白血病分子生物学课件.ppt

1、白血病分子生物学白血病分子生物学白血病分子生物学白血病分子生物学白血病的分子机制白血病的分子机制白血病的分子检测白血病的分子检测白血病分子检测的临床应用白血病分子检测的临床应用白血病的分子机制白血病的分子机制基因基因(gene)：合成有功能的蛋白质多肽链或合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所所必需的全部核酸序列。必需的全部核酸序列。癌基因癌基因(oncogene)：细胞或病毒中存在的，能诱导细胞或病毒中存在的，能诱导正常细胞转化并使之获得新生物特征的基因。正常细胞转化并使之获得新生物特征的基因。癌基因活化的方式：癌基因活化的方式：点突变点突变 染色体重排染色体重排 基因扩增基因扩增抑癌基因抑癌基

2、因(tumor suppressor genes)：指一类基因，指一类基因，其产物对细胞生长增殖起负调控的作用，并能潜在抑其产物对细胞生长增殖起负调控的作用，并能潜在抑制细胞的恶变。制细胞的恶变。白血病的分子机制白血病的分子机制白血病的分子机制白血病的分子机制增殖增殖过度过度分化分化阻断阻断凋亡凋亡受抑受抑“二次打击二次打击”学说学说D.Gary Gilliland Best Practice&Research Clinical Haematology.2003;16:409-417白血病的分子检测白血病的分子检测Southern blotNorthern blotWestern blotFI

3、SHPCR测序测序芯片芯片白血病的分子检测白血病的分子检测PCR反应原理反应原理N=N0 x (1+E)n N：扩增子数量：扩增子数量N0：起始模板数量：起始模板数量E：扩增效率：扩增效率n：循环数：循环数白血病的分子检测白血病的分子检测PCR理论方程理论方程白血病的分子检测白血病的分子检测PCR方法优点方法优点 快速快速 灵敏灵敏 特异特异PCR方法缺点方法缺点 假阳性假阳性 假阴性假阴性白血病的分子检测白血病的分子检测PCR：仅适用于染色体断裂点丛集于相对小仅适用于染色体断裂点丛集于相对小的范围内（的范围内（2kb2kb），如），如T-ALL中中SIL-TAL1。RT-PCR：可用于染色体

4、可用于染色体断裂点跨越很大的断裂点跨越很大的区域的融合基因。区域的融合基因。巢式巢式RT-PCR：可显著提高反应的特异性，可显著提高反应的特异性，增加扩增效率。增加扩增效率。RQ-PCR：可定量扩增产物。可定量扩增产物。白血病的分子检测白血病的分子检测RQ-PCR（Real-time Quantitative PCR）荧光标记扩增产物荧光标记扩增产物 荧光标记荧光标记引物引物 特异性荧光标记特异性荧光标记探针探针 TaqMan探针、分子信标、杂交双探针探针、分子信标、杂交双探针 荧光染料直接结合荧光染料直接结合扩增产物扩增产物 SYBR Green I与与DNA双链结合双链结合 动态监测荧光信

5、号变化动态监测荧光信号变化TaqMan探针法探针法特异性高特异性高多重基因定量多重基因定量成本较高成本较高SYBR Green I 法法成本低成本低最适合初步筛查最适合初步筛查熔解曲线功能熔解曲线功能无法多重检测无法多重检测无模板特异性无模板特异性灵敏度低灵敏度低白血病的分子检测白血病的分子检测CT值：荧光信号有统计学意义显著增长值：荧光信号有统计学意义显著增长（穿过阈值线）时的循环次数（穿过阈值线）时的循环次数CT值与起始模板量成反比值与起始模板量成反比白血病的分子检测白血病的分子检测RQ-PCR的检测系统：的检测系统：该系统内置了该系统内置了96孔孔PCR仪，且在每个反应孔上仪，且在每个反

6、应孔上均有一个监测探头用于检测均有一个监测探头用于检测PCR反应管中的荧反应管中的荧光强度。平均每光强度。平均每8-12秒就检测一次，以达到实秒就检测一次，以达到实时检测的目的。时检测的目的。系统中的电脑系统同时不断地分析来自检测系系统中的电脑系统同时不断地分析来自检测系统的信息，不断计算每个反应管中的荧光强度，统的信息，不断计算每个反应管中的荧光强度，并最终得到并最终得到CT值。值。该系统可以根据标准品的该系统可以根据标准品的CT值和拷贝数自动绘值和拷贝数自动绘制标准曲线，并计算未知样品中的目的基因拷制标准曲线，并计算未知样品中的目的基因拷贝数。贝数。白血病的分子检测白血病的分子检测RQ-P

