第二章-生物制药工艺技术基础课件.ppt

1、u生化药物技术工艺基础u微生物制药工艺技术基础u生物技术制药工艺技术基础u生物制药中试放大工艺设计l掌握掌握：生化活性物质的提取、分离和纯化，微生l 物菌种选育和培养。l熟悉熟悉：生物材料的来源和预处理，浓缩和干燥。l了解了解：生物技术制药工艺的技术基础，中试放大l 工艺的概念。第一节第一节 生化制药工艺技术基础生化制药工艺技术基础一、生物材料与生化活性物质（一）生化制药的生物材料来源 供生产生物药物的生物资源主要有动物、植物、微生物的组织、器官、细胞与代谢产物。应用动植物细胞培养与微生物发酵技术也是获得生物制药原料的重要途径。基因工程技术与细胞工程技术和酶工程技术更是开发生物制药资源的新途径

2、。1.动物脏器（1）胰脏 （激素、酶、多肽、核酸、多糖、氨基酸等）（2）脑（脑磷脂、肌醇磷脂、神经磷脂、神经肽等）（3）胃粘膜（胃蛋白酶、胶原蛋白酶、胃泌素、胃膜素）（4）肝脏（酶系、维生素、磷脂类、胆固醇）（5）脾脏（免疫器官，淋巴细胞）（6）小肠（糖蛋白、核苷酸酶、溶菌酶、胃肠道激素）（7）脑垂体（各种激素）（8)心脏（细胞色素C、辅酶Q10）2.血液、分泌物和其它代谢物血液、分泌物和其它代谢物血液制品：人血制剂、抗凝血酶，凝血因子，纤维蛋白原，免疫球蛋白、人血浆、干扰素、白介素等。尿液、胆汁、蛇毒、蜂毒也是重要的生物材料l蜂毒是一种成分复杂的混合物，它除了含有大量水分外，还含有苦干种蛋白

3、质多肽类、酶类、组织胺、酸类、氨基酸及微量元素等 l蜂毒的临床应用 1.结缔组织疾病（风温病和类风温性关节炎）2.神经炎和神经痛（坐骨神经痛、三叉神经痛、枕神经痛、背神经根炎）3.心血管疾病（高血压动脉粥样硬化症、静脉血栓形成、血栓闭塞性脉管炎和动脉内膜炎）4.变应性疾病：支气管哮喘 3.海洋生物（1）海藻 （2）腔肠动物 海葵毒素（3）节肢动物 甲壳素（4)软体动物 多糖、多肽、毒素（5）棘皮动物 海星、海胆、海参 海参素抗癌（6）鱼类 鱼油、多种激素、毒素，硫酸软骨素（7）爬行动物 龟 滋阴养肾 抗肿瘤（8）海洋哺乳动物 鲸鱼鱼肝油 4.植物 生物碱、强心甙、黄酮、皂甙、挥发油、树脂、鞣质

4、等。l哈尔滨医科大学附一院神经外科利用海洋生物提纯原料“多糖”成功研制出人工硬脑膜修补材料，并顺利通过动物实验，有望不久应用于临床。l专家介绍，在大白兔的实验中，这一人工硬脑膜已显示出性能良好、吸附力强的特点，起到了与人体硬脑膜相同的作用，且价格仅是同类进口材料的15。5.微生物1.细菌（1）氨基酸 利用微生物酶可转化对应的酮酸或羟基酸作用产生氨基酸。（2）有机酸 柠檬酸、苹果酸、乳酸 （3）糖类 利用细菌可制取葡聚糖、聚果糖、聚甘露糖、脂多糖。（4）核苷酸类 用细菌可生产5AMP，5肌苷酸（5）维生素 VB1,VB2，VB6,Vc（6）酶 淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、弹性蛋白酶2.放线菌放线菌是

5、最重要的抗生素产生菌，已有1000多种抗生素约2/3产自放线菌。（1）氨基酸 （2）核苷酸（3）维生素 （4)酶抗生素的主角就是大名鼎鼎的放线菌。放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，目前广泛应用的抗生素约70%是各种放线菌所产生。一些种类的放线菌还能产生各种酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、和纤维素酶等）、维生素（B12）和有机酸等。放线菌在自然界分布广泛，主要以孢子或菌丝状态存在于土壤、空气和水中，尤其是含水量低、有机物丰富、呈中性或微碱性的土壤中数量最多。土壤特有的泥腥味，主要是放线菌的代谢产物所致。3.真菌（1)酶（2）有机酸（3）氨基酸（4）核酸及有关物质（5）维生素（6)促生素（7）多糖l亚

