第五章诊断酶学课件.ppt
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1、第五章第五章 酶学分析技术酶学分析技术 退出退出 主要内容 六、工具酶及其临床应用六、工具酶及其临床应用一、酶的一般特征一、酶的一般特征 二、酶促反应动力学二、酶促反应动力学三、酶活性浓度测定技术三、酶活性浓度测定技术四、四、酶的免疫化学测定酶的免疫化学测定五、五、同工酶和亚型的测定同工酶和亚型的测定七、血清酶七、血清酶八、临床常用血清酶及其同工酶八、临床常用血清酶及其同工酶 第一节第一节 酶的一般特征酶的一般特征 返回章返回章 1.1.酶、核酶。酶、核酶。2.2.酶的催化特性酶的催化特性:极高的催化效率、高度的特异性、:极高的催化效率、高度的特异性、催化作用的可调节性。催化作用的可调节性。3
2、.3.酶促反应:酶促反应:酶所催化的反应。酶所催化的反应。酶活性:酶活性:酶催化反应的能力。酶催化反应的能力。酶活性单位:酶活性单位:在一定条件下使酶促反达到某一速在一定条件下使酶促反达到某一速度时所需要的酶量。度时所需要的酶量。底物底物(S)(S):酶所作用的物质。酶所作用的物质。产物产物(P)(P):酶促反应的生成物。酶促反应的生成物。酶的激活剂酶的激活剂:加速酶促反应的物质。加速酶促反应的物质。酶的抑制剂酶的抑制剂:减慢或终止酶促反应的物质。减慢或终止酶促反应的物质。一、基本概念一、基本概念 返回节返回节 二、酶的结构与催化作用 单纯酶和结合酶单纯酶和结合酶 单纯酶:单纯酶:只含多肽链,
3、是单纯蛋白质。只含多肽链,是单纯蛋白质。结合酶:结合酶:由酶蛋白和辅因子组成。由酶蛋白和辅因子组成。两者结合后形成的复合物称为全酶。两者结合后形成的复合物称为全酶。与酶蛋白结合疏松的称为辅酶。与酶蛋白结合疏松的称为辅酶。与酶蛋白结合牢固的称为辅基。与酶蛋白结合牢固的称为辅基。酶的活性中心酶的活性中心 酶与底物结合并将底物转变成产物发生在酶表面的酶与底物结合并将底物转变成产物发生在酶表面的一个特定区域。一个特定区域。酶的催化作用机制酶的催化作用机制 诱导契合学说。诱导契合学说。返回节返回节 临床应用酶临床应用酶ECEC编号编号习惯用名习惯用名英语缩写英语缩写ECEC编号编号习惯用名习惯用名英语缩
4、写英语缩写1.1.1.271.1.1.27乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶LDLD、LDHLDH2.7.3.22.7.3.2肌酸激酶肌酸激酶CKCK、CPKCPK1.1.1.371.1.1.37苹果酸脱氢酶苹果酸脱氢酶MDMD、MDHMDH3.1.1.33.1.1.3脂肪酶脂肪酶LPSLPS1.1.1.411.1.1.41异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶ICDICD、ICDHICDH3.1.1.83.1.1.8胆碱酯酶胆碱酯酶CHECHE1.1.1.491.1.1.496-6-磷酸葡萄糖脱氢酶磷酸葡萄糖脱氢酶G6PDHG6PDH3.1.3.13.1.3.1碱性磷酸酶碱性磷酸酶ALPALP、AKPAKP1.4.
