流式细胞仪课件.ppt

1、 大道至简.至经至卓国内白血病国内白血病免疫免疫分型的现状分型的现状四色两步法（四色两步法（急性白血病免疫分型的中急性白血病免疫分型的中国专家共识国专家共识）BDBD四色一步法四色一步法Part1Part2Part3CONTENTS国内流式用于白血病免疫分型的现状国内流式用于白血病免疫分型的现状 开展医院不断增多：专科特色开展医院不断增多：专科特色-综合性医院综合性医院 应用抗体应用抗体数量和数量和种类差异较大种类差异较大：影响疾病的：影响疾病的诊断、分期和预诊断、分期和预后的后的判断判断 从业人员的经验有较大差异；从业人员的经验有较大差异；44色色流式白血病免疫色色流式白血病免疫分分型是发展

2、的趋势，但四色仍然是基型是发展的趋势，但四色仍然是基础。础。44色色操作操作和分析更复杂和分析更复杂，临床经验，临床经验要求更要求更高；高；国家卫计委加强对诊断试剂的监管：国家卫计委加强对诊断试剂的监管：要求使用有要求使用有CFDACFDA注册证注册证的试剂用于疾病诊断的试剂用于疾病诊断；调研结果：调研结果：国内国内大约大约75%75%的血液的血液科在科在用四用四色方案色方案 四色免疫分型方案是检测的基础四色免疫分型方案是检测的基础FCM TestHospital no.of conducting the testAntibody Number(Mean)Test amount per dep

3、artment per day(Hospital No.)Current Color Panel(Hospital No.)Leukemia classification2619Leukemia MRD2216Lymphoma classification2116Lymphoma MRD1312Analysis of TBNK lymphocyte subsets218IMS Health 咨询公司调研结果咨询公司调研结果四色白血病免疫分型特点四色白血病免疫分型特点 操作简便操作简便、结果稳定：结果稳定：仪器调节简便，易于掌握仪器调节简便，易于掌握 补偿简单：补偿简单：FITCFITC、PEP

4、E、PerCPPerCP、APCAPC四四种种荧光素稳定，易于调节，不荧光素稳定，易于调节，不易受操作经验及易受操作经验及样本间差异样本间差异影响；影响；四色方案是白血病免疫分型的四色方案是白血病免疫分型的基础；基础；鉴于国内的实际情况和临床需求，中国免疫学会血液免疫分会临床流鉴于国内的实际情况和临床需求，中国免疫学会血液免疫分会临床流式细胞术学组发表急性白血病免疫分型式细胞术学组发表急性白血病免疫分型四色方案四色方案 经临床验证的成熟方案；经临床验证的成熟方案；四色方案抗体选择原则：四色方案抗体选择原则：用相对少的抗体，达到对各个类型白血病进行较全面的用相对少的抗体，达到对各个类型白血病进行

5、较全面的检测检测 识别识别白血病细胞，能将其与正常白血病细胞，能将其与正常细胞或细胞或反应性细胞相反应性细胞相区别区别 鉴别鉴别白血病细胞的系列白血病细胞的系列来源来源 根据根据细胞的分化程度对疾病进行亚型分细胞的分化程度对疾病进行亚型分型型白血病免疫分型的方法白血病免疫分型的方法免疫分型免疫分型两步法两步法节约抗体节约抗体初筛初筛鉴别系列来源鉴别系列来源分型亚型分型亚型分型一步法一步法节约时间节约时间同时做系别同时做系别和分型和分型国内白血病免疫分型的现状国内白血病免疫分型的现状四色两步法（四色两步法（急性白血病免疫分型的中急性白血病免疫分型的中国专家共识国专家共识）BDBD四色一步法四色一