7、CR方法优点：方法优点：灵敏而特异灵敏而特异 起点定量起点定量 闭管化学（污染的风险低）闭管化学（污染的风险低）没有没有PCR后处理（无需走胶，拍照等）后处理（无需走胶，拍照等）高度自动化高度自动化 定性：单数据点测定定性：单数据点测定 定量：多数据点测定定量：多数据点测定 能做基因分型及能做基因分型及SNP鉴定鉴定RQ-PCR的操作流程的操作流程从细胞或组织中抽提从细胞或组织中抽提DNA或或RNA用用PCR或或RT-PCR扩增特异片段扩增特异片段 将将PCR产物克隆到合适的载体上产物克隆到合适的载体上纯化，定量和系列稀释质粒纯化，定量和系列稀释质粒DNA或或RNA 体外转录成体外转录成RNA

8、片段（仅用于片段（仅用于RNA样品）样品）构建标准曲线（构建标准曲线（CT lgcopy）样品的定量检测样品的定量检测校正样品基因拷贝数校正样品基因拷贝数白血病分子检测的临床应用白血病分子检测的临床应用白血病的分子生物学检查对白血病诊断分白血病的分子生物学检查对白血病诊断分型及预后判断有以下几方面意义：型及预后判断有以下几方面意义：补充补充MIC检查的不足检查的不足 发现新的亚型发现新的亚型 监测白血病的微小残留病灶（监测白血病的微小残留病灶（MRD）为研究白血病的发病机制打下基础为研究白血病的发病机制打下基础 白血病分子检测的临床应用白血病分子检测的临床应用 PCR方法检测方法检测MRD常用

9、的分子标志常用的分子标志 AML1-ETOt(8;21)(q22;q22)68%原发性原发性AML，在，在M2中的阳性率为中的阳性率为2040%，在，在M2b中阳性率为中阳性率为90%少见于少见于M4和和M1，极少见于，极少见于MDS和骨髓增生综和骨髓增生综合症合症 AML1-ETO+白血病细胞有一定程度的分化能白血病细胞有一定程度的分化能力，能分化至较成熟的嗜中性粒细胞和嗜酸性力，能分化至较成熟的嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，且对化疗反应较敏感粒细胞，且对化疗反应较敏感 AML1-ETO+患者对大剂量阿糖胞苷治疗效果患者对大剂量阿糖胞苷治疗效果好，具有较高的缓解率，无病生存期长，预后好，具有较

10、高的缓解率，无病生存期长，预后较其他较其他AML亚型（亚型（M3除外）好除外）好 AML1-ETO对初发患者进行对初发患者进行t(8;21)和和AML1-ETO融融合基因的检测对其预后判断及治疗方案合基因的检测对其预后判断及治疗方案的制定相当重要的制定相当重要 AML1-ETO定性结果不能用于评价患者定性结果不能用于评价患者MRD情况情况 RQ-PCR能实时反映体内能实时反映体内AML1-ETO水水平。连续定量平。连续定量AML1-ETO转录本水平可转录本水平可判定有高复发风险的患者，以便及早治判定有高复发风险的患者，以便及早治疗干预以防血液学复发疗干预以防血液学复发 AML1-阴性阴性 ET

11、O+C-KIT基因突变基因突变C-KIT为为III型受体酪氨酸激酶家族（还包括型受体酪氨酸激酶家族（还包括c-FMS，PDGFR和和c-KIT）成员之一）成员之一AML1-ETO可诱导性表达的转基因小鼠，并不可诱导性表达的转基因小鼠，并不导致白血病发生导致白血病发生C-KIT突变可见于伴突变可见于伴inv(16)的的M4以及伴以及伴t(8;21)的的M2患者患者26/54例例(48.1%)M2b患者中检测到患者中检测到C-KIT基因基因突变突变57例不伴例不伴t(8;21)的其他类型血液肿瘤患者均未的其他类型血液肿瘤患者均未检测到检测到C-KIT基因突变基因突变以上结果提示以上结果提示C-KI

