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类型液相色谱分析课件.ppt

  • 上传人(卖家):三亚风情
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    关 键  词:
    色谱 分析 课件
    资源描述:

    1、2022-8-4第第第第第第3 3 3 3 3 3章章章章章章高效液相色谱分析高效液相色谱分析高效液相色谱分析高效液相色谱分析高效液相色谱分析高效液相色谱分析一、一、高效液相色谱法高效液相色谱法 的特点的特点二、流程及主要部件二、流程及主要部件三、三、影响分离的因素影响分离的因素四、四、高效液相色谱法高效液相色谱法 的主要分离类型的主要分离类型High Performance liquid Chromatograph,HPLC 2022-8-4 高效液相色谱高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。按照固定是以溶剂液体为流动相的色谱方法。按照固定相不同可分为:液液分配色谱;液固吸

    2、附色谱;离子交换色谱;排阻色相不同可分为:液液分配色谱;液固吸附色谱;离子交换色谱;排阻色谱谱(凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱)等,应用非常广泛。等,应用非常广泛。早期液相色谱,包括早期液相色谱,包括Tswett的工作,都是在直径的工作,都是在直径15cm,长长0.55 m的的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速,填充的固定相颗粒直径多在玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速,填充的固定相颗粒直径多在150200 m范围内。即使这样,范围内。即使这样,流速仍然很低流速仍然很低(7时,该检测器不够灵敏。时,该检测器不够灵敏。4.4.4.电导检测器电导检测器电导检测器电导检测器电导检测器电导检测器(ele

    3、ctrical conductivity detectorelectrical conductivity detectorelectrical conductivity detector)2022-8-4 在高效液相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/U较小,可以忽略不计,而只有两项,即:H=A+C u 如图所示:Hu曲线是一段斜率不大的直线。而在高的流动相流速下不致于使柱效损失太大,所以在实际操作中,流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要参数。流速大于流速大于0.5 cm/s时时,降低流速,柱效提高不是很大。3 3-2 -2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素影响色谱峰扩展及色谱分离的因素2022

    4、-8-4A A A 涡流扩散项涡流扩散项涡流扩散项涡流扩散项涡流扩散项涡流扩散项 A=2dp dp:固定相的平均颗粒直径固定相的平均颗粒直径 :固定相的填充不均匀因子固定相的填充不均匀因子C C Cu u u 传质阻力项传质阻力项传质阻力项传质阻力项传质阻力项传质阻力项传质阻力包括固定相传质阻力传质阻力包括固定相传质阻力Cs和流动相传质阻力和流动相传质阻力Cm(包包 括在流动的流动相中的传质和滞留的流动相中的传质括在流动的流动相中的传质和滞留的流动相中的传质):C=(Cs+Cm+Csm)uDdCuDdCuDdCdHHHAHsmpsmmpmsfspsmms2222柱内色谱峰展宽引起柱内色谱峰展宽

    5、引起H的变化:的变化:2022-8-4 影响色谱峰扩展的因素除此之外,还有柱外展宽的影响:影响色谱峰扩展的因素除此之外,还有柱外展宽的影响:影响色谱峰扩展的因素除此之外,还有柱外展宽的影响:柱前展宽柱前展宽柱前展宽:由进样引起。若将试样直接注入到色谱柱顶端填由进样引起。若将试样直接注入到色谱柱顶端填由进样引起。若将试样直接注入到色谱柱顶端填 料中心点,或注入到填料中心之内料中心点,或注入到填料中心之内料中心点,或注入到填料中心之内1-21-21-2mmmmmm处,可减小柱前处,可减小柱前处,可减小柱前 展宽,提高柱效。展宽,提高柱效。展宽,提高柱效。柱后展宽柱后展宽柱后展宽:由接管,检测器流通

