定,耐水、耐光、耐有机溶剂,应用最广稳定,耐水、耐光、耐有机溶剂,应用最广;c.硅碳键型:硅碳键型:SiC d.硅氮键型:硅氮键型:SiN2022-8-44.流动相流动相:在液液色谱中,为防止固定相的流
11、失,流动相液体与固在液液色谱中,为防止固定相的流失,流动相液体与固定液应尽量不互溶,或者说二者的极性相差越大越好。因此,定液应尽量不互溶,或者说二者的极性相差越大越好。因此,根据流动相与固定相极性的差别程度,可将液液色谱分为根据流动相与固定相极性的差别程度,可将液液色谱分为正正相分配色谱相分配色谱(流动相极性小于固定相极性,极性小的先流出,(流动相极性小于固定相极性,极性小的先流出,适于极性组分分离)和适于极性组分分离)和反相分配色谱反相分配色谱(流动相极性大于固定(流动相极性大于固定相极性,极性大的先流出,适于非极性组分分离)。相极性,极性大的先流出,适于非极性组分分离)。反相健合相色谱法反
12、相健合相色谱法固定相固定相:硅胶一硅胶一C18H37、硅胶一苯基等、硅胶一苯基等流动相流动相:甲醇甲醇乙睛一水、水乙睛一水、水+无机盐无机盐buf溶液等溶液等正相健合相色谱法正相健合相色谱法固定相固定相:硅胶一硅胶一OH、硅胶一、硅胶一CN等等流动相流动相:正已烷中加入适量极性溶剂正已烷中加入适量极性溶剂,如氯仿如氯仿醇等醇等2022-8-4正相色谱正相色谱低极性流动相低极性流动相反相色谱反相色谱高极性流动相高极性流动相中等极性流动相中等极性流动相中等极性流动相中等极性流动相时间时间时间时间时间时间时间时间待测物极性:待测物极性:ABC正、反相色谱中极性和保留时间的关系正、反相色谱中极性和保留
13、时间的关系2022-8-4二、液固吸附色谱二、液固吸附色谱固定相固定相:固体吸附剂,如硅胶、氧化铝等,粒度固体吸附剂,如硅胶、氧化铝等,粒度510 m。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。作用机理作用机理:根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。:根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。当流动相进入色谱柱后,它以单分子层当流动相进入色谱柱后,它以单分子层S形式占据吸附剂上的活性中形式占据吸附剂上的活性中心点,当试样分子心点,当试样分子X进入色谱柱后,在迁移过程中,与流动相分子在固进入色谱柱后,在迁移过程中,与流动相分子在固定相表面发生
14、竞争吸附反应:定相表面发生竞争吸附反应:这种竞争吸附达平衡时,吸附的分配系数这种竞争吸附达平衡时,吸附的分配系数K为:为:K越大,溶质分子的吸附性强,保留值大。越大,溶质分子的吸附性强,保留值大。应用:相对分子质量中等的油溶性样品,不同官能团化合物、异构体。应用:相对分子质量中等的油溶性样品,不同官能团化合物、异构体。2022-8-4三、离子对色谱法(三、离子对色谱法(IPC)离子对色谱主要用来分离强极性有机酸和有机碱。离子对色谱主要用来分离强极性有机酸和有机碱。原理:原理:有机相水相水相YXYX 例如:固定相为非极性键合相,流动相为水溶液,于流例如:固定相为非极性键合相,流动相为水溶液,于流
15、 动相中加入与待测离子动相中加入与待测离子X+有相反电荷的离子有相反电荷的离子Y-:将一种将一种(或数种或数种)与溶质离子电荷相反的离子与溶质离子电荷相反的离子(对离子对离子)加到流动相或固定相中,使其与溶质离子结合形成离子加到流动相或固定相中,使其与溶质离子结合形成离子对,从而控制溶质离子保留行为的一种色谱法。对,从而控制溶质离子保留行为的一种色谱法。用于阴离子分离的对离子有氢氧化四丁基铵,氢氧化十六烷用于阴离子分离的对离子有氢氧化四丁基铵,氢氧化十六烷基三甲铵;用于阳离子的对离子有已烷磺酸钠。基三甲铵;用于阳离子的对离子有已烷磺酸钠。2022-8-4 可以通过改变对离子的浓度和种类,流动相
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