12、T突变与突变与M2b密切相关密切相关(R=0.94,P0.01)C-KIT基因突变基因突变C-KIT基因结构基因结构JMC-KIT基因突变基因突变外周血白细胞计数外周血白细胞计数C-KIT基因突变基因突变生存曲线生存曲线PML-RARt(15;17)(q22;q21)98%M3患者患者继继t(15;17)之后，又先后发现之后，又先后发现4种种M3特异的累及特异的累及RAR的变异性染色体易位：的变异性染色体易位：t(11;17)(q23;q21)，t(5;17)(q35;q21)，t(11;17)(q13;q21)以及以及dup(17)(q21.3;q23)，分别产生，分别产生PLZF-RAR，

13、NPM-RAR，NuMA-RAR和和STAT5b-RAR融融合基因合基因临床上，具有临床上，具有PLZF-RAR或或STAT5b-RAR融融合基因患者对合基因患者对ATRA治疗不敏感，其余三种染治疗不敏感，其余三种染色体易位患者经色体易位患者经ATRA治疗可获完全缓解治疗可获完全缓解 PML-RARAPL累及的累及的RAR基因及其伙伴基因结构示意图基因及其伙伴基因结构示意图 PML-RAR由于由于PML基因断裂点基因断裂点不同产生不同产生3种不同的种不同的PML-RAR异构体异构体 约约55%的的M3患者为患者为L型，型，40%为为S型，型，5%为为V型，且每位患者只表达一种型，且每位患者只表

14、达一种PML-RAR融合蛋白融合蛋白形态学上形态学上S型白血病细胞常为低分化的并型白血病细胞常为低分化的并且这些患者可见继发细胞遗传学异常，且这些患者可见继发细胞遗传学异常，V型型APL患者的白血病细胞体外对患者的白血病细胞体外对ATRA的的敏感度低敏感度低 PML-RARRT-PCR检测检测PML-RAR是敏感且特异的是敏感且特异的APL诊断方法，还能用于治疗后诊断方法，还能用于治疗后MRD监监测。测。PML-RAR阳性提示的分子复发常阳性提示的分子复发常早于临床复发早于临床复发3-63-6个月，为临床采取进一个月，为临床采取进一步治疗措施提供了保障步治疗措施提供了保障 RQ-PCR能有效反

15、映患者在发病、治疗、能有效反映患者在发病、治疗、缓解、复发整个过程的白血病细胞负荷，缓解、复发整个过程的白血病细胞负荷，在在MRD监测中比监测中比RT-PCR具有更高价值具有更高价值 L+阴性阴性 S+FLT3基因突变基因突变Fms-related tyrosine kinase 3FLT3为为III型受体酪氨酸激酶家族（还包括型受体酪氨酸激酶家族（还包括c-FMS，PDGFR和和c-KIT）成员之一，该类受）成员之一，该类受体因在造血过程中造血细胞的增殖和存活中发体因在造血过程中造血细胞的增殖和存活中发挥重要调控作用挥重要调控作用综合国外各研究报道，综合国外各研究报道，FLT3-ITD和和D

16、835突变突变在在AML中阳性率分别为中阳性率分别为24%(385/1585)和和7%(30/429)，总阳性率超过，总阳性率超过30%，使其成为，使其成为AML中最普遍发生突变的靶基因中最普遍发生突变的靶基因许多临床研究发现，许多临床研究发现，FLT3突变还与临床预后突变还与临床预后密切相关，尤对密切相关，尤对60岁以下的岁以下的AML患者，患者，FLT3突变患者预后较差，且可独立于核型之外突变患者预后较差，且可独立于核型之外FLT3基因突变基因突变FLT3基因突变基因突变FLT3基因主要突变类型基因主要突变类型FLT3基因突变基因突变mut-FLT3信号通路信号通路FLT3基因突变基因突变

17、外周血白细胞计数外周血白细胞计数020406080100120140160 FLT3-ITD-FLT3-ITD+APL患者初发时外周血WBC计数(x109)CBF-MYH11inv(16)(p13;q22)及及t(16;16)(p13;q22)主要见于主要见于M4Eo，10%不伴异常嗜酸细胞不伴异常嗜酸细胞M4，少见于少见于M2CBF-MYH11融合蛋白通过干扰核心结融合蛋白通过干扰核心结合因子（合因子（core binding factor,CBFcore binding factor,CBF）的）的转录激活作用而致病转录激活作用而致病 具有具有CBF-MYH11的患者对化疗敏感，的患者对化

