第5章-花香遗传课件.ppt

1、第5章 花香遗传 花香是观赏植物“色、香、形”三要素之一，一直是园林植物的育种的重要目标。花香自然界主要是为了吸引授粉者授粉，吸引草食动物的天敌，或者染病后作为信号激起免疫反应。花香人类世界，香料香精、轻工业原料，保健品。4.1 花香挥发物的生物合成花香挥发物主要3类物质，萜类化合物、苯丙酸类化合物/苯环型化合物、脂肪酸衍生物。萜类化合物是花香挥发物中最大的一类，包括单萜和倍半萜，它们起源于甲羟戊酸途径。苯丙酸类化合物/苯环型化合物起源于莽草酸途径，以苯丙氨酸为起始。脂肪酸衍生物起源于丙二酸途径。4.2 与花香相关的基因 芳樟醇合成酶基因1995年Pichersky 从仙女扇的花中分离纯化出L

2、IS，该酶以GPP为底物，控制S-芳樟醇的合成。芳樟醇是广泛存在于植物中的花香挥发物，属于单萜类，具有清甜的香味。1996年Dudareva获得完整的基因序列，此酶是第1个分离到的花香合成基因，由870个氨基酸组成，具有典型的金属辅助因子捆绑区域DDXXD.丁子香酚-O-甲基转移酶基因（IEMT）1997年，Wang等从仙女扇的花中分离纯化出IEMT，该酶以腺苷甲硫氨酸为甲基供体，以丁子香酚和异丁子香酚为前体，将甲基转移至丁子香酚和异丁子香酚第4位羟基上，形成甲基丁子香酚和甲基异丁子香酚，二者是许多植物中重要的花香成份。苯甲醇乙酰基转移酶基因（BEAT）挥发性酯类对于吸引昆虫授粉具有重要作用。

3、乙酸苄酯是吸引飞蛾授粉的最常见花香物质。1998年，Dudareva等从仙女扇中分离出BEAT,该酶以乙酰CoA为乙酰基供体，以苯甲醇为前体，将乙酰基转移至苯甲醇上形成乙酸苄酯。该酶由433个氨基酸组成。水杨酸羧基位甲基转移酶基因（SAMT）水杨酸甲酯是广泛存在于植物中苯环型酯类化合物。不但是重要的花香成分，而且在植物的防御机制中扮演着重要角色。Ross 等从仙女扇的花中部分分离纯化出SAMT，该酶以腺苷甲硫氨酸为甲基供体，以水杨酸为前体，将甲基转移至水杨酸的羧基上，形成水杨酸甲酯。Pott 等用同源序列法又从多花黑蔓藤克隆出SAMT 基因。该基因氨基酸序列与仙女扇中的SAMT 具有56%的同

4、源性。苯甲醇苯甲酰基转移酶（BEBT）2002 年DAuria 等采用表达序列标签（EST）文库搜索结合cDNA 末端快速扩增（RACE）技术从仙女扇中获得了BEBT 基因cDNA 的全长。该基因编码区由456 个氨基酸组成，与植物酰基转移酶基因序列具有很大的同源性，属于酰基转移酶中的BAHD 家族。苯甲醇苯甲酰基转移酶以苯甲酰辅酶A 为苯甲酰基供体，以苯甲醇为前体，将苯甲酰基转移至苯甲醇上，形成苯甲酸苄酯。苯甲酸羧基位甲基转移酶（BAMT）苯甲酸甲酯是金鱼草花香成分的主要组分。Murfitt 等从金鱼草的花中分离纯化出BAMT，该酶以腺苷甲硫氨酸为甲基供体，以苯甲酸为前体，将甲基转移至苯甲酸

5、的羧基上，形成苯甲酸甲酯。该基因氨基酸序列除了与仙女扇中的SAMT具有40%的同源性以外，与基因库中其它基因序列没有明显的相似性。因此BAMT 和SAMT 定义为一类新的羧基位甲基转移酶，即甲基转移酶-7 家族。罗勒烯合成酶和月桂烯合成酶 罗勒烯和月桂烯都是广泛存在于植物花香中的单萜类物质。罗勒烯合成酶和月桂烯合成酶都以GPP 为底物，分别控制 罗勒烯和月桂烯的合成。罗勒烯合成酶基因的氨基酸序列与月桂烯合成酶基因具有92%的同源性，共同属于萜烯合成酶家族的Tps-g 亚家族苯甲酸/水杨酸羧基位甲基转移酶（BSMT）水杨酸甲酯和苯甲酸甲酯都是广泛存在于植物中的苯环型酯类化合物，两者在野生烟草的花