6、历山大弗莱明由于一次幸运的过失而发现了青霉素。有一次他外出度假时，把实验室里在培养皿中正生长着细菌这件事给忘了。3周后当他回实验室时，注意到在一个培养皿中长了一个霉菌斑。并且霉菌斑周围的细菌都死了。l霉菌渗出了什么强有力的物质？弗莱明称为青霉素，并发现了它可以杀死许多致命性细菌 4.酵母菌（1）维生素（2）蛋白质与多肽（3）核酸 6.开发生物新资源开发生物新资源（1）动植物细胞的大规模培养 是细胞工程技术的一大应用领域（2）应用基因工程技术建立工程菌或工程细胞 适合于含量低、活性高的一些微量物质的生产（二）生物材料的准备（二）生物材料的准备 1.生物材料的选取选择原则是：有效成分含量高，原料新

7、鲜、无污染，来源丰富、易得，原料产地近，价格低，杂质含量少，便于分离（1）有效成分的含量）有效成分的含量 生物品种 根据目的物的分布，选择富含有效成分的生物品种是选材的关键。合适的组织器官（2）杂质情况）杂质情况 选材时应避免与目的物性质相似的杂质对纯化过程的干扰（3）来源）来源 应选用来源丰富的材料，尽量不与其他产品争原料，最好能一物多用，综合利用。2.生物材料的采集、预处理与保存生物材料的采集、预处理与保存 生物材料采集时要保证环境卫生符合要求，尽力保持材料新鲜，防止腐败、变质与微生物污染。选取时要求目的组织、器官完整，并进行初步整理，所选材料应防止污染 生物材料采摘选取后必须快速及时速冻

8、，低温保存，防止活性成分变性失活。保存生物材料的主要方法有：冷冻法 适用于所有材料 有机溶剂脱水法 适用于原料少而价值高、有机溶剂不破坏的材料 防腐剂保鲜法 适用于液体原料（一）生化活性物质常用的提取方法1.酸、碱、盐水溶液提取法 可以提取各种水溶性、盐溶性的生化物质，提供了一定的离子强度、pH及相当的缓冲能力2.表面活性剂与反胶束提取 表面活性剂分子兼有亲水与疏水基团，分布于油水界面时，有分散、乳化和增溶作用。可分阴离子型、阳离子型与非离子型。生物提取常用的表面活性剂的H.L.B多在1020之间，常用的有十二烷基硫酸钠、吐温类、Span和Trion系列。反胶束是表面活性剂分散于连续的有机相中

9、自发形成的纳米尺度的一种聚集体，是一种液液萃取方法。3.有机溶剂提取有机溶剂提取（1）固液提取 常用于水不溶性的脂类、脂蛋白、脂蛋白结合酶等，生物制药中常用的有机溶剂有如先用丙酮、甲醇、乙醇、乙醚、苯等。选用有机溶剂时一般采用“相似相溶”的原则（2）液液萃取 利用溶质在两个互不混溶的溶剂中溶解度的差异，将溶质从一个溶剂相向另一个溶剂相转移的操作。溶剂萃取的注意事项：溶剂萃取的注意事项：（1）pH 正确选择pH值很重要。因为在水溶液中某些酸、碱物质会解离，在萃取时改变了分配系数，直接影响提取效率。（2）盐析 加入中性盐如硫酸铵，氯化钠等可以使一些生化物质的溶解度减少。在提取液中加入中性盐，可以促

10、使生化物质转入有机相从而提高萃取率。（3）温度 一般在室温下或低温下进行萃取操作。（4）乳化 去乳化的常用方法有：过滤与离心，轻轻搅动，改变两相的比例；加热，加电解质，加吸附剂。液液萃取时溶剂的选择：液液萃取时溶剂的选择：（1）必须具有较高的选择性（2）萃取后，溶质与溶剂要容易分离与回收 (3)两种溶剂的密度相差要大（4）要选用无毒、不易燃烧、价廉易得的溶剂。4.双水相萃取法双水相萃取法 双水相多用来提取蛋白质类物质 常用的双水相系统为PEG/葡聚糖和PEG/无机盐两种，可以直接萃取达到固液分离和纯化的目的5.超临界萃取技术超临界萃取技术 优点是节能，具有很高的萃取速度，对物质的萃取具有选择性