18、疗敏感，预后较好，故提高检测率尤具临床意义预后较好，故提高检测率尤具临床意义 CBF-MYH11CBF-MYH11具有多种变异型，其中最具有多种变异型，其中最常见的为常见的为A型，占型，占80%RT-PCR检测检测CBF-MYH11进行进行MRD监监测显示，大部分患者在完全缓解时测显示，大部分患者在完全缓解时PCR转阴，但仍有小部分长期存活者转阴，但仍有小部分长期存活者PCR仍仍为阳性为阳性最新研究采用最新研究采用RQ-PCR检测检测CBF-MYH11转录本水平来评价转录本水平来评价M4Eo患者患者MRD情况，预示复发情况，预示复发 NPM基因突变基因突变Nucleophosmin，为核，为核

19、-浆穿梭蛋白，调控浆穿梭蛋白，调控p53-ARF通路通路见于见于50%核型正常的核型正常的AML患者，而在伴低危患者，而在伴低危/高危核型患者中极少见高危核型患者中极少见主要见于主要见于M4/M5中中第第12号外显子的插入号外显子的插入/缺失缺失伴此突变患者伴此突变患者WBC计数高计数高目前，此突变的预后价值各研究组报道不一，目前，此突变的预后价值各研究组报道不一，尚待进一步证实尚待进一步证实DEK-CANt(6;9)(p23;q34)主要见于主要见于M2或或M4，也见于，也见于M1，MDS-RAEB伴伴DEK-CAN的患者年龄一般较轻，且预后较的患者年龄一般较轻，且预后较差差此类患者进行分子

20、监测有助于判断患者预后，此类患者进行分子监测有助于判断患者预后，调整治疗方案调整治疗方案 N-RAS基因突变基因突变为为RAS基因家族成员之一，染色体定位于基因家族成员之一，染色体定位于1p32.2。具有。具有GTP/GDP结合和结合和GTPase活性，活性，调控正常细胞的生长调控正常细胞的生长此基因突变存在于此基因突变存在于11-30%AML突变热点位于突变热点位于codon12,13和和61在在inv(16)/t(16;16),inv(3)/t(3;3)中突变率较高，中突变率较高，而在而在t(15;17)中低中低伴此突变患者外周血伴此突变患者外周血WBC计数低计数低该突变预后意义尚不明该突

21、变预后意义尚不明WT-1基因高表达基因高表达Wilms tumor 1是无特异分子异常的急性白血病患者理是无特异分子异常的急性白血病患者理想的想的MRD检测指标检测指标伴此基因高表达者预后差，且表达程度伴此基因高表达者预后差，且表达程度与预后相关与预后相关BCR-ABLt(9;22)(q34;q11)1530%成人成人ALL及及35%儿童儿童ALL 9号染色体的断裂点与号染色体的断裂点与CML相同，但相同，但22号染色号染色体断裂点具有异质性体断裂点具有异质性 此融合蛋白此融合蛋白p190刺激细胞增殖的能力比刺激细胞增殖的能力比p210要要强。在转基因试验中观察到强。在转基因试验中观察到p19

22、0诱发的白血病诱发的白血病具有起病早、发展快和恶性程度高的特点具有起病早、发展快和恶性程度高的特点BCR-ABL+ALL患者预后差，患者预后差，5年存活率年存活率20%，因此这些患者在缓解后需进行骨髓移植治疗因此这些患者在缓解后需进行骨髓移植治疗 BCR-ABL对于自体或异体移植对于自体或异体移植ALL患者，移植前患者，移植前后后BCR-ABL的有无以及的有无以及BCR-ABL的转录的转录本类型与预后有关本类型与预后有关 e1a2+阴性阴性E2A-PBX1t(1;19)(q23;p13)56%儿童儿童ALL和和3%成人成人ALL 此类患者具有高的白细胞计数，高的血清乳酸此类患者具有高的白细胞计

