激光共聚焦显微镜的样本课件.ppt
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- 激光 聚焦 显微镜 样本 课件
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1、吴艳吴艳分子影像与核医学研究中心分子影像与核医学研究中心401#1124荧光显微镜荧光显微镜Fluorescence microscopy 荧光显微镜是用来观察研究样品荧光现象的光荧光显微镜是用来观察研究样品荧光现象的光学显微镜,目前主要由光源、滤片系统、光路系统学显微镜,目前主要由光源、滤片系统、光路系统等组成。等组成。广泛应用在生命科学领域,可对组织和细胞的广泛应用在生命科学领域,可对组织和细胞的结构、形态、蛋白质表达、亚细胞结构等进行定位、结构、形态、蛋白质表达、亚细胞结构等进行定位、定性观察及分析。定性观察及分析。荧光显微镜荧光显微镜仪器型号:仪器型号:OLYMPUS IX73 研究级
2、倒置荧光显微镜研究级倒置荧光显微镜Fluorescence microscopy参加过仪器使用培训,通过参加过仪器使用培训,通过网上仪器知识考试,网上提网上仪器知识考试,网上提前预约,管理员审核通过方前预约,管理员审核通过方可使用。可使用。注意事项:注意事项:汞灯使用时尽量减少启动次数;灯熄灭后要等待冷却才能重新启动;点燃灯泡后不可立即关闭,以免水银蒸发不完全而损坏电极,一般需要等15min 放置地点放置地点:401-1312室室 管理员:吴安庆老师管理员:吴安庆老师显微镜参数显微镜参数1主机功能:系统具有明场、相差、微分干涉、荧光观察功能;2透射光光源:外置电源供应器100W卤素灯透射光照明
3、装置;3物镜:长工作距离万能平场半复消色差相差(荧光)物镜:4(数值孔径N.A.0.13)、10(N.A.0.3),20(N.A.0.7)、40(N.A.0.6),60X(N.A.0.7)4物镜转盘:6孔以上编码型物镜转盘,与软件连接后能够保存物镜信息,随物镜转换能够自动校准标尺;5载物台:精确定位功能手动载物台;具备XY锁定和复位功能,可重现标本位置,游标尺的精度100m;6聚光镜:超长工作距离万能聚光镜,孔位数5;7荧光照明器:主机反射荧光系统可采用复眼照明技术,平均荧光视野亮度,便于量化分析;8.荧光光源:130W以上长寿命荧光光源,光导管传输,长度1.5米,符合RoHS 和WEEE法令
4、要求;9.高通透性荧光激发块:紫外,BP340-390,DM410,BA420-IF 蓝色,BP460-495,DM505,BA510-IF 绿色,BP530-550,DM570,BA575-IF;10荧光激发块转盘:编码型荧光激发块转盘,7孔位设计,便于今后扩展应用,无需工具即可更换滤色镜组,与软件连接后能够随图片保存荧光滤色镜组信息;11滤色镜:透射用日光平衡滤色片、绿色滤色片,荧光用减光片ND6/ND25;12DIC附件:40X、60X物镜配置微分干涉附件。显微镜参数显微镜参数 基本原理基本原理激发滤镜:激发滤镜:从光源中分滤出一定波长范围的激发光。从光源中分滤出一定波长范围的激发光。(
5、一般有紫外、蓝色和绿色激发滤片)(一般有紫外、蓝色和绿色激发滤片)带通滤色镜带通滤色镜(BP)BP):有宽、窄带之分。如:有宽、窄带之分。如:BP450-490BP450-490 长、短通滤色镜组合长、短通滤色镜组合(LP LP+KPKP):):LP450+KP490LP450+KP490 双色镜:双色镜:双色分光镜;反射短波长,透过长波长。双色分光镜;反射短波长,透过长波长。阻断滤镜:阻断滤镜:吸收和阻挡激发光进入目镜;选择并让特异的荧光透过,表现出专一的荧光色彩。吸收和阻挡激发光进入目镜;选择并让特异的荧光透过,表现出专一的荧光色彩。多为长通滤色镜;多为长通滤色镜;LP490LP490紫外
6、蓝绿高压汞灯被荧光探针染色的生物样本激发被标记结构的荧光光学图像光学成像滤镜分光标本制作要求标本制作要求 (一)载玻片一)载玻片载玻片厚度应在载玻片厚度应在0.81.2mm之间,太厚的坡片,一方面光吸收多,另一方面之间,太厚的坡片,一方面光吸收多,另一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁,厚度均匀,无明显自发荧光。有时不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁,厚度均匀,无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。需用石英玻璃载玻片。(二)盖玻片(二)盖玻片盖玻片厚度在盖玻片厚度在0.17mm左右,光洁。左右,光洁。(三)标本(三)标本组织切片或其他标本不能太厚,如太厚激发光大部分消耗在标本
7、下部,而物镜组织切片或其他标本不能太厚,如太厚激发光大部分消耗在标本下部,而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外,细胞重迭或杂质掩盖,影响判断。直接观察到的上部不充分激发。另外,细胞重迭或杂质掩盖,影响判断。(四)封裱剂(四)封裱剂封裱剂常用甘油,必须无自发荧光,无色透明,荧光的亮度在封裱剂常用甘油,必须无自发荧光,无色透明,荧光的亮度在pH8.59.5时较时较亮,不易很快褪去。所以,常用甘油和亮,不易很快褪去。所以,常用甘油和0.5mol/l pH9.09.5的碳酸盐缓冲液的等的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。量混合液作封裱剂。(五)镜油(五)镜油一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时,必
8、须使用镜油,最好使用特制的一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时,必须使用镜油,最好使用特制的无荧光镜油,也可用上述甘油代替。无荧光镜油,也可用上述甘油代替。荧光显微镜的不足荧光显微镜的不足:1.1.无法实现对荧光无法实现对荧光,透射光的同时采集透射光的同时采集,无法实现多重荧光的无法实现多重荧光的同时采集及共定位。同时采集及共定位。2.2.荧光散射光太强,造成实际分辨率的大大下降。荧光散射光太强,造成实际分辨率的大大下降。3.3.荧光漂白及对细胞组织的照射损伤。荧光漂白及对细胞组织的照射损伤。4.4.无法对样品进行断层扫描无法对样品进行断层扫描,完成完成3 3D D的工作。的工作。5.5.只
9、能在二维环境下观察。只能在二维环境下观察。6.6.样品不能太厚。样品不能太厚。激光共聚焦扫描显微镜激光共聚焦扫描显微镜(LaserscanningConfocalMicroscopy,LSCM)以激光作为光源,采用光源针孔与检测针以激光作为光源,采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术,对样本进行断层扫描,以孔共轭聚焦技术,对样本进行断层扫描,以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统共聚焦显微镜的类型点(慢)扫描共聚焦显微镜 分辨率高,图像清晰,采集图像速度慢线(狭缝)扫描共聚焦显微镜 分辨率低,速度快,噪音高转盘式扫描共聚焦显微镜 性能介于上述两者之间激光共聚焦扫
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