    6、池的死体积所引起由接管,检测器流通池的死体积所引起由接管,检测器流通池的死体积所引起。提高液相色谱的分离效率:装填柱子要均匀,填料粒度要小;选用低粘度的流动相或适当提高柱温以降低流动相粘度,有利于提高传质速率;在高的流动相流速下不致于使柱效损失太大,有利于实现快速分离。2022-8-4一、液一、液液分配色谱液分配色谱1.原理原理 根据各待测物在互不相溶的液体中溶解度不同,具有不根据各待测物在互不相溶的液体中溶解度不同,具有不同的分配系数。在色谱柱中,随着流动相的移动,这种分同的分配系数。在色谱柱中,随着流动相的移动,这种分配平衡需进行多次,造成各待测物的迁移速率不同,从而配平衡需进行多次,造成

    7、各待测物的迁移速率不同,从而实现分离的过程。实现分离的过程。3 3-3-3 高效液相色谱的主要类型及分离原理高效液相色谱的主要类型及分离原理按分离原理,按分离原理,HPLCHPLC分离的主要类型?分离的主要类型?用于各种样品类型的分离和分析,无论是极性的和非极用于各种样品类型的分离和分析,无论是极性的和非极性的,水溶性和油溶性的,离子型的和非离子型的化合物。性的,水溶性和油溶性的,离子型的和非离子型的化合物。2.2.应用应用2022-8-43.固定相固定相 液液色谱的固定相选择较简单,常用的只有几种,如液液色谱的固定相选择较简单,常用的只有几种,如,-氧二丙腈氧二丙腈、聚乙二醇聚乙二醇、十八烷

    8、十八烷(C18)、角鲨烷角鲨烷。固定相涂渍方法固定相涂渍方法:1)机械涂渍固定相:)机械涂渍固定相:将固定液通过机械混合的方法涂渍到表面多孔型将固定液通过机械混合的方法涂渍到表面多孔型(0.5-1.5%涂布量涂布量)或全多孔型载体上或全多孔型载体上(5-10%涂布量涂布量)。该种固定相最大的不足是固定液易流失、分离稳定性及该种固定相最大的不足是固定液易流失、分离稳定性及重现性差,不适合梯度淋洗。重现性差,不适合梯度淋洗。如何减少固定液的流失?如何减少固定液的流失?在柱前加一根很短的在柱前加一根很短的前置柱前置柱(该柱涂有与分析柱相同但有更高含量的该柱涂有与分析柱相同但有更高含量的固定液,使流动

    9、相进入分析柱之前,预先被固定液饱和固定液,使流动相进入分析柱之前,预先被固定液饱和)或或将固定液健合将固定液健合到载体上到载体上。机械涂渍型和化学键合型。机械涂渍型和化学键合型。2022-8-42)化学键合固定相)化学键合固定相 通过化学反应将各种不同的有机基团键合到载体通过化学反应将各种不同的有机基团键合到载体(硅胶硅胶)表面所形成的柱填充剂,具有稳定、流失小、适于梯度淋洗表面所形成的柱填充剂,具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点。等特点。这种固定相分离机理:液液分配?这种固定相分离机理:液液分配?双重分离机制,即液液分配双重分离机制,即液液分配+吸附吸附 取决于化学键合的表面覆盖率。取决于

    10、化学键合的表面覆盖率。高覆盖率:液液分配为主;低覆盖率:吸附为主。高覆盖率:液液分配为主;低覆盖率:吸附为主。化学键合固定相的类型:化学键合固定相的类型:2022-8-4化学键合固定相类型化学键合固定相类型化学键合固定相类型化学键合固定相类型化学键合固定相类型化学键合固定相类型 a.硅氧碳键型:硅氧碳键型:SiOC Si0HROHSiORH20 b.硅氧硅碳键型:硅氧硅碳键型:SiOSi C 稳定,耐水、耐光、耐有机溶剂,应用最广稳定,耐水、耐光、耐有机溶剂,应用最广;c.硅碳键型:硅碳键型:SiC d.硅氮键型:硅氮键型:SiN2022-8-44.流动相流动相:在液液色谱中,为防止固定相的流