5、1.31.4.1.3谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶GLDGLD、GLDHGLDH3.1.3.23.1.3.2酸性磷酸酶酸性磷酸酶ACPACP1.4.3.41.4.3.4单氨氧化酶单氨氧化酶MODMOD3.1.3.53.1.3.55-5-核苷酸酶核苷酸酶5-NT5-NT2.1.3.32.1.3.3鸟氨酸氨甲酰基转移酶鸟氨酸氨甲酰基转移酶OCTOCT3.2.1.13.2.1.1-淀粉酶淀粉酶AMYAMY、AMSAMS2.3.2.22.3.2.2-谷氨酰基转移酶谷氨酰基转移酶-GT-GT、GGTGGT3.2.1.303.2.1.30-N-N-乙酰乙酰(基基)-)-D D氨基葡萄糖苷酶氨基葡萄糖苷酶NAGN
6、AG2.4.1.12.4.1.1糖原磷酸化酶糖原磷酸化酶GPGP3.2.1.513.2.1.51-L-L-岩藻糖苷酶岩藻糖苷酶-FU-FU、AFUAFU2.5.1.182.5.1.18谷胱甘肽转移酶谷胱甘肽转移酶GSTGST3.4.23.13.4.23.1亮氨酸氨基肽酶亮氨酸氨基肽酶LAPLAP2.6.1.12.6.1.1门冬氨酸氨基转移酶门冬氨酸氨基转移酶ASTAST、GOTGOT4.1.2.134.1.2.13果糖二磷酸醛缩酶果糖二磷酸醛缩酶ALDALD2.6.1.22.6.1.2丙氨酸氨基转移酶丙氨酸氨基转移酶ALTALT、GPTGPT三、酶的命名、分类及编号三、酶的命名、分类及编号 返
7、回节返回节 酶促反应动力学酶促反应动力学 返回章返回章 MichaelisMichaelis 和和MentenMenten提出的酶作用的中间产物学说提出的酶作用的中间产物学说:maxSKmSVV一、米曼氏方程一、米曼氏方程 E+SK1K2K3 返回节返回节 19131913年提出了著名的酶促反应速度与底物浓度关系的年提出了著名的酶促反应速度与底物浓度关系的 方程式,即米方程式,即米-曼氏方程曼氏方程(Michaelis-Menten(Michaelis-Menten equation):equation):E+PES二、Km与Vmax KmKm值:值:等于酶促反应的初速率为最大速率等于酶促反应
8、的初速率为最大速率VmaxVmax一半一半 时的底物浓度,即时的底物浓度,即V VVmaxVmax时,则时,则KmKmSS。KmKm 在临床上的应用:在临床上的应用:反映酶与底物的亲合力,且与亲合力成反比。反映酶与底物的亲合力,且与亲合力成反比。用来计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最用来计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最 大反应速度的百分率。大反应速度的百分率。根据根据KmKm值选择酶的最适底物。值选择酶的最适底物。确定工具酶用量。确定工具酶用量。确定代谢酶系中的限速反应和作为鉴别酶的依确定代谢酶系中的限速反应和作为鉴别酶的依 据。据。VmaxVmax:酶完全被底物饱和时的反应速度,代
9、表了在一酶完全被底物饱和时的反应速度,代表了在一 定酶量下的最大反应速率定酶量下的最大反应速率。返回节返回节 三、酶促反应进程曲线 如将酶反应过程中测得的产物如将酶反应过程中测得的产物PP或底物或底物SS变化量对时间作图,可得酶促反变化量对时间作图,可得酶促反应时间进程曲线。图中产物应时间进程曲线。图中产物PP或底物或底物SS变化曲线的斜率就代表酶促反应的速率。变化曲线的斜率就代表酶促反应的速率。延滞期延滞期线性反应期线性反应期底物耗尽期底物耗尽期必须根据线性反应期必须根据线性反应期的反应速率才能准确计算的反应速率才能准确计算出酶活性浓度。出酶活性浓度。返回节返回节 四、影响酶促反应的因素 底