11、，萃取后易分离。（二）影响提取的因素 1.温度 多数物质的溶解度随提取温度的升高而增加。另外较高的温度可以降低物料的粘度，有利于分子扩散和机械搅拌，所以对耐热成分的提取可以用加热的方法。对不耐热的生物活性物质的提取，一般在010进行提取。2.酸碱度 多数生化物质在中性条件下较稳定，pH值一般应控制在49范围内，为了增加目的物的溶解度，往往要避免目的物的等电点附近进行提取。3.盐浓度 盐离子的存在能减弱生物分子间离子键及氢键的作用力，常用的稀盐溶液有：氯化钠溶液，磷酸盐缓冲液，醋酸盐缓冲液等。（三）提取方法的选择（三）提取方法的选择 要取得好的提取效果，最重要的是要针对生物材料和目的物的性质选择

12、合适的溶剂系统与提取条件。活性物质的保护措施活性物质的保护措施 （1）采用缓冲盐系统 常用的缓冲盐有磷酸缓冲盐，柠檬酸缓冲盐，醋酸缓冲盐，碳酸缓冲盐，硼酸缓冲盐和巴比妥缓冲盐等 （2）添加保护剂 防止某些生理活性物质的活性基团及酶的活性中心受到破坏（3）抑制水解酶的作用三、三、生化活性物质的浓缩与干燥生化活性物质的浓缩与干燥（一）生物活性物质的浓缩（一）生物活性物质的浓缩 1.盐析浓缩 常用的中性盐是硫酸铵、硫酸钠、氯化钠、硫酸镁等 2.有机溶剂沉淀浓缩 在生物大分子的水溶液中，逐渐加入乙醇，丙酮等有机溶剂，可以使生化物质的溶解度明显降低，从溶液中沉淀出来。3.用葡聚糖凝胶（Sephadex）

13、浓缩 4.用聚乙二醇透析浓缩 5.超滤浓缩 6.真空减压浓缩与薄膜浓缩 （二）干燥（二）干燥 干燥的目的：提高药物或药剂的稳定性，以利于保存和运输；达到规格标准；便于进一步处理 1.减压干燥 在密闭容器内抽去空气后进行干燥 2.喷雾干燥 待干燥的物质先浓缩成一定浓度的液体，干燥时间短，可得到细粉 3.冷冻干燥 在低温、低压条件下，利用水的升华性能而进行的干燥四、四、生化活性物质的分离和纯化生化活性物质的分离和纯化1、生物制药工艺中分离制备方法的特点（1）生物材料组成非常复杂，没有固定操作方法可循（2）有些化合物在生物材料中含量极微，分离操作步骤多，不易获得高收率。（3）生物活性物质离开生物体后

14、，易变性，破坏，必须十分小心的保护这些化合物的生理活性。（4）生物制药的分离方法几乎都在溶液中进行，各种参数对溶液中各种组分的综合影响常常无法固定，以致许多实验设计理论性不强。（5）为了保护目的物的生理活性及结构上的完整性，生物制药中的分离方法多采用温和的逐级分离方法。操作时间长，手续繁琐。（6）生物产品最后均一性的证明与化学纯度的概念不完全相同，生物分子对环境反应十分敏感，结构与功能关系比较复杂，对其均一性的评估是有条件的。2、生物制药工艺中分离制备方法的基本原理、生物制药工艺中分离制备方法的基本原理（1）根据分子形状和大小不同进行分离。如差速离心与超离心、膜分离（透析，电渗析）与超滤，凝胶

