第二章分子克隆4-PPT课件.ppt

1、基因工程基因工程 Genetic EngineeringGenetic Engineering 李黄金李黄金Email:Email:lihuangjinlihuangjin生命科学与生物制药学院生命科学与生物制药学院9 9基因工程课程内容523416789基因工程概论分子克隆单元操作大肠杆菌基因工程非肠道细菌基因工程真菌基因工程昆虫基因工程高等动物基因工程高等植物基因工程蛋白质工程、途径工程第二章 分子克隆单元操作2.22.32.1克隆载体DNA的体外重组（切与接）目的基因的克隆2.4基因操作常用技术转化与扩增（转与增）转化子的筛选与重组子的鉴定（检）2.52.62.2 DNA的体外重组（切、

2、接）的体外重组（切、接）三、其他用于DNA重组的工具酶二、T4DNA链接酶一、限制性核酸内切酶四、DNA体外重组操作四、DNA体外重组操作提高重组率的策略DNA的连接策略DNA的酶切操作策略DNA酶切片段的纯化1、DNA酶切组合策略与操作酶切组合策略与操作尽量采用双酶切片段重组 （基因插入方向确定）尽量不要采用多克隆位点中紧邻的酶 不能采用外源基因内部有切点的酶尽量采用同盐浓度要求的酶组合BamHIpUC182686 bpAprlacZoriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnIS

3、maIXbaISalIPstISphIHindIII尽量采用常用酶组合尽量通过PCR引物设计优 化酶切组合1）限切酶的盐浓度要求与操作）限切酶的盐浓度要求与操作低盐酶：0-50 mM中盐酶：100 mM高盐酶：150 mM限切酶活性对盐浓度高度敏感，据盐浓度要求分三类：多酶联合酶解时的策略多酶联合酶解时的策略A A、对盐浓度要求相同的酶可以同时酶切、对盐浓度要求相同的酶可以同时酶切5 GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT33 CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA5BamHI SmaI5 GCTACATG GATCCCGGGTTCGCAT3 3 CGATGTACCTAG

4、GGCCCAAGCGTA55 GCTACATGGATCCC GGGTTCGCAT33 CGATGTACCTAGGG CCCAAGCGTA5但应注意：紧密但应注意：紧密相连时难切割相连时难切割B、对盐浓度要求不同的酶，可采取下列策略：、对盐浓度要求不同的酶，可采取下列策略：使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切0.1倍体积的 5 M NaAc pH 5.42.5倍体积的冰冷乙醇冰浴 5 分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥2 2）DNADNA样品纯度要求与操作样品纯度要求与操作待酶切待酶切DNA样品必须达到较高纯度，

5、样品中的蛋白质、苯样品必须达到较高纯度，样品中的蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等杂质过多抑制酶等杂质过多抑制酶活性。活性。策略：策略：加大酶的用量加大反应总体积延长反应时间3 3）DNADNA局部酶切消化局部酶切消化n在基因文库构建中具有重要意义在基因文库构建中具有重要意义nDNADNA分子中分子中只有只有部分限制位点被内切酶所切割而产生不完部分限制位点被内切酶所切割而产生不完全消化的产物全消化的产物n可以通过可以通过缩短缩短酶切消化酶切消化反应的时间反应的时间，降低降低反应的反应的温度温度，减少减少酶用量酶用量来达到局部消化的目的来达到局部消化的目的.2

6、、DNA酶切片段的纯化一般采用琼脂糖凝胶电泳分离纯化片段回收方法试剂盒（柱回收）法纸片（纤维膜）回收法酶切后的载体和目的基因均需纯化3、DNA连接策略与操作一粘一平末端的连接（简单）单酶切粘性末端的连接双酶切粘性末端的连接（简单）平端的连接 不匹配末端的连接1）单酶切粘性末端的连接：载体载体5端用碱性磷酸酯酶去磷端用碱性磷酸酯酶去磷 酸化，防自环酸化，防自环5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5GCTTAAAATTCG5 5 GCTTAA 55 AATTCG5 退火GCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGGCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5

7、 AATTCGT4-DNA ligaseGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAG外源片段外源片段有有2 2个插入个插入方向方向外源片段外源片段载体载体2）同尾酶生产的粘性末端的连接BamHI5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 TACTAG 55 GATCAT5 退火GCCTAGGATCCG5 TACTAG 5 GATCATT4-DNA ligaseTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT5 TGATCAACTAGT5 BglIIGCCTAGGATCCG5 TAC

8、TAG 5 GATCATTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT外源片段外源片段有有2 2个插入个插入方向方向2 2个酶切个酶切位点消失位点消失3）平端的连接）平端的连接从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多提高平头末端连接效率的方法包括：加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用 加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM4）不同粘性末端的连接：补平与切平BamHI5 5