10、物浓度对酶促反应的影响底物浓度对酶促反应的影响(1 1)当)当SKmSKmSKm时时,反应速率,反应速率与底物浓度与底物浓度SS无关,无关,V VVmaxVmaxK EK E 称为称为零级反应零级反应,反应速率反应速率与酶浓度与酶浓度EE成正比成正比。酶学测。酶学测定时一般底物浓度可选择为定时一般底物浓度可选择为KmKm的的10102020倍。倍。返回节返回节 常见酶温度转化系数 252530303737CKCK0.640.641.001.001.561.56LDLD0.750.751.001.001.441.44ALTALT0.760.761.001.001.381.38ASTAST0.73
11、0.731.001.001.521.52ALPALP0.780.781.001.001.301.30GGTGGT0.730.731.001.001.311.31CHECHE0.810.811.001.001.261.26HBDHHBDH0.850.851.001.001.101.10 酶活性浓度测定就是要使酶促反应酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速度(的初速度(v v)达到最大速度)达到最大速度VmaxVmax,即在过,即在过量底物存在下的零级反应期的速度,此时反量底物存在下的零级反应期的速度,此时反应速度与酶浓度应速度与酶浓度EE之间存在线性关系。之间存在线性关系。第二节第二节 酶活性浓度
12、测定技术酶活性浓度测定技术 返回章返回章 1.1.按反应时间分类按反应时间分类:定时法定时法 连续监测法连续监测法2.2.按检测方法分类按检测方法分类:量气法、分光光度法、荧光法量气法、分光光度法、荧光法 其它方法(其它方法(放射性核素法、离子选择电极法,旋光法、放射性核素法、离子选择电极法,旋光法、极谱法、极谱法、HPLCHPLC或生物发光法等)。或生物发光法等)。一、酶活性浓度测定方法一、酶活性浓度测定方法 返回节返回节 测定项目测定项目方法原理方法原理测定手段测定手段胆碱酯酶胆碱酯酶氯化乙酰胆碱做底物产生乙酸根氯化乙酰胆碱做底物产生乙酸根电位滴定法电位滴定法脂肪酶脂肪酶三油酸甘油酯悬乳液
13、做底物,生成油酸甘油一三油酸甘油酯悬乳液做底物,生成油酸甘油一酯,浊度下降酯,浊度下降浊度法浊度法淀粉酶淀粉酶淀粉做底物,一定时间后,剩余的淀粉不足以淀粉做底物,一定时间后,剩余的淀粉不足以使碘呈兰色使碘呈兰色时间滴定法时间滴定法丙氨酸氨基转移酶丙氨酸氨基转移酶赖氏法赖氏法比色法比色法丙氨酸氨基转移酶丙氨酸氨基转移酶IFCCIFCC推荐法推荐法分光光度法分光光度法丙氨酸氨基转移酶丙氨酸氨基转移酶固定化谷氨酸氧化酶膜生成过氧化氢,利用过固定化谷氨酸氧化酶膜生成过氧化氢,利用过氧化氢电极氧化氢电极生物传感器生物传感器N-N-乙酰乙酰-氨基葡萄糖苷酶氨基葡萄糖苷酶4-4-甲基伞形酮甲基伞形酮N-N-
14、乙酰乙酰-D-D-氨基葡萄糖苷做底物氨基葡萄糖苷做底物荧光荧光葡萄糖葡萄糖6 6磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶NADPHNADPH在在365nm365nm激发下产生荧光激发下产生荧光荧光荧光 返回节返回节 定时法(固定时间法)定时法(固定时间法)测定酶与底物作用反应一定时间后底物或产物变化测定酶与底物作用反应一定时间后底物或产物变化的总量,计算酶促反应平均速度。的总量,计算酶促反应平均速度。优点:比较简单,最后测定时因酶促反应已被终止,优点:比较简单,最后测定时因酶促反应已被终止,故所用仪器无需恒温装置,显色剂的选择也可不考虑故所用仪器无需恒温装置,显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。对酶活性的影响。