15、过滤法。（2）根据分子电离性质的差异性进行分离。如离子交换法，电泳法，等电聚焦法。（3）根据分子极性大小及溶解度不同进行分离。如溶剂提取法，盐析法，等电点沉淀法，及有机溶剂分级沉淀法。（4）根据物质吸附性质的不同进行分离。如选择性吸附法与吸附层析法。（5）根据配体特异性进行分离亲和层析法。3、分离纯化的基本程序和实验设计（1）确定制备物的研究目的及建立相应的分析鉴定方法。（2）制备物理化性质稳定性的预备试验。（3）材料处理及抽提方法的选择。（4）分离纯化方法的摸索。（5）产物均一性测定。提取是分离纯化目的物的第一步，分离纯化是生化制备的核心操作。分离策略：（1）分离纯化早期使用方法的选择 分离

16、纯化的早期，由于提取液中的成分复杂，目的物浓度较稀，与目的物理化性质相似的杂质多，所以不宜选择分辨能力较高的纯化方法。早期分离纯化用萃取，沉淀，吸附等一些分辨力低的方法较为有利。原则：从低分辨能力，而且负荷量较大者为合适 （2）各种分离纯化方法的使用程序 生化物质的分离都是在液相中进行，故分离方法主要依据物质的分配系数，分子量大小，离子电荷性质 及数量和外加环境条件的差别等因素为基础，在相同或相似条件下连续使用同一种分离方法就不太适宜。在安排纯化方法顺序时，还要考虑到有利于减少工序，提高效率。对于一未知物通过各种方法的交叉应用，有助于进一步了解目的物的性质。（3）分离后期的保护性措施 在分离操

17、作的后期必须注意避免产品的损失，主要损失途径是器皿的吸附，操作过程样品液体的残留，空气氧化和某些事先无法了解的因素。4、分离纯化方法步骤优劣的综合评价、分离纯化方法步骤优劣的综合评价 分离纯化步骤的好坏，除了从分辨能力和重现性两方面考虑，还要注意方法本身的回收率，特别是制备某些含量很少的物质时，回收率的高低十分重要。5、制备物均一性的鉴定、制备物均一性的鉴定 均一性是指所获得的制备物只有一种完全相同的成分。均一性的评价常需数种方法验证。生物分子纯度的鉴定方法很多，常用的有溶解度法、化学组成分析法，电泳法，免疫学方法，离心沉降分析法，各种色谱法，生物功能测定法，以及质谱法。第二节第二节 微生物制

18、药工艺技术基础微生物制药工艺技术基础 一、微生物菌种的选育与保存一、微生物菌种的选育与保存（一）菌种的分离和筛选（一）菌种的分离和筛选 1.菌种的分离（1）含菌样品的收集 根据微生物的生态特点，从自然界取样，分离所需要菌种，也可从发酵生产材料中进行分离。（2）富集培养 收集到的样品若含所需要的菌较多，可直接分离。如含所需要的菌很少，就需要经过富集培养，使所需要的菌大量生长，以利于筛选。再配合控制温度，pH或营养成分即可达到目的。（3）菌种纯化 菌种纯化的方法一般采用稀释分离或划线分离法。2.菌种的筛选菌种的筛选 筛选前，先要考虑哪些微生物是筛选的对象。如有报道，则根据文献收集可能性最大的的微生

19、物进行筛选。无报道则根据一般知识进行筛选。实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。初筛工作以量为主，初筛的手段应尽可能快速、简单。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标。（二）菌株的选育与保藏（二）菌株的选育与保藏 1.菌株的选育（1）自然选育 利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过排除衰变菌落选择维持原有生产水平的菌株。（2）诱变育种 有意识的将生物体暴露于物理、化学或生物的诱变因子促使生物体发生突变，从突变体中筛

20、选具有优良性状的突变株。l 航天诱变品种矮秆早熟大豆（右）与相对照的大豆品种 早在世纪年代初，苏联及美国的科学家就已开始将植物种子搭载卫星上天，在返回地面的种子中发现它的染色体畸变频率有较大幅度的增加。此后俄罗斯等国在“和平号”空间站成功种植小麦、白菜和油菜等植物，这项研究的目的是使宇宙飞船最终成为“会飞的农场.随着我国第一颗育种卫星“实践八号”发射升空并返回地面，一个围绕着航天育种地面研究的联合科技攻关正在全国范围展开,水稻、小麦、棉花、番茄、青椒和芝麻等作物 航天诱变以及核辐射诱变等从本质上同自然界的一些因素引起的诱变是一样的，我们只不过用化学或物理的方法把它自然变异的过程加快了，二者并没