23、数，高的血清乳酸脱氢酶及中枢神经系统症状，预后差，平均无脱氢酶及中枢神经系统症状，预后差，平均无病生存期（病生存期（DFS）仅）仅6个月，个月，3年年DFS为为20%，需给予这些患者强化治疗才能获得较好的预后需给予这些患者强化治疗才能获得较好的预后核型和核型和E2A-PBX1检测对此类患者的诊断和治检测对此类患者的诊断和治疗方案的选择至关重要疗方案的选择至关重要E2A-PBX1的预后价值需更多的临床研究证实的预后价值需更多的临床研究证实 TEL-AML1t(12;21)(p13;q22)25%儿童儿童ALL，是儿童，是儿童ALL中最常见的分子异中最常见的分子异常常 目前为止尚未在目前为止尚未在

24、T-ALL，AML或或NHL中发现中发现t(12;21)，在婴儿白血病中极少报道，在成人，在婴儿白血病中极少报道，在成人白血病患者中频率很低（白血病患者中频率很低（2%）此类患者发病年龄小（此类患者发病年龄小（2岁岁10岁），岁），WBC计计数低（数低（50 000/L），免疫表型为前），免疫表型为前B-ALL此类患者对治疗反应佳，完全缓解时间长，预此类患者对治疗反应佳，完全缓解时间长，预后好后好 TEL-AML1由于由于12p和和21q末端在常规显带中很相似，末端在常规显带中很相似，因此常规细胞遗传学方法检出率仅因此常规细胞遗传学方法检出率仅0.05%，需应用需应用FISH或或RT-PCR方

25、法提高检测阳方法提高检测阳性率性率TEL基因重排是独立预后因素，基因重排是独立预后因素，RT-PCR检测检测TEL-AML1融合基因能将低危险度融合基因能将低危险度与高危险度的与高危险度的ALL患者区分开来。因此患者区分开来。因此早期检测早期检测TEL-AML1融合基因对临床预融合基因对临床预后，确定合适的治疗方案都有重要意义后，确定合适的治疗方案都有重要意义 MLL相关融合基因相关融合基因 累及累及MLL基因的分子异常见于基因的分子异常见于5.2%AML，22%ALL和混合性白血病及某些淋巴瘤，还可和混合性白血病及某些淋巴瘤，还可见于治疗相关白血病，尤接受见于治疗相关白血病，尤接受topoi

26、somerase II抑制剂治疗的患者抑制剂治疗的患者 MLL基因涉及五十余种染色体易位，产生不同基因涉及五十余种染色体易位，产生不同的融合蛋白，且每种融合蛋白都与特定的白血的融合蛋白，且每种融合蛋白都与特定的白血病表型相关。最常见的有：病表型相关。最常见的有：t(4;11)(q21;q23)MLL-AF4融合基因融合基因 ALL t(9;11)(p22;q23)MLL-AF9融合基因融合基因 AML t(11;19)(p13;q23)MLL-ENL融合基因融合基因 AML及及ALLMLL相关融合基因相关融合基因至今，至今，MLL相关融合蛋白的致病性还不相关融合蛋白的致病性还不清楚，推测其可能

27、具有双重作用：清楚，推测其可能具有双重作用：融合蛋白可能获得新的功能，促使融合蛋白可能获得新的功能，促使细胞转化细胞转化 MLL发生断裂后，缺失锌指结构域发生断裂后，缺失锌指结构域的的MLL不能与不能与DNA结合，失去其转录活结合，失去其转录活化功能，使受化功能，使受MLL调节的靶基因（调节的靶基因（HOX基因）表达异常，也影响造血细胞的发基因）表达异常，也影响造血细胞的发育育 MLL-AF4t(4;11)(q21;q23)t(4;11)的发生率在不同年龄段是不同的，在婴的发生率在不同年龄段是不同的，在婴儿儿ALL中最多见，为中最多见，为5070%，而在儿童和成，而在儿童和成人中较低，分别为人

28、中较低，分别为2%和和36%此类患者发病年龄低（通常此类患者发病年龄低（通常 90%CML患者患者BCR-ABL融合蛋白（融合蛋白（p210）的酪氨酸蛋白激）的酪氨酸蛋白激酶活性较正常酶活性较正常ABL高，可能是高，可能是BCR对对ABL激酶激酶活性调节区的作用所致活性调节区的作用所致由于由于5%CML患者为隐匿性患者为隐匿性Ph染色体，因此染色体，因此无无Ph染色体染色体CML患者还需使用更灵敏的分子患者还需使用更灵敏的分子检测手段如检测手段如FISH或或RT-PCR检测检测BCR-ABL融合融合基因基因RT-PCR还能区分还能区分e1-a2和和b2-a2/b3-a2二种二种BCR-ABL转