15、缺点:无法知道在整个酶促反应进程中是否都处于线缺点:无法知道在整个酶促反应进程中是否都处于线性期。性期。利用该法测定酶活性浓度,必须保证酶和底物在所利用该法测定酶活性浓度,必须保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要非常精确,否则会引起较大误选定的温度下作用时间要非常精确,否则会引起较大误差。差。返回节返回节 连续监测法连续监测法 又称速率法或动力学法,指在酶促反应过程中用又称速率法或动力学法,指在酶促反应过程中用仪器监测某一反应产物或底物的浓度随时间仪器监测某一反应产物或底物的浓度随时间 的变化量,求出酶反应初速度,间接计算酶活的变化量,求出酶反应初速度,间接计算酶活 性浓性浓度的方法。度的方
16、法。优点:优点:无须终止酶促反应,不需添加其它成色试剂,无须终止酶促反应,不需添加其它成色试剂,就反应物变化的多点测定结果连接成线,观察就反应物变化的多点测定结果连接成线,观察 到整个反应过程,选择线性反应期来计算酶活到整个反应过程,选择线性反应期来计算酶活 性,结果准确可靠。性,结果准确可靠。要求检测仪器具有恒温装置及自动检测功能,自要求检测仪器具有恒温装置及自动检测功能,自动生化分析仪都能达到这些要求。动生化分析仪都能达到这些要求。返回节返回节 连续监测法的种类 直接法直接法 是指待测酶酶促反应的底物或产物有特征性的理化性质,是指待测酶酶促反应的底物或产物有特征性的理化性质,然后通过特殊的
17、仪器直接检测。然后通过特殊的仪器直接检测。u 基于基于NADHNADH或或NADPHNADPH的反应原理的反应原理 :LDLD、-HBD-HBD等等u 基于人工合成色素原底物基于人工合成色素原底物 :ALP ALP、GGTGGT、AMSAMS等等 u 基于氧的消耗基于氧的消耗 :各种氧化酶:各种氧化酶 间接法间接法 是指酶促反应底物和产物之间没有特征性的理化性质,是指酶促反应底物和产物之间没有特征性的理化性质,需通过另一个化学反应或生化反应,将底物或产物转化为有需通过另一个化学反应或生化反应,将底物或产物转化为有明显特征理化性质的另一个化合物。用直接法来测定的酶类明显特征理化性质的另一个化合物
18、。用直接法来测定的酶类非常有限,很多情况下不得不使用间接法。非常有限,很多情况下不得不使用间接法。l化学法化学法:如如ChEChE的丁酰硫代胆碱测定法。的丁酰硫代胆碱测定法。l酶偶联法酶偶联法 返回节返回节 用自动生化分析仪测定同一酶,条件固定时,从理论上用自动生化分析仪测定同一酶,条件固定时,从理论上来讲来讲V V、v v和和L L均为固定值,均为固定值,为常数,则将公式为常数,则将公式 简化为简化为 如如LDLD活性浓度,已知活性浓度,已知NADHNADH的的 为为6.226.22 10103 3cmcm-1-1.mol.mol-1-1,血,血清量为清量为5050 l l,底物液为,底物液
19、为1ml1ml,比色杯光径为,比色杯光径为1cm1cm,则,则 F=1.05F=1.05 10106 6/6.22/6.22 10 103 3 0.050.05 1=33761=3376FALUmin/LvVF610LvVALU610min/五、系数五、系数K K值的计算与应用值的计算与应用 返回节返回节 连续监测法中常数连续监测法中常数K K值的设置值的设置 测定酶的判断值或参考范围上限测定酶的判断值或参考范围上限,保证测定的可靠,所,保证测定的可靠,所 以转氨酶的常数以转氨酶的常数K K一般在一般在30003000左右,不少人宁愿在左右,不少人宁愿在15001500 左右。左右。应考虑到测
20、定时间,应考虑到测定时间,测定时间短到测定时间短到0.50.5分,此时分,此时0.0010.001嗓嗓 音对每分钟音对每分钟A A误差将是误差将是0.0020.002,反之,测定时间延长,反之,测定时间延长 到到2 2分钟,误差也小一半。即测定时间长,则分钟,误差也小一半。即测定时间长,则K K值可以值可以 设置大一些,如测定时间只有设置大一些,如测定时间只有0.50.5分钟,分钟,K K值一般不超值一般不超 过过40004000。改变改变K K值最方便的途径值最方便的途径就是改变标本稀释度,稀释倍数就是改变标本稀释度,稀释倍数 愈大,愈大,K K值愈大。值愈大。返回节返回节 第七节第七节 工