    11、失,流动相液体与固在液液色谱中,为防止固定相的流失,流动相液体与固定液应尽量不互溶,或者说二者的极性相差越大越好。因此,定液应尽量不互溶,或者说二者的极性相差越大越好。因此,根据流动相与固定相极性的差别程度,可将液液色谱分为根据流动相与固定相极性的差别程度,可将液液色谱分为正正相分配色谱相分配色谱(流动相极性小于固定相极性,极性小的先流出,(流动相极性小于固定相极性,极性小的先流出,适于极性组分分离)和适于极性组分分离)和反相分配色谱反相分配色谱(流动相极性大于固定(流动相极性大于固定相极性,极性大的先流出,适于非极性组分分离)。相极性,极性大的先流出,适于非极性组分分离)。反相健合相色谱法反

    12、相健合相色谱法固定相固定相:硅胶一硅胶一C18H37、硅胶一苯基等、硅胶一苯基等流动相流动相:甲醇甲醇乙睛一水、水乙睛一水、水+无机盐无机盐buf溶液等溶液等正相健合相色谱法正相健合相色谱法固定相固定相:硅胶一硅胶一OH、硅胶一、硅胶一CN等等流动相流动相:正已烷中加入适量极性溶剂正已烷中加入适量极性溶剂,如氯仿如氯仿醇等醇等2022-8-4正相色谱正相色谱低极性流动相低极性流动相反相色谱反相色谱高极性流动相高极性流动相中等极性流动相中等极性流动相中等极性流动相中等极性流动相时间时间时间时间时间时间时间时间待测物极性:待测物极性:ABC正、反相色谱中极性和保留时间的关系正、反相色谱中极性和保留

    13、时间的关系2022-8-4二、液固吸附色谱二、液固吸附色谱固定相固定相:固体吸附剂,如硅胶、氧化铝等,粒度固体吸附剂,如硅胶、氧化铝等,粒度510 m。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。作用机理作用机理:根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。:根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。当流动相进入色谱柱后,它以单分子层当流动相进入色谱柱后,它以单分子层S形式占据吸附剂上的活性中形式占据吸附剂上的活性中心点,当试样分子心点,当试样分子X进入色谱柱后,在迁移过程中,与流动相分子在固进入色谱柱后,在迁移过程中,与流动相分子在固定相表面发生

    14、竞争吸附反应:定相表面发生竞争吸附反应:这种竞争吸附达平衡时,吸附的分配系数这种竞争吸附达平衡时,吸附的分配系数K为:为:K越大,溶质分子的吸附性强,保留值大。越大,溶质分子的吸附性强,保留值大。应用:相对分子质量中等的油溶性样品,不同官能团化合物、异构体。应用:相对分子质量中等的油溶性样品,不同官能团化合物、异构体。2022-8-4三、离子对色谱法(三、离子对色谱法(IPC)离子对色谱主要用来分离强极性有机酸和有机碱。离子对色谱主要用来分离强极性有机酸和有机碱。原理:原理:有机相水相水相YXYX 例如:固定相为非极性键合相,流动相为水溶液,于流例如:固定相为非极性键合相,流动相为水溶液,于流

    15、 动相中加入与待测离子动相中加入与待测离子X+有相反电荷的离子有相反电荷的离子Y-:将一种将一种(或数种或数种)与溶质离子电荷相反的离子与溶质离子电荷相反的离子(对离子对离子)加到流动相或固定相中,使其与溶质离子结合形成离子加到流动相或固定相中,使其与溶质离子结合形成离子对,从而控制溶质离子保留行为的一种色谱法。对,从而控制溶质离子保留行为的一种色谱法。用于阴离子分离的对离子有氢氧化四丁基铵,氢氧化十六烷用于阴离子分离的对离子有氢氧化四丁基铵,氢氧化十六烷基三甲铵;用于阳离子的对离子有已烷磺酸钠。基三甲铵;用于阳离子的对离子有已烷磺酸钠。2022-8-4 可以通过改变对离子的浓度和种类,流动相

