生物竞赛-生物化学39蛋白质的生物合成及其在细胞内的降解-顶级课件《生物化学原理(第二版)(三)(79张)》.ppt
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1、第三十九章第三十九章 蛋白质的生物蛋白质的生物合成及其在细胞内的降解合成及其在细胞内的降解一参与翻译的主要生物大分子二翻译的一般特征三翻译的详细机制1.细菌的蛋白质合成2.真核生物的细胞质翻译系统3.细胞器翻译系统4.古菌的翻译系统四mRNA的质量控制五翻译的抑制剂六蛋白质在细胞内的降解核糖体的主要功能定位核糖体的主要功能定位1.A部位氨酰tRNA结合部位,也称为受体部位;2.P部位肽酰tRNA结合部位;3.E部位空载tRNA临时结合的部位;4.肽酰转移酶活性部位催化肽键形成的部位;5.mRNA结合部位;6.多肽链离开通道正在延伸的多肽链离开核糖体的通道;7.一些可溶性蛋白质因子(起始因子、延
2、伸因子和终止因子)的结合部位。核糖体的分类与组成核糖体的分类与组成 核糖体的三维结构模型和主要的功能部位核糖体的三维结构模型和主要的功能部位原核细胞核糖体的各种功能部位原核细胞核糖体的各种功能部位细菌核糖体的各种功能部位细菌核糖体的各种功能部位真核细胞多聚核糖体的结构真核细胞多聚核糖体的结构细菌多顺反子细菌多顺反子mRNA和真核生物单顺反子和真核生物单顺反子mRNA的翻译的翻译 tRNA的结构与功能的结构与功能二级结构与三级结构同工受体tRNA-携带同种氨基酸的不同tRNA个性-“第二套遗传密码”某些特殊的tRNAs1.起始tRNA:tRNAf Met 和 tRNAiMet2.校正tRNA3.
3、tmRNA常见的常见的tRNA的个性(大肠杆菌)的个性(大肠杆菌)tRNA个性丙氨酸丝氨酸缬氨酸谷氨酰胺苯丙氨酸异亮氨酸蛋氨酸受体茎中的G3:U70碱基对受体茎中G1:C72、G2:C71、A3:U70碱基对,D茎中的C11:G24碱基对反密码子反密码子,特别是其中的U反密码子,D环中的G20,3端的A73U35反密码子一种人工合成的保留有一种人工合成的保留有G3:U70的的微螺旋仍能携带微螺旋仍能携带Ala氨酰氨酰-tRNA合成酶(合成酶(aaRS)两步反应机制:1.ATP+氨基酸(AA)-AA-AMP+PPi 2.tRNA+AMP-AA-AA-tRNA+AMP 分类1.第一类 aaRS 2
4、.第二类II aaRS校对机制-在装载氨基酸水平的质量控制1.aaRS是对氨基酸“身份”进行检查唯一的场所 2.核糖体不在乎哪一种氨基酸与tRNA相连 3.实载的tRNA被修饰后仍然能起作用 4.装载前和装载后编辑 5.双筛机制两类氨酰两类氨酰-tRNA合成酶的催化机理合成酶的催化机理两类两类aaRS 第一是单体酶,含有一个平行-折叠核心和由两段同源的氨基酸一致序列HIGH和KMSKS组成的Rossman折叠,该结构模体参与ATP的结合和酶的催化。此类 aaRS识别的tRNA个性通常包括反密码子环内的核苷酸残基和受体茎,一般在受体茎小沟一侧与tRNA结合,紧握反密码子环,将tRNA接受氨基酸的
5、一端置于活性中心,最后总是先将氨基酸转移到tRNA 3端腺苷酸的2-OH上,然后再通过转酯反应转移到3-OH。由此类酶催化的氨基酸有Arg、Cys、Gln、Glu、Ile、Leu、Met、Trp、Tyr和Val。第二类通常为寡聚酶,具有另外的保守序列,由它们形成三种首尾相连的同源结构基序,其中第一种参与二聚体的形成,另一种是“签名”模体,由7段反平行的折叠、3段相邻的-螺旋和一种不多见的负责结合核苷酸的折叠组成,由它和第三种结构基序一起组成了酶活性中心的核心部分。这些酶结合tRNA分子的另一面(受体茎大沟一侧),识别的个性不包括反密码子环,最后总是将氨基酸转移到tRNA3-端腺苷酸的3-OH上