6、香中大量存在。苯甲酸/水杨酸羧基位甲基转移酶以腺苷甲硫氨酸为甲基供体，以苯甲酸和水杨酸为前体，将甲基分别转移至苯甲酸和水杨酸的羧基上，形成苯甲酸甲酯和水杨酸甲酯。该酶在野生烟草中对于苯甲酸和水杨酸具有同样的催化能力，所以定义为BSMT。大牻牛儿烯D 合成酶（germacrene D synthase）大牻牛儿烯D也是广泛存在于植物中的花香挥发物，属于倍半萜烯类。Guterman 等利用功能基因组学的方法从现代月季（Rosa hybrida）中克隆出一个新的花香相关基因，即大牻牛儿烯D 合成酶基因。大牻牛儿烯D 合成酶以法尼基焦磷酸酯（FPP）为底物，控制大牻牛儿烯D 的产生。间苯三酚氧位甲基转

7、移酶（POMT）和苔黑酚氧位甲基转移酶（OOMT）1,3,5-三甲氧基苯是月季花香中含量最丰富的成分，要以间苯三酚为前体，经过3 个酶的催化才能形成。Wu 等从中国月季（Rosa chinensis）中克隆出间苯三酚氧位甲基转移酶基因。间苯三酚氧位甲基转移酶以间苯三酚为底物，以腺苷甲硫氨酸为甲基供体，控制合成苔黑酚。Lavid 等从现代月季中克隆出两个苔黑酚氧位甲基转移酶基因OOMT1 和OOMT2。OOMT1 以POMT 的催化产物苔黑酚为底物，控制合成3,5-二甲氧基苯酚，然后OOMT2 以3,5-二甲氧基苯酚为底物，控制合成1,3,5-三甲氧基苯醇类乙酰基转移酶（AAT）Shalit 等

8、从现代月季中克隆出醇类乙酰基转移酶基因。该基因序列编码区由458 个氨基酸组成，与仙女扇中的BEAT 基因序列有较高的同源性。在现代月季中，AAT 以乙酰辅酶A 为乙酰基供体，主要以香叶醇和香茅醇为底物，催化乙酸香叶酯和乙酸香茅酯的合成，所以又称为香叶醇/香茅醇乙酰基转移酶。同时1-辛醇、2-苯乙醇、苯甲醇和苯乙醇等也可以作为底物。苯甲醇/苯乙醇苯甲酰基转移酶（BPBT）苯甲酸苄酯和苯甲酸苯乙酯在矮牵牛的花香成分中占有相对较高的含量。该基因的氨基酸序列与烟草的BEBT 基因和仙女扇的BEAT 基因都具有较高的同源性。苯甲醇/苯乙醇苯甲酰基转移酶以苯甲酰辅酶A为苯甲酰基供体，以苯甲醇和苯基乙醇为

9、前体，将苯甲酰基转移至苯甲醇和苯乙醇上，形成苯甲酸苄酯和苯甲酸苯乙酯。松柏醇酰基转移酶（CFAT）矮牵牛的花香成分中含有丰富的异丁子香酚，而异丁子香酚是以乙酸松柏酯为底物，由异丁子香酚合成酶催化形成的。Dexter 等从矮牵牛中分离克隆出控制乙酸松柏酯合成的松柏醇酰基转移酶基因。松柏醇酰基转移酶以松柏醇为底物，以乙酰辅酶A 为酰基供体，控制合成乙酸松柏酯，在异丁子香酚合成酶的催化下合成芳香物质异丁子香酚。4.3 花香产物的调控空间调控大多数植物的花香都来自花瓣，同时花的其它器官如雌蕊、雄蕊等也能散发出少量香味。仙女扇中的LIS、IEMT、BEAT 和SAMT，月季中的POMT、OOMT、AAT