    16、的可以通过改变对离子的浓度和种类,流动相的pH值从值从而改变分离的选择性,解决难分离混合物的分离问题。而改变分离的选择性,解决难分离混合物的分离问题。思考题:思考题:有一强极性有机酸混合物,若用离子对色谱法分离,请有一强极性有机酸混合物,若用离子对色谱法分离,请问在流动相中应加入阴离子还是阳离子来形成离子对?问在流动相中应加入阴离子还是阳离子来形成离子对?有机相水相水相YXYX平衡常数平衡常数 KXY为为:水相水相有机相YXYXKXY 根据分配系数的定义,溶质的分配系数根据分配系数的定义,溶质的分配系数 D为:为:水相水相有机相YKXYXDXY2022-8-4 IEC是基于离子交换树脂上可解离

    17、的离子与流是基于离子交换树脂上可解离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换。动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换。利利用不同待测离子对固定相的亲和能力(或离子交换用不同待测离子对固定相的亲和能力(或离子交换能力)的差别来实现分离的。能力)的差别来实现分离的。四、离子交换色谱(四、离子交换色谱(IEC)1.原理原理 凡在溶液中能够电离的物质,都可用离子交换色谱法凡在溶液中能够电离的物质,都可用离子交换色谱法进行分离。它不仅适用无机离子混合物的分离,亦可用于进行分离。它不仅适用无机离子混合物的分离,亦可用于有机物的分离,例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。有机物的分离,例如氨基酸

    18、、核酸、蛋白质等生物大分子。2.应用应用2022-8-43.固定相固定相 作为固定相的离子交换剂,其基质大致有三大类:合成作为固定相的离子交换剂,其基质大致有三大类:合成树脂(聚苯乙烯)、纤维素和硅胶。树脂(聚苯乙烯)、纤维素和硅胶。离子交换剂有阳离子交换剂和阴离子交换剂。离子交换剂有阳离子交换剂和阴离子交换剂。2022-8-4一般形式:R一AB RBA 对于典型的磺酸型阳离子交换树脂,一价离子的对树脂的亲和力大小顺序为:Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li+二价离子的顺序为:Ba2+Pb2+Sr2+Ca2+Cd2+Cu2+,Zn2+Mg2+对于季铵型阴离子交换树指,阴离子的选择性顺序为:C

    19、lO4-I-HS04-SCN-NO2-Br-CN-Cl-BrO3-OH-HCO3-IO3-CH3COO-F-4.流动相流动相 盐类缓冲溶液(有一定盐类缓冲溶液(有一定pH和离子强度)。通过改变流和离子强度)。通过改变流动相中盐离子的种类、浓度和动相中盐离子的种类、浓度和pH值可控制值可控制k值,改变选择性。值,改变选择性。2022-8-4 由于离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到限制。由于离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到限制。例如,对于不能用紫外检测的被测离子,如采用电导检测器,例如,对于不能用紫外检测的被测离子,如采用电导检测器,由于被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景电导

    20、信由于被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景电导信号掩没而无法检测。号掩没而无法检测。例如:分析阴离子时,则发生下列反应:例如:分析阴离子时,则发生下列反应:R+OH+NaBr R+Br-+NaOH流动相的高背景电导如何转化成低的背景电导?流动相的高背景电导如何转化成低的背景电导?RH+NaOH RNa+H2ORH+NaBr(待测物待测物)RNa+HBr五、离子色谱五、离子色谱 离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。法。2022-8-4 RH+NaOH RNa+H2O RH+NaBr(待测物待测物)RNa+HBr 由反应可见:经

    21、抑制柱后,一方面将大量碱转变为电导由反应可见:经抑制柱后,一方面将大量碱转变为电导很小的水,消除了流动相本底电导的影响。同时,又将样品很小的水,消除了流动相本底电导的影响。同时,又将样品阳离子阳离子Br-转变成相应的酸转变成相应的酸HBr,提高了,提高了检测灵敏度。检测灵敏度。在分离柱后加一个抑制柱的离子色谱称为在分离柱后加一个抑制柱的离子色谱称为抑制型离子色抑制型离子色谱或称双柱离子色谱。谱或称双柱离子色谱。由于抑制柱要定期再生,而且谱带在由于抑制柱要定期再生,而且谱带在通过抑制柱后会加宽,降低了分离度。后来,通过抑制柱后会加宽,降低了分离度。后来,Frits等人提出等人提出采用电导率极低的