6、步法Part1Part2Part3CONTENTS白血病免疫分型的专家共识白血病免疫分型的专家共识 国内首个标准化方案国内首个标准化方案 背景：鉴于国内的实际情况，临床流式细胞学术组首先提出中国FCM急性白血病免疫分型四色方案，以期促进我国急性白血病免疫分型诊断的规范化及整体水平的提高共识专家名单共识专家名单共识专家共识专家单单 位位共识专家共识专家单单 位位刘艳荣北京大学人民医院翟亚萍河南省人民医院王慧君中国医学科学院血液病医院万岁贵首都医科大学宣武医院朱明清苏州大学附属第一医院徐娟首都医科大学宣武医院翁香芹上海交通大学医学院附属瑞金医院张连生兰州大学第二医院李建勇江苏省人民医院苏文山西肿瘤

7、研究所免疫研究室吴雨洁江苏省人民医院倪万茂浙江省人民医院邵宗鸿天津医科大学总医院杨芝红宁夏医科大学附属医院王莉莉解放军总医院吴铭深圳市人民医院王卉河北燕达医院陆道培血液肿瘤中心王亚哲北京大学人民医院朱焕玲四川大学华西医院王兴兵安徽省立医院冯茹南方医科大学南方医院陈立君哈尔滨血液肿瘤研究所实验中心判断急判断急性白性白血病原则血病原则:幼稚细胞大于幼稚细胞大于20%20%B-ALL：泛泛B:CD19 c/mCD22 cCD79a 幼稚幼稚B:CD34、TdT、CD10 c 成熟成熟B：CD20 c/mIg 特异：特异：CD19 CD10 cCD22/cCD79aT-ALL：泛泛T：CD2，CD5，

8、CD7，cCD3 幼稚幼稚T：CD34，TdT，CD1a,CD4+CD8+，CD4-CD8-，CD3-/cCD3+成熟成熟T：CD3，CD4，CD8 特异：特异：cCD3/CD3 AML:幼稚：幼稚：CD34、CD117、CD123、CD38、HLA-DR-粒粒 粒粒/单：单：CD33 CD13 CD11b CD64 CD65s CD14 CD64 CD11c 巨核细胞：巨核细胞：CD41 CD61 红细胞：红细胞：CD71 GlyA 特异：特异：cMPO,2,CD11c、CD14、CD36、CD64、溶酶体流式细胞术判断急性白血病流式细胞术判断急性白血病20082008年年WHOWHO细胞系

9、别确定标准细胞系别确定标准 髓系：MPO（流式细胞术、免疫组化或者细胞化学）单核系分化(非特异性酯酶弥漫性阳性，或者CD11c、CD14、CD36、CD64、溶酶体，两个及以上阳性）T细胞系：胞浆CD3 胞膜CD3（MPAL中比较罕见）B细胞系:CD19st +(cCD79a、cCD22、CD10)至少1个强表达：CD19dim+(cCD79a、cCD22、CD10)至少2个强表达专家共识方案推荐的所有抗体组合专家共识方案推荐的所有抗体组合管号管号PerCPFITCPEAPC级别级别意义意义1CD45CD7CD117CD33第一步第一步筛查必选，确定系别来源筛查必选，确定系别来源2CD45CD

10、10CD34CD19 B-ALL3CD45nTdTCD22cCD79a 第二步第二步B-ALL诊断分型必选诊断分型必选4CD45KappalambdaCD19B-ALL诊断分型必选诊断分型必选5CD45CD58CD123CD38 用于用于MRD必选必选6CD45CD15cIgUCD20可选可选可选，亚型和基因型检测可选，亚型和基因型检测7CD45CD13CD33可选，用于可选，用于MRD T-ALL3CD45CD4CD8CD3第二步第二步T-ALL诊断分型必选诊断分型必选4CD45CD99cCD3 nTdT5CD45CD2CD1aCD5 AML3CD45CD14CD64CD300e第二步第二步