9、GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 CTGCAG5 GACGTC3 T4-DNA ligaseCGATCCGCTAGG5 5GGATCGCCTAGC5 CTGCAGGACGTC5 PstI3 T4-DNA pol切平5 CG5 GCKlenow补平5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGGCGATCCGCTAGG5 5GGATCGCCTAGC5GCCTAGGATCCG5 5 GCTTAA 555 AATTCGT4-DNA ligase5 5Klenow补平Klenow补平5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGG5 GAATTCTTAA 5

10、55 AATTCTTAAGTdTTdTdGTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAA AATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5 5GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG退火BamH IBamH IEcoR IBamH I5）不同粘性末端的连接：加人工粘性接头（5突出末端）CTGCA 3 GG3 ACGTC5 GCATG

11、3C5C3 GTACGT4-DNA ligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC 3C退火Pst IPst IC3 CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 GG3 GGGGGGACGTC5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTG

12、CAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowPst ISph I5）不同粘性末端的连接：加人工粘性接头（3突出末端）C 3 GG5 G 3C5C3 GT4-DNA ligaseTdTTdTdTTPdATPGTTTTTTTTTT 3C退火C3 TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA 3 GG3 AAAAAAAAAAC5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGS1C3 5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTT

13、TTG加热GTCATTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGT5）不同粘性末端的连接：加人工粘性接头（平端）6）粘性末端的更换BamHI5 5GGATCCCCTAGGT4-DNA ligaseKlenow补平GATCC5 G5GCCTAG55 5GGATCCCTAG5 GATCCCTAGG55GGATCGGAATTCCGATCCCCTAGCCTTAAGGCTAGG5 5EcoR IGGAATTCCCCTTAAGGEcoR I linkerBamHI的位点已被破坏4、提高重组率的策略重组率的定义 重组率=含有外源DNA的重组分子数/载体

14、分子总数 在常规实验条件下，重组率一般为25-75%重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以 大大简化DNA重组的后续操作。提高重组率的策略1）提高外源DNA片段与载体的分子比：5:1-10:1 2）载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团：5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5GCTTAA pAATTCG5 p5 GCTTAA OH 55 AATTCG5 HO退火5 G-A-A-T-T-CC-T-T-A-A G5G A-A-T-T-CC-T-T-A-A-GOHHOOHHO碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶特别针对单酶切连接3）加装同聚尾末端：CTGCA 3 GG

15、3 ACGTC5 GCATG 3C5C3 GTACGT4-DNA ligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC 3C退火C3 CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 GG3 GGGGGGACGTC5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenow第二章 分子克隆单元操作2.22.32.1克隆载体DNA的体外重组（切与接）目的基因的克隆2.4基因操作常用技术转化与扩

16、增（转与增）转化子的筛选与重组子的鉴定（检）2.52.6基因工程的操作过程基因工程的操作过程切接转增检一、用于基因转移的受体（宿主）二、转化与扩增2.3 转化与扩增转化与扩增一、用于基因转移的受体（宿主）受体（宿主）应具备的条件各种基因工程受体的特性实验室常用的基因工程受体1、受体（宿主）应具备的条件限制性缺陷型外切酶和内切酶活性缺陷（hsdR-）重组整合缺陷型用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-，recB-，recC-）具有较高的转化效率具有与载体选择标记互补的表型感染寄生缺陷型防止重组细菌扩散污染，生物武器除外 基因工程主要宿主系统 原核细胞原核细胞(Prokaryotic)真菌（

17、真菌（Fungus )昆虫昆虫(Baculovirus)高等真核细胞（高等真核细胞（Eukaryotic)人（基因治疗）人（基因治疗）动、植物（基因农场）动、植物（基因农场）2、各种基因工程受体（宿主）的特性1）大肠杆菌 遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定。适用于外源DNA的扩增和克隆、基因文库的构建和外源基因的高效表达，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌。产生结构复杂、种类繁多的内毒素。各种基因工程受体的特性2）枯草芽孢杆菌 遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全，生长迅速，培养简单，不产内毒素 适用于重组蛋白与多肽、特别是微生物来源的酶的高效分泌表达，。遗传欠稳定

18、，载体受体系统欠完备各种基因工程受体的特性3）链霉菌抗生素的主要生产者，相对操作简便，不产内毒素主要用于抗生素生产菌株的改良遗传不稳定，生长相对缓慢各种基因工程受体的特性4）酵母菌 具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定 适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌 内源性蛋白产物种类繁多且含量高各种基因工程受体的特性5）昆虫细胞（家蚕，杆状病毒表达系统）具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定 适用于真核生物基因的