6、(苯丙氨酰-tRNA除外)。由此类酶催化的氨基酸有Ala、Asn、Gly、Asp、His、Lys、Phe、Pro、Ser和Thr。aaRS的校对机制的校对机制装载前编辑1.有时aaRS激活错误的氨基酸 2.正确的tRNA与酶的结合诱导aa-AMP的水解,而不是装载 3.aa-AMP被转移到酶的编辑中心而水解装载后编辑1.有时 aaRS 激活错误的氨基酸,并将其转移到tRNA上2.错误的aa-tRNA在被释放之前被转移到酶的编辑中心水解 双筛机制1.难以建立完美的活性中心 2.活性中心和编辑中心层层把关,排除错误的氨基酸使用双筛机制的实例使用双筛机制的实例-IleRS 一筛:酶活性中心优先结合正
7、确的同源氨基酸,体积比同源氨基酸大的因为无法进入活性中心首先被排除;二筛:酶的编辑中心对错误的非同源氨基酸进行编辑,大小合适小的误载的氨酰-AMP 或氨酰-tRNA在校对中心被水解“出局”。以 IleRS为例,如果Val进入它的活性中心,并发生了第一步反应,生成Val-AMP,但Val-AMP 会被送入编辑中心进行编辑,水解误载的Val。由于aaRS具有内在的校对机制,因此在细胞内形成误载的氨酰-tRNA的可能性非常低。氨酰氨酰-tRNA合成酶的双筛机制合成酶的双筛机制辅助蛋白因子辅助蛋白因子蛋白质合成的每一步都需要一些特殊的可溶性的蛋白质因子的参与,包括起始因子(IF)、延伸因子(EF)、释
8、放因子(RF)和核糖体循环因子(RRF),它们分别参与肽链合成的起始、延伸、肽链释放和核糖体循环。其中的某些蛋白质因子为小G蛋白。细菌参与翻译的起始因子、延伸因子和终止因子的结构与功能细菌参与翻译的起始因子、延伸因子和终止因子的结构与功能 真核生物参与翻译的起始因子、延伸因子和终止因子的结构与功能真核生物参与翻译的起始因子、延伸因子和终止因子的结构与功能 蛋白质生物合成的一般特征蛋白质生物合成的一般特征1.mRNA、tRNA和核糖体起相同的作用2.翻译的极性:阅读mRNA的方向都是从5端3端,多肽链生长的方向总是从N-端C-端。3.三联体密码 4.正确的氨基酸的参入取决于mRNA上的密码子与t
9、RNA上的反密码子之间的相互作用,与tRNA所携带的氨基酸无关 5.密码子与反密码子的相互识别遵守摆动规则6.在核糖体上同源tRNA的识别是诱导契合的过程 兔网质红细胞兔网质红细胞3H-Leu在不同的时段完成标记在不同的时段完成标记纯化全长的多肽纯化全长的多肽降低温度以降低翻译的速率降低温度以降低翻译的速率证明多肽链生长的方向总是从证明多肽链生长的方向总是从N-端端C-端的实验端的实验使用胰蛋白酶消化,分使用胰蛋白酶消化,分离肽段,用放射性对肽离肽段,用放射性对肽端位置作图端位置作图在保温在保温60分钟后分离出的分钟后分离出的珠蛋白几乎所有的珠蛋白几乎所有的Leu残残基都是带放射性的。而在保温
10、仅几分钟后分离到的基都是带放射性的。而在保温仅几分钟后分离到的珠蛋白,其带放射性的珠蛋白,其带放射性的Leu则集中在肽链的则集中在肽链的C-端端 实验实验(1962):证明证明正确的氨基酸的正确的氨基酸的参入与参入与tRNA所携带的氨基酸无关所携带的氨基酸无关 tRNACys-ACA反密码子反密码子(识别编码识别编码Cys的的UGU 密码子密码子)无细胞抽取物,氨基酸,aaRS Cys-tRNACys-ACA蛋白质含蛋白质含有有CysRNA模板UGUGUGUGUG.使用金属镍催化剂,去除巯基Ala-tRNACys-ACARNA模板UGUGUGUGUG.蛋白质含蛋白质含有有Ala遗传密码的破译遗
11、传密码的破译 Marshall Nirenberg和Heinrich Matthaei 建立了大肠杆菌无细胞翻译系统无细胞抽取物无细胞抽取物核糖体核糖体各种各种tRNA氨基酸氨基酸aaRSATP,GTP+mRNA=蛋白质蛋白质他们使用多聚核苷酸磷酸化酶得到同聚物他们使用多聚核苷酸磷酸化酶得到同聚物破译第一个遗传密码破译第一个遗传密码 在1961年,Matthaei发现,当将Poly U加到大肠杆菌无细胞翻译系统中以后,一种仅由苯丙氨酸组成的多肽即多聚苯丙氨酸被合成了,这就意味着他们成功破译出第一个密码子即UUU的密码子。即:即:nNDPs (NMP)n +nPi破译其余的遗传密码破译其余的遗传