11、诊断分型必选：粒和单核细胞诊断分型必选：粒和单核细胞4CD45CD15CD13CD11b必选：粒和单核细胞必选：粒和单核细胞5CD45HLA-DRCD123CD11c用于用于MRD，嗜碱和树突细胞必选，嗜碱和树突细胞必选6CD45CD2CD56CD38 MRD必选，帮助诊断必选，帮助诊断APL7CD45CD71Glycophorin A第三步第三步红白血病红白血病M6必选必选8CD45CD41CD42bCD61巨核细胞巨核细胞M7必选必选9CD45CD303CD304树突细胞必选树突细胞必选10CD45CD9CD22CD25肥大细胞必选肥大细胞必选 MPAL11CD45cMPOcCD79acC

12、D3 第二步第二步混合表型必选混合表型必选共共5353个抗体，下面红色个抗体，下面红色为为BD有临床注册证抗体，有临床注册证抗体，覆盖覆盖75%75%抗体抗体专家共识四色必选抗体方案专家共识四色必选抗体方案共识推荐共识推荐BDBD常用常用四色荧光四色荧光FITC、PE、PerCP、APC为基础的抗为基础的抗体方案体方案 红色为红色为BD都有临床注册都有临床注册证抗体证抗体分步分步管号管号FITCPEPerCPAPC意义意义第一步第一步：初筛初筛必选必选1CD7CD117CD45CD33判断系别来源判断系别来源2CD10CD34CD45CD19第二步第二步：诊断诊断分型必选分型必选3nTdTCD

13、22CD45cCD79a B-ALLB-ALL诊断分型必选诊断分型必选4KappalambdaCD45CD195CD15cIgMCD45CD203CD4CD8CD45CD3T-ALLT-ALL诊断分型必选诊断分型必选4CD99cCD3CD45nTdT5CD2CD1aCD45CD53CD14CD64CD45CD300eAMLAML诊断分型粒和单核诊断分型粒和单核细胞细胞4CD15CD13CD45CD11b5HLA-DRCD123CD45CD11c6CD2CD56CD45CD38 11cMPOcCD3 CD45cCD79a诊断诊断MPALMPAL初筛方案：省时、省事、敏感性高初筛方案：省时、省事、

14、敏感性高管号管号FITCPEPer-CPAPC意义意义1CD7CD117CD45CD33判断系别判断系别2CD10CD34CD45CD19明确系列来源明确系列来源,选择灵敏性高选择灵敏性高CDCD分子，以防假阴性；分子，以防假阴性；为什么不用胞内为什么不用胞内cCD3/cCD79a/cMPO 费时费时:胞内抗原需要破膜处理；胞内抗原需要破膜处理；步骤较多增加影响因素，操作者间重复性差，影响结果准确性步骤较多增加影响因素，操作者间重复性差，影响结果准确性 cMPO虽然特异性好，但敏感性低，虽然特异性好，但敏感性低，M2患者中有近患者中有近50%50%为阴性为阴性为什么选择为什么选择CD7/CD1

15、9/CD33/CD117 CD7CD7、CD19CD19、CD33/CD117CD33/CD117对于对于T T系、系、B B系和髓系虽然不是特异性最系和髓系虽然不是特异性最强分子，但敏感性高，更适合做初筛分子强分子，但敏感性高，更适合做初筛分子7 7个初筛抗体个初筛抗体BDBD已有临床注册证已有临床注册证B-ALLB-ALL诊断分型诊断分型-初筛初筛 B-ALL:B-ALL:系别抗体系别抗体CD19CD19-CD19st+CD19st+/CD34+/CD10st+/CD34+/CD10st+联合，可以直接诊断联合，可以直接诊断B-ALLB-ALL患者，此表患者，此表型患者占型患者占B-ALL

16、B-ALL中中60%60%-CD19st+CD19st+/CD34-/CD10+-/CD34-/CD10+-：B-ALLB-ALL患者患者30%+CD3430%+CD34为阴性为阴性,需进行进需进行进行第二步诊断必选抗体检测行第二步诊断必选抗体检测B-ALLB-ALL诊断分型诊断分型CD7/CD117/CD33/CD19/CD34/CD10CD19st+/CD10st+CD34+/CD117-/CD7-B-ALLCD19st+/CD10+-/CD34-/CD117-/CD7-CD22+/cCD79a+/nTdT+B-ALLCD22+/cCD79a+/nTdT-c-kappa-lambda-B-