19、高效表达 DNA重组操作系统欠完善各种基因工程受体的特性6）哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞 CHO）与人的亲缘关系近，表达系统完善，具有合适的糖基化修饰系统 适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体 细胞培养条件苛刻，生长缓慢 各种基因工程受体的特性7）植物细胞（拟南芥菜、烟叶）农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用 适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，农作物品质的改良 遗传操作繁琐 3、实验室常用的基因工程受体（宿主）大肠杆菌用于接受质粒：C600、W3110、HB101、J

20、M83、JM101（Aps、Tcs、Cms）用于接受l-DNA：LE392、ED8654 真菌哺乳动物细胞 CHO 毕赤酵母、汉森酵母、啤酒酵母酵母菌：丝状真菌：黑曲霉、青霉二、转化和扩增（转与增）转化的原理与技术转化率转化细胞的扩增几个基本概念感受态（compentent)：受体(宿主）细胞经过一些理化或生物学方法处理后，细胞膜的通透性发生暂时性的改变，成为能允许外源DNA进入的一种生理状态。感受态细胞（compentent cell)转化（transformation)：质粒DNA导入受体细胞（宿主菌），并使之繁殖和表达的操作。转化子（transformant)：经转化而带有外源DNA的受

21、体（宿主菌）细胞。重组子（recombinant)：含有重组DNA的转化子或重组DNA。相对于仅含空载体的转化子而言。1、转化的原理与技术Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化（Ca2+法）细菌原生质体的转化（原生质体法）完整细菌细胞的电穿孔转化（电转化法）l噬菌体DNA的转染1）Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化诱导的完整细菌细胞的转化 Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态即为感受态。大肠杆菌感受态细胞的制备：100 ml 菌体培养至O

22、D600=0.5，离心收集菌体 用10 ml 冰冷的10 mM CaCl2溶液悬浮菌体，离心用1 ml 冰冷的75 mM CaCl2溶液悬浮菌体 冰浴放置12-24小时，备用 收集菌体大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：取100 ml 感受态细胞，加入1-5ul相当于50 ng 载体的重组冰浴放置半小时 在42保温 90秒（热脉冲）快速将转化细胞转移至冰浴中放置1-2分钟 DNA连接液，混匀。加入1 ml 新鲜培养基，于37培养 1 小时（扩增）涂在合适的固体培养基平板上进行筛选 2）细菌原生质体的转化 革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生

23、质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNA分子 酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化 不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细菌需生长在高渗培养基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂 细菌原生质体的制备：取0.2-1ml的原生质体悬浮液（108 8-109 9个原生质体），加入10-20 ml DNA重组连接液，同时加入含有PEG1000和Ca2+的等渗溶液，混匀 细菌原生质体的转化：细菌原生质体的再生：原生质体再生的主要目的是

24、使细菌重新长出细胞壁。再生在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素 3）电穿孔转化 将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内 电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大 同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验4）l噬菌体DNA的转染感受态细胞的培养：将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培养基 中培养至OD600=0.5吸附：加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30保温10分钟转染裂解：加入20倍体积的新鲜培养基，

25、30培养2小时，直至培养液 中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选2、转化率转化率的定义 每微克DNA分子转化宿主菌能获得的转化子数。例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有3.4X1011个分子（6.02X1017/2686X660），也就是说，每3400个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞 另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需2ml感受态细胞，大约含有2X1010个大肠杆菌细胞，也就是说，每200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18 DNA 转化率的用途 利用转化率和重组率等参数可以帮助设计D

26、NA重组实验规模例如，某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107/mg载体，经切接处理后的载体转化率比天然的载体低100倍，欲获得104 4个 重组克隆，需投入多少载体DNA进行重组实验？若重组率为100%，则转化后产生104个重组克隆需要：104/107 X 10-2=0.1 mg 载体DNA 考虑到实验系统的重组率为20%，所以实际投入载体应为：0.1/20%=0.5 mg 载体DNA 载体投入量确定后，外源DNA的投入量即可按10 1的要求算出（5 mg），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选 转化率的影响因素载体及DNA重组分子方面：载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体

27、细胞，其转化率不同 载体的空间构象：质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级 插入片段的大小：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低 转化率的影响因素受体细胞方面：受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高 转化方法方面：受体细胞的预处理：影响最大供受体的比例：Ca2+诱导转化 0.1 ml 感受态细胞 50 ng DNA 转化方法：Ca2+诱导转化 106-107/mg DNA 原生质体转化 109 个原生质体 50 ng DNA 原生质体转化 105-106/mg DNA l-DNA转染 107-108/mg DNA 电穿孔转化 106-109/mg DNA 3、转化细胞的扩增扩增操作 转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如：Ca2+诱导转化后的37培养一个小时 原生质体转化后的再生过程 l噬菌体转染后的30培养等，均属扩增操作 扩增操作的目的增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序 使载体分子上的标记基因扩增和表达，便于筛选 表达外源基因，便于筛选和鉴定