29、录本，从而区分转录本，从而区分ALL患者与患者与CML急淋急淋变患者，进而分别对两种不同患者采用不同的变患者，进而分别对两种不同患者采用不同的治疗方案治疗方案BCR-ABL巢式巢式RT-PCR检测检测BCR-ABL融合基因用融合基因用于于CML移植患者移植后移植患者移植后MRD监测。可在监测。可在患者血液学复发前的患者血液学复发前的624个月骨髓检测个月骨髓检测就呈阳性。就呈阳性。RQ-PCR还能动态观察患者治疗后还能动态观察患者治疗后BCR-ABL转录本水平变化情况，反映疗效。转录本水平变化情况，反映疗效。b3a2+b2a2+阴性阴性GATA2基因突变基因突变调控早期造血干细胞增殖分化的转录

30、因子，维调控早期造血干细胞增殖分化的转录因子，维持造血干祖细胞的增殖和自我更新能力持造血干祖细胞的增殖和自我更新能力CML急变患者中新发现急变患者中新发现GATA2基因突变，基因突变，而而CML慢性期、加速期，慢性期、加速期，AML（M1-M7），），MDS，ALL，CLL，淋巴瘤和骨髓瘤患者，淋巴瘤和骨髓瘤患者，以及正常对照均未发现该突变，可见以及正常对照均未发现该突变，可见GATA2基基因突变仅与因突变仅与CML急变相关，是急变相关，是CML疾病进展疾病进展过程中的获得性突变。总发生率为过程中的获得性突变。总发生率为12.5%（5/40），且均造成，且均造成CML急粒单变急粒单变GATA2

31、基因基因突变与突变与CML患者疾病进展和预后患者疾病进展和预后的关系有待进一步阐明的关系有待进一步阐明JAK2基因突变基因突变Janus kinase 2此基因突变主要见于此基因突变主要见于MPD和和MDS，另可，另可存在于部分存在于部分AML尤尤M2突变为突变为V617F突变去除了突变去除了JAK2 JH2负性调控，导致该负性调控，导致该基因的持续活化，赋予细胞增殖存活优基因的持续活化，赋予细胞增殖存活优势势JAK2可成为靶向治疗的靶点可成为靶向治疗的靶点MDS相关基因异常相关基因异常Delta样样(Dlk)基因编码基因编码Dlk蛋白在蛋白在MDS明明显增高者显增高者55%，而，而AML仅仅

32、10%，可能是，可能是MDS特异性基因，但作为诊断特异性基因，但作为诊断MDS的标的标志基因尚待进一步确定志基因尚待进一步确定MDS相关基因异常相关基因异常RAS此原癌基因超家族编码鸟苷三磷酸水解酶此原癌基因超家族编码鸟苷三磷酸水解酶(GTPase)调节细胞生长相关信号调节细胞生长相关信号ras癌基因的活化，尤其是癌基因的活化，尤其是N-ras的激活可在约的激活可在约35%的的MDS患者中发生患者中发生FMS为集落刺激因子为集落刺激因子1，控制单核，控制单核-巨噬细胞生长、巨噬细胞生长、分化及功能分化及功能fms基因的突变可在基因的突变可在16%的的MDS患者中发现患者中发现ras和和fms突变主要见于粒突变主要见于粒-单细胞分化的疾病，单细胞分化的疾病，即即MDS中的中的CMML，患者生存期短，转，患者生存期短，转AML多多MDS相关基因异常相关基因异常p53在在MDS时，时，p53突变较少见突变较少见(1012 Ig和和TCR 体细胞高频突变造成的多样性体细胞高频突变造成的多样性 仅限于成熟仅限于成熟B淋巴细胞淋巴细胞Ig/TCR基因重排基因重排V-D-J重排：重排：IgH,TCRB,TCRDV-J重排：重排：L,L,TCRA,TCRGIg/TCR基因重排基因重排谢谢 谢！谢！