17、ALLCD19dim+/CD10-CD117+/CD33+CD7-排除排除MPALMPALcCD79a+/cCD22+/cMPO-B-ALLcCD79a/cCD22+/cMPO+MPALcCD79a-/cCD22-/cMPO+AML急性急性B B淋巴细胞白血病淋巴细胞白血病(B-ALL)(B-ALL)亚型分类亚型分类B-ALL B-ALL 亚型亚型cCD79acCD79aCD22CD22CD19CD19CD34CD34nTdTnTdTCD10CD10c c+IgIg或或Kappa/LambKappa/LambdadaPro-B-ALL+-Com-B-ALL+-Pre-B-ALL+-/+-Mat

18、ure-B All+-+B-ALL亚型对预后无明显相关性，亚型分类非必需如临床要求，专家共识的四色方案必选抗体包括以上亚型9种抗体，可用于B-ALL亚型分类ALL-BCD19st,CD10st,CD34+CD33-CD117-CD7-TDTdim/CD34+,CD123st+,CD22dimLAIP:cIgM-,CD10+CD34+亚型亚型:ALL-B-COMALL-BALL-BCD19st,CD10dim,CD34+CD33dim+CD117-CD7-TDTdim/CD34+,CD58st+,CD10dimLAIP:cIgM+,K-L-亚型亚型:ALL-B-PreALL-B?CD79a(st

19、),CD22+,ALL-BT-ALLT-ALL诊断分型诊断分型-初筛初筛 T-ALL:T-ALL:系别抗体系别抗体CD7CD7-CD7+(st)/CD34+-/CD10+-/CD117+-/CD19-/CD33-CD7+(st)/CD34+-/CD10+-/CD117+-/CD19-/CD33-时提示时提示T-ALLT-ALL-第二步标记第二步标记T-ALLT-ALL诊断分型必选抗体诊断分型必选抗体T-ALLT-ALL诊断分型诊断分型CD7+st/CD34+-/CD10+-/CD117+-/CD19-/CD33-（初筛）（初筛）cCD3+/nTdT+T-ALLcCD3+/nTdT-cCD3+/

20、nTdT-CD3-,CD4-CD8T-ALLcCD3+/nTdT-CD3-/CD1a+CD4+CD8+T-ALLcCD3+/nTdT-CD3+/CD4+orCD8+,CD99+T-ALLALL-TCD19-,CD10-,CD34part+CD33dim+CD117-CD7st+ALL-T?cCD3st+,TDTpart+-,CD3少+CD4-CD8-CD2-CD5-CD1a-ALL-TLAIPcCD3+TDT+CD3-/dim+CD4-CD8-CD2-CD5-+急性急性T T淋巴细胞白血病淋巴细胞白血病(T-ALL)(T-ALL)亚型分类亚型分类T-ALL亚型亚型cCD3CD7nTdTCD34

21、CD2CD1aCD3CD4/CD8Pro-T-ALL+/-/-Pre-T-ALL+/-+-/-皮质-T-ALL+-+-+/+髓质-T-ALL+/-+-+/-;-/+90%的的T-ALL为为Pre T-ALL如临床要求，专家共识的四色方案必选抗体包括以上亚型如临床要求，专家共识的四色方案必选抗体包括以上亚型9种抗体，可用于种抗体，可用于T-ALL亚型分类亚型分类AMLAML诊断分型诊断分型-初筛初筛 经第一步检测，在经第一步检测，在CD45/SSCCD45/SSC图中可见明显幼稚细胞图中可见明显幼稚细胞 CD33+/CD117+/CD34+-/CD19-dim/CD10-+/CD7-CD33+/