21、有把其他一些对人类可能有害的外来物种的基因导过来，只是通过诱变使得它自己的基因发生变化 出发菌株的选择 指用于诱变的原始菌株，应选择稳定、具有优良特性、对诱变剂敏感的菌株。诱变处理 能够提高生物体突变频率的物质叫诱变剂，分物理诱变、化学诱变和生物诱变 突变株的选择 随机筛选：凭经验随机选择 半理性化筛选：推理性设计（3）现代菌种选育技术 杂交育种 将两个基因型不同的菌株通过结合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株 原生质体融合 用脱壁酶处理将微生物细胞壁除去制成原生质体，再用聚乙二醇促进原生质体发生融合从而获得融合子，实现了种间、属间的融合 基因工程技术 将供体的遗传信息构成

22、重组DNA分子，然后转入受体细胞中，使外源DNA片段在后者内部得以表达和遗传，实现了超远缘杂交。l斜卧青霉与康宁木霉是不同属的两种丝状真菌，斜卧青霉发酵主要产生木 聚糖酶；康宁木霉发酵主要产生-葡聚糖酶。本研究通过原生质体电融合的方法，对斜卧青霉与康宁木霉进行杂交育种，希望得到同时高效生产木聚糖酶和-葡聚糖酶的杂交菌种。（1）菌种的退化与防止 一般把菌株的生活力，产孢子能力的衰退和特殊产物产量的下降，称为退化。菌种退化防止措施：防止基因突变，低温保藏法可以减少突变得产生；采用双重缺陷标志可间接而有效地防止突变；制定科学管理制度 制作平行菌种斜面；分离单菌落；选择有利于高产菌株而不利于低产菌株的

23、培养条件。（2）常用的菌种保藏方法 原理：根据菌种的生理、生化特点创造条件使 菌体的代谢处于不活泼的状态 关键：干燥、隔氧、低温、避光 斜面低温保存法 将菌种接种到所要求斜面培养基上，置最适温度下培养，待生长良好后，于4保存，每间隔一定时间后重新移植培养。液体石蜡封藏法 将灭菌的石蜡油注入长好菌苔的斜面试管中，隔绝氧气，降低代谢 冷冻干燥保藏法 将菌种悬浮于脱脂消毒牛奶中，快速冷冻，真空干燥，一般可保存510年液氮超低温保藏法 微生物置于130液氮低温下长期保存，用于多种培养材料的保藏，是最可靠的长期保存方法甘油冷冻保存法 将对数期菌体悬浮于新鲜培养基中，加入15%消毒甘油，混匀速冻，冻存于7

24、080其它干燥保藏法 砂土管法（3）菌种保藏注意事项 处理过程中注意防止杂菌污染 保藏所用菌种要在新鲜的斜面上生长丰满，生长时间不宜过长 保藏过程中要防止菌种退化现象发生 控制菌种制备过程二、微生物的培养二、微生物的培养（一）微生物生长的六大营养要素（一）微生物生长的六大营养要素1.碳源 有机碳：牛肉膏，氨基酸，葡萄糖，淀粉等 无机碳：CO2,NaHCO3,CaCO32.氮源 有机氮：牛肉膏、蛋白胨、尿素等 无机氮：KNO3,(NH4)2SO43.能源 化学物质 辐射能4.生长因子 对微生物正常代谢必不可少且不能用简单的碳源或氮源自行合成的有机物，需要量很少，如各种维生素、碱基，甾醇等。5.无

25、机盐 磷、硫、钾、镁、钠等6.水l孢子形成培养基(ATCC 5)酵母膏 1.0g 牛肉膏 1.0g 胰蛋白胨 2.0g 葡萄糖 10.0g FeSO4 微量 琼脂 15.0g 蒸馏水 1000ml pH 7.2（二）微生物培养基（二）微生物培养基 培养基：人工配制的适合于不同微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质，任何培养基都应该具备6大营养要素 1.培养基的种类 合成:成分明确,稳定,营养单一,价格高,用于实验研究组成物质天然:成分复杂,营养丰富,价格低,来源丰富,工业使用按状态固体:适用于菌种分离和保存半固体:在液体培养基中加入琼脂，用于鉴定菌种液体:发酵工业大规模使用按用途孢子:供菌种繁