12、密码 在1964年,由Nirenberg发明的核糖体结合技术使得遗传密码最终完全得以破译。该技术是建立在两个基本的事实上:一是人工合成的三聚核苷酸可以作为模板;二是在无GTP时,三聚核苷酸可以促进同源的氨酰-tRNA结合在核糖体上,而不生成蛋白质。这样,利用由核糖体和三聚核苷酸及其同源的氨酰-tRNA形成的三元复合物能被硝酸纤维素滤膜吸附的性质,可将结合的氨酰-tRNA与其它没有结合的氨酰-tRNA分开。通过分析结合在硝酸纤维素滤膜上的氨酰-tRNA上氨基酸的性质和原来的三聚核苷酸序列可以弄清某种氨基酸的密码子。19AAs+14C-Pro +aaRSs核糖体结合技术核糖体结合技术使用使用NC滤
13、膜过滤滤膜过滤放射性在滤出液放射性在滤出液19AAs+14C-Phe+aaRSs使用使用NC滤膜过滤滤膜过滤放射性留在滤膜上放射性留在滤膜上标准的遗传密码表标准的遗传密码表 遗传密码的主要性质遗传密码的主要性质1.简并与兼职2.密码子的选定不是随机的3.通用和例外4.不重叠5.无标点6.同一种氨基酸的不同密码子使用的频率不尽相同线粒体内遗传密码的例外线粒体内遗传密码的例外摆动规则摆动规则 摆动规则由Crick于1966年提出,用来解释一种tRNA反密码子如何能够识别一种氨基酸的几个同义密码子以及某些含有稀有碱基(如次黄嘌呤)的反密码子是怎样识别由正常碱基构成的密码子的现象。该规则的内容是:密码
14、子在与反密码子之间进行碱基配对的时候,前两对碱基严格遵守标准的碱基配对规则,第三对碱基则具有一定的自由度。但并非任何碱基之间都可以配对,当反密码子第一位碱基是A或C者,只能识别一种密码子;第一位碱基是G或U者,则能识别两种密码子;第一位碱基是I者,则能识别三种密码子。摆动规则的意义在于使得在翻译的过程中,tRNA和mRNA更容易分离。摆动规则摆动规则反密码子第一个碱基密码子第三个碱基ACGUIUGC、UA、GA、C、U在核糖体上同源在核糖体上同源tRNA的的识别是诱导契合的过程识别是诱导契合的过程 以细菌为例,在A部位上同源tRNA与mRNA的结合诱导A1492和A1493 从16SrRNA螺
15、旋44的内部环中被挤出来,同时还造成通用保守的G530从原来的顺式构象编成反式构象。在新的构象之中,A1493和A1492分别与密码子/反密码子的前两个碱基对螺旋相互作用,而G530 同时与反密码子的第二个位置和密码子的第三个位置相互作用。这些构象诱导变化的结果是密码子/反密码子的前两个碱校对受到核糖体的检查,以区分正确的Watson-Crick碱基对和错配的碱基对,而“摇摆”位置似乎能够容忍摆动规则允许的碱基对。大肠杆菌在翻译的五个阶段所必需的主要成分大肠杆菌在翻译的五个阶段所必需的主要成分翻译的详细机制翻译的详细机制 4步骤反应:1.氨基酸的活化2.起始3.延伸4.终止和释放细菌的蛋白质合
16、成细菌的蛋白质合成 氨基酸的活化1.fMet-tRNAfMet的形成2.其他氨酰-tRNA的形成 起始阶段1.起始密码子的识别2.起始复合物的形成 延伸阶段:在起始复合物形成以后,翻译即进入延伸阶段,延伸阶段所发生的主要事件是进位、转肽和移位且不断的循环。多肽链合成的终止与释放起始密码子的识别起始密码子的识别 细菌翻译系统起始密码子的识别主要是依赖于mRNA 5端的SD序列与16S rRNA3端的反SD序列之间的互补配对。SD序列位于起始密码子上游约7个碱基的区域,由45个碱基组成,富含嘌呤碱基,它是由John Shine和Lynn Dalgarno在1974年,通过比较多种原核细胞蛋白质mR
17、NA的5端核苷酸序列之后总结出来的。在16S rRNA 3端有一段富含嘧啶碱基的序列,可以和SD序列互补配对,因而被称为反SD序列。许多实验证明,正是SD序列与反SD序列的互补关系,才使得位于mRNA 的SD序列下游的第一个AUG用作起始密码子。SD序列和反序列和反SD序列序列起始复合物的形成起始复合物的形成起始复合物的形成与起始密码子的识别紧密联系在一起,起始阶段的总反应式可写成:30S+50S+mRNA+fMet-tRNAfMet+IF1+IF2+IF3+GTP 70SmRNAfMet-tRNAfMet +GDP+Pi+IF1+IF2+IF3在形成的三元复合物中,起始密码子正好处于P部位,
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