硕士研究生课课件.ppt
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- 硕士研究生 课件
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1、1生物系统中目标蛋白分子的分析与鉴定生物系统中目标蛋白分子的分析与鉴定2生物系统中目标蛋白分子的分析与鉴定生物系统中目标蛋白分子的分析与鉴定三个关键问题三个关键问题:v目标蛋白分子病理条件下的序列变化(测序)目标蛋白分子病理条件下的序列变化(测序)v避免目标蛋白分子的技术性降解(避免目标蛋白分子的技术性降解(-70-70 C C条件下保存,实验操条件下保存,实验操作通常在冰浴下进行,与此同时要作通常在冰浴下进行,与此同时要加全蛋白酶抑制剂)加全蛋白酶抑制剂)v结合实验目的,选择合适的分析方法(定性与定量,相对定结合实验目的,选择合适的分析方法(定性与定量,相对定量与绝对定量)量与绝对定量)3生
2、物系统中总蛋白质的定量q凯式(Kjedahl)定氮法q光吸收法q双缩脲法q福林-酚法q考马氏亮兰G-250法q氨基酸分析法qBCA法4凯式(Kjedahl)定氮法最早的经典方法。各种蛋白质的含氮量相对恒定,1416。计算公式:蛋白质量=含氮量/16%=6.25含氮量。实验步骤如下:注意事项:本法非常灵敏,务必避免外界氨的干扰。一定量蛋白质硫酸铵溶液氨气蛋白质含氮量蛋白质含量(NH4)3BO3浓硫酸浓硫酸NaOH蒸馏蒸馏H3BO3HCl,滴定滴定指示剂指示剂5光吸收法光吸收法因为芳香族氨基酸Tryptophan和Tyrosine的存在,使得Proteins溶液在280nm呈现特征性吸收峰。以此来
3、定量溶液中的Proteins。一个经验公式:当Proteins溶液A280=1时,溶液中Proteins的浓度=1mg/ml。各种Protein所含芳香族Amino acid的含量是不同的,有时会有较大差异,因此光吸收法是一种较粗略的蛋白质定量方法。有时Proteins样品中有Nucleic acids存在,Nucleic acids也有紫外吸收,因此会对Proteins的测定产生干扰。这时采取分别测定280nm和260nm光吸收值,并以下式计算。蛋白质浓度(mg/ml)1.45A2800.74A260。6光吸收法光吸收法(continue)最准确的办法是,首先得到Target Protein
4、在280nm的吸光系数,其次针对性地测定该Target Protein溶液的280nm吸光度值,最后再利用公式计算溶液中Target Protein的浓度(C=A280/L,L:比色杯内径cm)。测定Target Protein在280nm的吸光系数,必须首先得到干燥的该Target Protein纯品。在105C下恒重后,精确称量110mg,再定量溶于一定体积的蒸馏水中,通常浓度为1mg/ml,测定溶液280nm光吸收,计算得到吸光系数。7双缩脲法双缩脲法q基于蛋白质链肽键“CONH”有双缩脲反应特性即,Proteins在碱性溶液中与Cu2发生络合反应显蓝色。q受Proteins特异性影响较
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