    22、流动相溶液,例如用采用电导率极低的流动相溶液,例如用110-4510-4mol/L苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐的稀溶液作流动相,称为苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐的稀溶液作流动相,称为非抑制型非抑制型离子色谱或单柱离子色谱。离子色谱或单柱离子色谱。2022-8-4六、空间排阻色谱法六、空间排阻色谱法 又称凝胶色谱法,主要用于大分子的分离。分为又称凝胶色谱法,主要用于大分子的分离。分为1.分离原理分离原理 凝胶渗透色谱法凝胶渗透色谱法:以有机溶剂作流动相,多用于高分子领域,以有机溶剂作流动相,多用于高分子领域,测定聚合物分子量分布或跟踪聚合物合成、降解反应。测定聚合物分子量分布或跟踪聚合物合成、降解反应。凝胶

    23、过滤色谱法凝胶过滤色谱法:以水或水溶液为流动相,多用于生化领域以水或水溶液为流动相,多用于生化领域分离天然高分子。分离天然高分子。固定相为化学惰性的多孔凝胶,它类似于分子筛,但孔固定相为化学惰性的多孔凝胶,它类似于分子筛,但孔径更大。凝胶内有一定大小的空穴,体积大的待测物分子不径更大。凝胶内有一定大小的空穴,体积大的待测物分子不能渗透到孔穴中去而被排阻,较早地被淋洗出来;中等体积能渗透到孔穴中去而被排阻,较早地被淋洗出来;中等体积的分子部分渗透;小分子可完全渗透入内,最后洗出色谱柱。的分子部分渗透;小分子可完全渗透入内,最后洗出色谱柱。这样,样品分子基本上按其分子大小,先后由柱中流出。其这样,

    24、样品分子基本上按其分子大小,先后由柱中流出。其分离示意图为:分离示意图为:2022-8-4 2.2.特点特点 (1 1)保留时间是分子尺寸的函数;)保留时间是分子尺寸的函数;(2 2)保留时间短,谱峰窄,易检测;)保留时间短,谱峰窄,易检测;(3 3)固定相与分子间作用力极弱,趋于零。因此柱寿命长。)固定相与分子间作用力极弱,趋于零。因此柱寿命长。(4 4)不能分辨分子大小相近的化合物,相对分子质量差别)不能分辨分子大小相近的化合物,相对分子质量差别 必须大于必须大于1010才能得以分离。才能得以分离。2022-8-4 对流动相的要求:能溶解样品且与凝胶相似对流动相的要求:能溶解样品且与凝胶相

    25、似(润湿凝胶润湿凝胶)、粘度小粘度小(增加扩散速度增加扩散速度)。常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿和水等。氯仿和水等。3.固定相固定相4.流动相流动相2022-8-41 1根据相对分子质量选择根据相对分子质量选择 相对分子质量十分低的样品,其挥发性好,适用于气相对分子质量十分低的样品,其挥发性好,适用于气相色谱。标准液相色谱类型(液一固、液一液、及离子交相色谱。标准液相色谱类型(液一固、液一液、及离子交换色谱)最适合的相对分子质量范围是换色谱)最适合的相对分子质量范围是20O20O20002000。对于相对于相对分子质量大于对分子质量大于20002000的样品,