21、具酶及其临床应用工具酶及其临床应用 返回章返回章 概念概念 作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性的酶称为工具酶。的酶称为工具酶。工具酶参与的指示反应工具酶参与的指示反应 偶联偶联H H2 2O O2 2工具酶及指示反应:工具酶及指示反应:如常用的如常用的TrinderTrinder反应。反应。NAD(P)+NAD(P)+或或NAD(P)HNAD(P)H偶联的脱氢酶及其指偶联的脱氢酶及其指示反应:示反应:利用氧化利用氧化-还原酶反应使其连接到还原酶反应使其连接到NAD(P)-NAD(P)HNAD(P)-NAD(P)H的正的正/逆反应后,直接测定逆反应后,直接测定N
22、AD(P)HNAD(P)H的变化量。的变化量。一、工具酶一、工具酶 返回节返回节 工具酶的其他应用工具酶的其他应用n酶循环法酶循环法n固相酶固相酶酶循环法测定胆汁酸酶循环法测定胆汁酸 返回节返回节 多酶体系中酶促偶联反应分析多酶体系中酶促偶联反应分析 二、代谢物的酶法测定 终点法终点法概念:概念:在代谢物酶促反应中,随着时间的延续,待测物浓度逐渐在代谢物酶促反应中,随着时间的延续,待测物浓度逐渐减少而产物逐渐增多,一定时间后待测物全部转化为产物,反减少而产物逐渐增多,一定时间后待测物全部转化为产物,反应趋于平衡,测定反应完全后待测物或产物变化的总量,即终应趋于平衡,测定反应完全后待测物或产物变
23、化的总量,即终点法(又称平衡法)。点法(又称平衡法)。测定的基本条件:测定的基本条件:待测物浓度待测物浓度SS应远小于其米氏常数应远小于其米氏常数KmKm,此时任何时刻的,此时任何时刻的反应速度反应速度 v=VS/Kmv=VS/Km,呈一级反应。,呈一级反应。反应配方中所用酶量(反应配方中所用酶量(V V)应足够大,而)应足够大,而KmKm应小,以保证应小,以保证有较快的反应速度完成测定。有较快的反应速度完成测定。返回节返回节 直接法直接法 待测物与产物在理化性质上有可直接进行检测的差待测物与产物在理化性质上有可直接进行检测的差异,这种是最简单的代谢物浓度测定方法。异,这种是最简单的代谢物浓度
24、测定方法。如尿酸在尿酸氧化酶作用下生成的尿囊素在如尿酸在尿酸氧化酶作用下生成的尿囊素在293nm293nm有有特异的吸收峰,胆红素在胆红素氧化酶作用下生成胆绿特异的吸收峰,胆红素在胆红素氧化酶作用下生成胆绿素造成素造成450nm450nm处的吸光度下降等。体内还有很多代谢物可处的吸光度下降等。体内还有很多代谢物可以直接测定,关键是需要相对应的酶。以直接测定,关键是需要相对应的酶。返回节返回节 酶偶联法酶偶联法 与酶活性测定一样,直接法测定的项目是有限与酶活性测定一样,直接法测定的项目是有限的。每种代谢物可以使用不同的酶而建立多种检测的。每种代谢物可以使用不同的酶而建立多种检测方法。方法。如甘油
25、三酯、肌酐都有多种酶试剂法。指示反如甘油三酯、肌酐都有多种酶试剂法。指示反应主要分两大类:应主要分两大类:NADNAD(P P)H H和过氧化物酶(和过氧化物酶(PODPOD)系)系统。统。返回节返回节 Ex Ex 为待测酶,为待测酶,A A为底物,为底物,B B为中间产物。为中间产物。A A、B B二物质的变二物质的变化无法直接监测,此时可外加第二个酶化无法直接监测,此时可外加第二个酶Ei(Ei(为指示酶为指示酶),其,其底物为底物为B B,反应产物为,反应产物为P P可直接测定。可直接测定。PBAEiEx二、酶偶联法二、酶偶联法 返回节返回节 酶偶联反应酶偶联反应 最简单的模式为:最简单的
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