26、殖孢子使用的固体培养基种子:一、二级种子罐的培养基和摇瓶培养基发酵:可供菌种生长、繁殖和合成产物 2.影响培养基质量的因素影响培养基质量的因素（1）原材料质量的影响（2）水质的影响（3）灭菌操作（4）培养基黏度的影响（三）灭菌和除菌方法（三）灭菌和除菌方法 1.灭菌方法灭菌方法（1）加热灭菌 大规模装置中最有效的方法，以嗜热脂肪芽孢杆菌作为检验灭菌是否彻底的指标 分为高温蒸汽湿热灭菌法（115140）和干热灭菌法（160 ，120min）（2）辐射灭菌 利用紫外线、高能量的电磁波或粒子辐射灭菌，如X射线等（3）介质过滤除菌 针对不耐热的成分可采用过滤除菌（4）化学灭菌法 药剂与微生物细胞接触达

27、到杀灭微生物的目的，不能用于培养基灭菌，常用药剂有乙醇、甲醛、苯酚、环氧乙烷等（四）微生物的培养方法 培养：将微生物接种于培养基中，在特定条件下增 殖的过程 1.培养装置 恒温箱：保持在一定温度 振荡培养器：用于好气菌的液体培养 厌气菌使用密闭型容器 2.培养方法（1）固体培养法 斜面培养 平板培养 穿刺培养：常用于厌气菌的保藏（2）液体培养法静止培养法用于酵母、厌气性及兼性厌气性细菌的培养振荡培养法好气性细菌、兼性菌培养通气搅拌培养法大规模培养3.培养时注意事项（1）注意温度和通气（2）注意pH和培养基组成（3）防止杂菌污染三、发酵过程的控制三、发酵过程的控制控制参数生物参数：菌丝形态、菌体

28、浓度物理参数：温度、压力、转速、空气流量等化学参数：pH、基质浓度、溶解氧浓度、产物浓度分批发酵：在一封闭培养系统内完整的进行发酵补料分批发酵：分批培养过程中，连续或间歇的补 加培养基而不从发酵罐中间断的放 出培养液连续发酵：培养基料液连续输入发酵罐并同时放 出含有产品的发酵液的过程发酵过程中重要影响参数的控制发酵过程中重要影响参数的控制1.温度 发酵过程中采用一个比较合适的温度或在可能条件下进行适当的调整2.pH 控制发酵过程中pH变化在合适的范围内或在发酵过程中加酸或碱和补料的方式控制3.溶氧 考察每种发酵的临界氧浓度和最适氧浓度并在发酵过程中保持4.二氧化碳 通过通气搅拌来控制5.泡沫

29、机械消泡和消泡剂消泡l基因工程基因工程：用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质不同来源的基因(DNA大分子)提取出来，按预先设计的蓝图，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品从而获得新物种的一种技术。基因工程实际上包括了体外基因工程（DNA体外重组）和体内基因工程（DNA体内重组）两种方式。一、基因工程制药技术基础一、基因工程制药技术基础 基因工程药物制造过程的主要程序是：基因工程药物制造过程的主要程序

30、是：获得目的基因 构建DNA重组体 将重组体导入宿主细胞 鉴定筛选阳性克隆 构建基因工程细胞 培养工程细胞 分离纯化表达产物 除菌过滤 半成品检定制剂 成品检定 包装 1、目的基因的制备、目的基因的制备 从复杂的生物体基因组中采用不同方法分离并获得带有目的基因的DNA片段 常用方法：（一）cDNA文库的建立与目的基因的分离 cDNA文库：代表了某种生物的全部蛋白质编码信息，从cDNA文库中筛选目的克隆有核酸杂交和免疫法（二）通过PCR技术制备目的基因 原理：在欲扩增的目的DNA的两侧设计一对正向和反向引物，在模板DNA以及四种脱氧核糖核酸底物存在条件下由TaqDNA聚合酶所引导催化的DNA扩增