22、CD117+/CD34+-/CD19-dim/CD10-+/CD7-，考虑为，考虑为AMLAML，做第二步的诊断分型管明确分型；做第二步的诊断分型管明确分型；AML-M2CD19-CD10-CD34+CD33少+CD117+CD7+AML?ALL-T?cCD3-MPO+AMLCD13+CD15-CD64-DR-DR-/CD34+CD117+CD33少+CD7+AML-M2LAIPAMLCD19-CD10-CD34+CD33-CD117+CD7-AMLCD34+CD117+CD13few+CD123+HLA-DRp+CD38+CD33-CD7-CD19-AML-M1/0AML-M0形态：似形态：

23、似ALL组化全（组化全（）免疫标识：免疫标识：1髓系标志髓系标志+CD33st+CD117+CD7-CD19-CD10-CD34-SSC大AML-M3？CD13+CD64p+HLA-DR-CD38+CD15-CD11b-CD14-AML-M3AMLCD33+CD117+CD7+CD19-CD10-CD34+AMLCD13+CD64p+HLA-DR+CD38+CD15f+CD11b-CD14-单核：22%，粒：CD11b-，AML-M4AMLCD33+CD117-CD7-CD19-CD10-CD34-AML?CD13+CD11b+CD15+CD64+CD14P+CD300e-幼稚单核幼稚单核AM

24、L-M5HLA-DR+CD123+CD11C+CD2-CD56P+CD38+AMLCD19st+CD10-CD34+CD33+CD117+CD7-AML?MPAL-M/B?CD79a(dim)+CD22st+MPO+CD13-CD11b-CD56-HLA-DR+CD15p+CD38+MPAL-M/BMPAL共识四色必选抗体的临床意义共识四色必选抗体的临床意义 必选抗体可以诊断和分型必选抗体可以诊断和分型99%99%急性白血病急性白血病 可鉴别可鉴别AMLAML与与ALLALL。诊断并分型。诊断并分型AMLAML中发病率最高的亚型中发病率最高的亚型 诊断并分型诊断并分型B-ALLB-ALL和和T

25、-ALLT-ALL 诊断诊断AMLAML常见亚型：常见亚型：M0-M5M0-M5；少见亚型：少见亚型：M6M6、M7M7；罕见亚型：树；罕见亚型：树突细胞白血病、嗜碱粒细胞白血病、肥大细胞白血病突细胞白血病、嗜碱粒细胞白血病、肥大细胞白血病 必选抗体中包括必选抗体中包括MRDMRD检测，以适应临床的需要检测，以适应临床的需要 可诊断双表型白血病、混合型白血病、急性未分化型白血病可诊断双表型白血病、混合型白血病、急性未分化型白血病 提示预后：提示预后：CD7CD7、CD11bCD11b等阳性的等阳性的AMLAML患者预后不良患者预后不良 CD15CD15阳性的阳性的AMLAML患者患者CRCR率

26、高率高BD公司二步法公司二步法分步分步管号管号FITCPEPerCPAPC意义意义第一步：第一步：初筛必选初筛必选1CD7CD117CD45CD33判断系别来源2CD10CD34CD45CD19第二步：第二步：诊断分型诊断分型必选必选3nTdTCD22CD45cCD79a B-ALL诊断分型必选4KappalambdaCD45CD195CD15cIgUCD45CD206CD4CD8CD45CD3T-ALL诊断分型必选7CD99nTdTCD45cCD38CD2CD1aCD45CD59CD14CD64CD45HLA-DRAML诊断分型粒和单核细胞10CD15CD13CD45CD11b11cMPOc