    26、用排阻色谱法为最佳。的样品,用排阻色谱法为最佳。2 2根据样品溶解度选择根据样品溶解度选择 弄清样品在水、异辛烷、苯、四氯化碳、异丙醇中的弄清样品在水、异辛烷、苯、四氯化碳、异丙醇中的溶解度。如果样品可溶于水且能离解,采用离子交换色谱溶解度。如果样品可溶于水且能离解,采用离子交换色谱为佳;如样品可溶于烃类为佳;如样品可溶于烃类(如苯或异辛烷如苯或异辛烷),则可采,则可采用液一用液一固吸附色谱;如样品溶解于四氯化碳,则多采用常规的分固吸附色谱;如样品溶解于四氯化碳,则多采用常规的分配和吸附色谱分离;如样品既溶于水又溶于异丙醇时,常配和吸附色谱分离;如样品既溶于水又溶于异丙醇时,常用水和异丙醇的混

    27、合液作液一液分配色谱的流动相,以憎用水和异丙醇的混合液作液一液分配色谱的流动相,以憎水性化合物作固定相。水性化合物作固定相。3 3-7-7 高效液相色谱分离类型的选择高效液相色谱分离类型的选择2022-8-43根据分子结构选择根据分子结构选择 用红外光谱法,可预先简单地判断样品中存在什么官能用红外光谱法,可预先简单地判断样品中存在什么官能团。然后,确定采用什么方法合适。例如团。然后,确定采用什么方法合适。例如:酸、碱化合物用酸、碱化合物用离子交换色谱;脂肪族或芳香族用液一液分配色谱、液一固离子交换色谱;脂肪族或芳香族用液一液分配色谱、液一固吸附色谱;异构体用液一固吸附色谱;同系物不同官能团及吸

    28、附色谱;异构体用液一固吸附色谱;同系物不同官能团及强氢键的用液一液分配色谱。强氢键的用液一液分配色谱。现列出表现列出表3-3作为选择分离类型的参考。作为选择分离类型的参考。2022-8-4 表表 3-3 3-3 液相色谱分离类型选择参考表液相色谱分离类型选择参考表 相对分子质量相对分子质量 溶于水溶于水排阻色谱,水为流动相排阻色谱,水为流动相 2000 不溶于水不溶于水排阻色谱,非水流动相排阻色谱,非水流动相 同系物同系物分配色谱分配色谱 不溶于水不溶于水 异构体异构体吸附色谱吸附色谱样品样品 分子大小差异分子大小差异排阻色谱排阻色谱 反相液一液色谱反相液一液色谱 相对分子质量相对分子质量 溶

    29、于水,不离解溶于水,不离解 2000 排阻色谱,水为流动相排阻色谱,水为流动相 碱碱阳离子交换色谱阳离子交换色谱 溶于水,可离解溶于水,可离解 酸酸阴离子交换色谱阴离子交换色谱 溶于水,离子与非离子溶于水,离子与非离子 反相离子对色谱反相离子对色谱 2022-8-41.1.环境中有机氯农药残留量分析环境中有机氯农药残留量分析 3 3-8-8 高效液相色谱法应用实例高效液相色谱法应用实例固定相:薄壳型硅胶固定相:薄壳型硅胶(37 50 m)流动相:正己烷流动相:正己烷流流 速:速:1.5 mL/min色谱柱:色谱柱:50cm 2.5mm(内径内径)检测器:差示折光检测器检测器:差示折光检测器样品

    30、性质?样品性质?分离类型?分离类型?油溶性、异构体油溶性、异构体液固色谱,或正相反相色谱液固色谱,或正相反相色谱液固色谱分析条件?液固色谱分析条件?2022-8-4 稠环芳烃多为致癌物质,能溶于水、甲醇、苯稠环芳烃多为致癌物质,能溶于水、甲醇、苯 固定相固定相:十八烷基硅烷化键合相十八烷基硅烷化键合相 流动相:流动相:20%甲醇甲醇-水水100%甲甲 醇,线性梯度淋洗,醇,线性梯度淋洗,2%/min 流流 速:速:1mL/min 柱柱 温:温:50 C 柱柱 压:压:70 104 Pa 检测器:紫外或荧光检测器检测器:紫外或荧光检测器2.2.稠环芳烃的分析稠环芳烃的分析 样品性质?样品性质?分离类型?分离类型?反相色谱反相色谱分析条件?分析条件?2022-8-4作业作业作业 p109 3、5

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