31、酶促反应（三）人工合成目的基因 通过化学合成寡核苷酸链获得某些真核生物小分子蛋白或多肽的编码基因 2.构建重组DNA 在体外将含目的基因的DNA片段和载体分子进行连接获得重组DNA分子 根据目的基因片段的来源和类型不同，可分为：（1）黏端连接（2）平端连接（3）TA克隆3.将重组将重组DNA分子导入宿主细胞分子导入宿主细胞 采用特定的方法将重组DNA分子转移至适当受体细胞并与之同步增殖（1）DNA重组体导入微生物细胞的方法 转化作用：微生物细胞直接吸收外源DNA的过程 转导作用：通过温和噬菌体颗粒的释放和感染将重组DNA 转移至宿主内（2）DNA重组体导入动植物细胞的方法 物理方法：显微注射、

32、基因枪、电穿孔 化学方法：磷酸钙共沉淀法、脂质体法 生物学方法：反转录病毒法、原生体融合法4.鉴定带有目的基因的克隆鉴定带有目的基因的克隆从大量细胞繁殖群体中筛选出克隆有重组DNA分子的寄主细胞 根据遗传表型差异进行筛选 根据重组子的结构特征进行筛选5.基因表达系统基因表达系统将目的基因克隆至适当的表达载体使其在新的遗传背景下获得活性表达得到特定目的物质 原核：原核细胞为表达宿主，如大肠杆菌、枯草杆菌基因工程 真核：真核细胞为表达宿主，如酵母细胞、哺乳动物 细胞、植物细胞等（二）基因工程菌的规模化培养（二）基因工程菌的规模化培养 大肠杆菌是基因工程制药的主要寄主菌，故重组大肠杆菌的大规模培养是

33、重点研究内容 1.重组大肠杆菌的培养基组成 基本组成包括碳源、氮源、无机盐、微量元素、维生素和生物素等，营养缺陷型菌需补加相应营养成分 常用碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、果糖等 常用氮源：酵母粉、蛋白胨、氨基酸、硫酸铵等 举例：LB培养基 酵母提取物：5g，胰蛋白胨：10g NaCl：5g，H2O：1000mlpH7 溶液于0.67Mpa（121）蒸汽灭菌2.基本培养方式基本培养方式 分批培养 补料分批培养 连续培养 透析培养：用物理方法把乙酸等代谢废物从培养基中除去3.基因工程菌的培养设备基因工程菌的培养设备 常规微生物发酵设备可直接用于基因工程菌的培养 发酵罐组成部分发酵罐组成部分：发酵罐体、

34、搅拌器、温度控制和灭菌系统、空气无菌过滤装置、残留气体处理装置、参数测量与控制系统、培养液配制及连续操作装置 4.基因工程菌的高密度发酵和高效表达策略基因工程菌的高密度发酵和高效表达策略 补料策略是重组大肠杆菌高密度发酵的成功关键技术，在大肠杆菌高密度发酵中，合理流加碳源是成功的关键 恒速流加补料：葡萄糖速度恒定 流加模式 变速补料：改变流速 指数流加补料：菌体呈指数形式增加二、动物细胞工程制药技术基础二、动物细胞工程制药技术基础（一）动物细胞的获得（一）动物细胞的获得1.原代细胞 直接取自动物细胞组织器官，结构分散、消化制得的细胞悬液2.二倍体细胞系 原代细胞经过转化、筛选、克隆从而由多种细

35、胞成分的组织中挑选强化具有一定特性的细胞株3.转化细胞系 通过某个转化过程形成的，失去了正常细胞的特点而获得无限繁殖的能力（二）动物细胞培养条件（二）动物细胞培养条件 营养：培养基（人工合成，半人工合成）pH：最适为7.27.4之间,温度：最适为370.5 气体条件:O2和CO2 渗透压 无菌条件（三）动物细胞大规模培养方法（三）动物细胞大规模培养方法1.悬浮培养让细胞自由悬浮于培养基内生长繁殖适用：非贴壁依赖性细胞，兼性贴壁细胞优点：操作简便,培养条件均一,传氧好,容易大规模培养缺点：细胞密度低2.贴壁培养让细胞附在某种基质上生长繁殖的培养方法适用：一切贴附依赖性细胞，兼性贴壁细胞优点：适用