10、 和大牻牛儿烯D 合成酶，矮牵牛中的BPBT 和CAFT 在各自的花瓣中都具有最大的活性。金鱼草中的BAMT、罗勒烯合成酶和月桂烯合成酶在其花瓣的上下裂片中具有最大的活性，在花粉管和花药上也有一些活性，但是在其它器官诸如雌蕊、花萼和子房中则都没有这些酶活性。通过原位杂交和免疫学方面的试验表明，LIS 基因和IEMT 基因在仙女扇花的表皮细胞中特异表达，BAMT 基因则在金鱼草花的上裂片和下裂片表皮层的锥形细胞中特异表达，在花筒表皮细胞中表达量很少。这些结果说明，花香相关的酶在花器官的表皮细胞中催化合成相关的花香产物，便于这些花香产物以挥发的方式直接散播到空气中。时间调控花香物质的散发受到花发育

11、过程的调控，一般都是在花开放后的一段时间内达到顶峰，然后逐渐下降。LIS 和SAMT 属于第1 种模式，它们的活性在成熟的花芽和初开的花中逐渐增加，到花开败时开始逐渐下降。此时尽管各自的产物芳樟醇和水杨酸甲酯已经停止产生了，但它们依然有相当于最大活性时40%50%的活性。第2 种模式以IEMT 和BEAT 为代表，它们的活性在花的生长过程中逐渐增加，达到最高点后活性基本保持不变直到花凋谢，但它们各自的产物含量却随着花的凋谢逐渐下降。另外月季中的AAT 和矮牵牛中的BPBT 也属于这种模式。4.4 花香基因工程 多年来园林植物的遗传育种主要集中在花型、花色、抗病、延长瓶插寿命等方面，这些方面的改

12、良往往相互影响从而导致花的香味的丢失。近年来随着花香分子生物学的研究不断深入，也逐渐发展出一些方法进行花香的遗传改良。导入新的外源基因Lcker 等将从仙女扇中克隆的LIS 基因导入矮牵牛，在转基因植株的花瓣和叶片中有该酶的活动。然而在花中只产生少量的芳樟醇，而非挥发性的芳樟醇的配糖在转基因植株中大量积累。Lavy 等又将LIS基因导入了康乃馨中，在转化植株的叶和花中发现有芳樟醇及其氧化物的产生。尽管有芳樟醇的产生，但是人类的嗅觉感觉不到芳香的改变。Aranovich 等从仙女扇中克隆的BEAT 基因导入洋桔梗，在加入外源底物苯甲醇的情况下转化植株的花和叶中都有乙酸苄酯的产生，但在没有外源底物

13、的情况下却没有相应的产物出现。El Tamer 等和Lucker 等分别将从柠檬中获得的3个单萜合成酶基因导入烟草中，在转基因的烟草植株的花和叶中，这些酶以GPP 为底物，控制合成-蒎烯、柠檬烯、-萜品烯以及一些其它产物。更重要的是人类的嗅觉可以感觉到这些香味的存在。转基因的方法改良花香品质是切实可行的，但是也有一些问题需要注意：一是从转化植株中产生的芳香挥发物可能被修饰成非挥发性的物质；二是在转化植株中缺少合适的底物产生相应芳香挥发物；三是即便在转化植株中产生挥发性物质，但也可能不足以被人类的嗅觉所感知。调控植物内源基因的表达通过阻断其它相关代谢途径，改变代谢物质组成，可以增加目的产物的合成

14、，增强植物的香气。苯甲酸和花青素均来自苯丙酸类代谢途径，形成花青素的一个关键酶是黄酮3-羟化酶（F3H）。Zuker 等将反义F3H 序列转入康乃馨，大大减弱了转基因植株中F3H基因的表达和酶活性，封锁了花青素合成途径，从而使苯甲酸大大增加。转基因植株不仅花色发生了变化，GC-MS 分析表明，香味成分甲基苯甲酸合成量也有所增加，并且这种芳香的改变能被嗅觉所感知。Underwood 等利用RNA 干涉技术沉默了矮牵牛中BSMT 基因，导致转基因植株中缺少主要的花香产物苯甲酸甲酯。这种改变能轻易地被人类的嗅觉捕捉到。Verdonk 等将新克隆的矮牵牛ODORANT1 转录调控子转入矮牵牛品种Mitchell中，期望能增加矮牵牛花香物质的释放量，但转基因植株的苯基/苯丙烷类芳香化合物释放量却明显下降，说明同源ODORANT1 基因的导入产生了共抑制.