27、CD79aCD45cCD3 诊断MPAL保证最多的合规抗体，避免无证风险保证最多的合规抗体，避免无证风险：根据专家共识推荐必选抗体及BD公司可提供注册证抗体，仅调整抗体的荧光素标志。以专家共识为基础优化的合规抗体方案以专家共识为基础优化的合规抗体方案红色字体抗体为红色字体抗体为BD有临床注册证试剂有临床注册证试剂BDBD公司两步法的临床意义公司两步法的临床意义 与原共识必选抗体方案仅改变一个抗体：用与原共识必选抗体方案仅改变一个抗体：用HLA-DR代替代替CD300e，来辅助诊断单核细胞白血病，来辅助诊断单核细胞白血病 此方案此方案可实现白血病诊断可实现白血病诊断95%95%，分型，分型90%

28、90%可诊断并分型可诊断并分型AMLAML中发病率最高的中发病率最高的M0-M5M0-M5亚型：亚型：可诊断并分型可诊断并分型B-ALLB-ALL和和T-ALLT-ALL 可诊断双表型白血病、混合型白血病、急性未分化型白血病可诊断双表型白血病、混合型白血病、急性未分化型白血病 提示提示AML M6AML M6 提示预后：提示预后：CD7、CD11b等阳性的等阳性的AML患者预后不良患者预后不良 CD15阳性的阳性的AML患者患者CR率高率高国内白血病免疫分型的现状国内白血病免疫分型的现状四色两步法（四色两步法（急性白血病免疫分型的中急性白血病免疫分型的中国专家共识国专家共识）BD BD 四色一

29、步法四色一步法Part1Part2Part3CONTENTS一步法免疫分型一步法免疫分型节省时间节省时间初筛初筛核心核心抗体抗体细分细分亚型亚型抗体抗体一个整一个整体方案体方案一次一次实验实验即即出诊出诊断分型断分型报告报告四色一步法免疫分型方案四色一步法免疫分型方案管号管号FITCPEPerCPAPC意义意义1cMPOcCD79a/CD22CD45cCD3系列来源：T/B/髓2CD7CD117CD45CD5T系、髓系干/祖细胞3CD14CD64CD45CD33髓系单核细胞分型4HLA-DRCD56CD45CD34早期干/祖标志；5CD2CD13CD45CD11b提示T系标志和粒单细胞发育过程

30、等6CD10CD19CD45CD20提示B系细胞发育过程7CD4CD8CD45CD3提示T系特异性和细胞发育过程 唯一可以提供所有抗体都是临床注册证的的方案唯一可以提供所有抗体都是临床注册证的的方案BDBD四色一步法免疫分型方案的临床意义四色一步法免疫分型方案的临床意义 可诊断并分型可诊断并分型AMLAML中发病率最高的中发病率最高的M0-M5M0-M5亚型亚型 可诊断可诊断B-ALL和部分和部分T-ALL 可诊断双表型白血病、混合型白血病、急性未分化型白血病可诊断双表型白血病、混合型白血病、急性未分化型白血病 提示提示AML M6 提示提示MDS、CML、CMML、JMML、AA等成熟粒细胞

31、相关疾病等成熟粒细胞相关疾病 提示提示NHL-B 为为MRDMRD检测提供部分检测提供部分LAIPLAIP标志标志 缺点：无缺点：无TDTTDT，40-50%ALL-T40-50%ALL-T诊断困难。诊断困难。T T标志多，但标志多，但T-ALLT-ALL发病发病率率5%5%。管号管号 FITC PE PerCP APC 意义意义 1CD7 CD117 CD45 CD33 判断系别来源判断系别来源 2CD10 CD34 CD45 CD19 3nTdT CD22 CD45 HLA-DRB-ALLB-ALL诊断分诊断分型必选型必选 4CD14 CD64 CD45 CD300e AMLAML诊断分型诊断分型粒和单核细胞粒和单核细胞 5CD15 CD13 CD45 CD11b 6cMPO cCD79a CD45 cCD3 诊断系别诊断系别 简化免疫分型的四色法简化免疫分型的四色法四色方案的病例分析四色方案的病例分析 AML四色方案的病例分析四色方案的病例分析 T-ALL四色方案的病例分析四色方案的病例分析 B-ALL