36、种类广，细胞密度大缺点：操作麻烦，培养条件不均一，传氧差3.微载体培养使细胞贴附在微小颗粒载体上优点：贴附面积大,载体比重轻,稍搅拌即可使细胞自由悬浮(四四)动物细胞大规模培养的操作方式动物细胞大规模培养的操作方式 分批式操作 半连续式操作 灌流式操作：不断取出部分培养基和补充新鲜培养基（五）动物细胞的种质保存（五）动物细胞的种质保存 常温：2030 低温：4 超低温冰冻法：70（六）单克隆抗体（六）单克隆抗体 B细胞群瘦抗原刺激后能产生针对抗原决定簇的特异性抗体，一个B细胞只能分泌一种特异性抗体，B细胞与骨髓瘤细胞融合后产生杂交瘤细胞，挑选出单个杂交瘤细胞，培养单个杂交瘤细胞使之无性繁殖形成

37、细胞集落，同一个克隆的杂交瘤细胞基因相同，分泌的特异性抗体质地均一，称单克隆抗体三、植物细胞工程制药技术基础三、植物细胞工程制药技术基础（一）基本概念（一）基本概念1.植物组织和细胞培养植物组织和细胞培养：在无菌和人工控制的已有及环境条件下研究植物的细胞、组织和器官以及控制其生长发育的技术2.悬浮培养悬浮培养:能保持较好分散性的离体细胞或较小细胞团的液体培养3.愈伤组织愈伤组织:所形成的脱分化的细胞团 4.细胞培养细胞培养：利用单个细胞进行培养诱导其增殖和分化5.分生组织培养分生组织培养：在人工培养基上培养茎端分生组织细胞6.外植体外植体：用于植物组织培养的器官或组织7.器官形成器官形成:组织

38、培养或悬浮培养中芽、根或花等器官的分化与形成（二）植物组织和细胞培养所用的培养基（二）植物组织和细胞培养所用的培养基 培养基中应含有无机盐、碳源、有机氮源、植物生长激素、维生素等化学成分（三）培养材料 植物的根、茎、叶、花、果实、种子均可（四）培养方式 二步法、固定化培养、代谢产物胞外释放、两相培养技术（五）常用反应器 摇瓶、搅拌型生物反应器、鼓泡塔与气升式反应器、转鼓式反应器四、酶工程制药技术基础四、酶工程制药技术基础1.酶工程酶工程：酶学与工程力学渗透结合发展形成的生物技术 第一代酶酶制剂 第二代酶固定化酶 第三代酶固定化多酶（包含辅因子再生系统）2.固定化酶固定化酶：借助于物理和化学的方

39、法把酶束缚在一定空间内并具有催化活性的酶制剂3.固定化酶的制备方法固定化酶的制备方法 吸附法、包埋法、交联法、共价键结合法EEEEEEEEEEEEEEEEEE吸附法共价结合法交联法包埋法 （1）吸附法）吸附法 用物理吸附法制成固定化酶，酶活力损失很少，但吸着在载体上的酶，易于脱落，使用价值少。离子吸附法是将酶与含有离子交换剂的水不溶性载体结合，酶吸附于载体上较为牢固，在工业上用途颇广。离子吸附法常用的载体有：DEDA-C,ECTEOLA-纤维素，TEAE纤维素，DEAE葡聚糖凝胶，Amberlite CG50 （2）包埋法）包埋法 包埋法系将酶包埋于凝胶或高分子聚合物网格内，网格可以防止酶的渗

40、出，底物仍能渗入网格内与酶相接触。包埋法的优点是酶分子本身不参与水不溶性网格的形成，许多酶都可用此法固定化。其操作简单，酶分子只是被保埋起来，而未受到化学反应，因此固定化酶表现活力较高。常用的包埋剂有聚丙烯酰胺，卡拉胶，淀粉凝胶，三醋酸纤维素，海藻酸，胶原，血纤维，大豆蛋白等。（3）共价键结合法 共价键结合法是通过化学反应使酶与聚合物载体共价偶联。酶与载体共价结合的功能团包括氨基，羧基，酚羟基，巯基，羟基，咪唑基。常用共价键结合法有：重氮化法，烷基化和芳基化法，戊二醛结合反应法，钛螯合法，硫醇二硫化物的互换反应等 （4）交联法 交联法是使用双功能或多功能试剂与酶分子之间进行分子间的交联反应的固

41、定化方法。由于酶蛋白的功能基团，如氨基，酚基，巯基，和咪唑基，参与交联反应，因此可能影响酶的活性中心结构，而使酶活力显著失活。交联剂有多种，主要为戊二醛。酶工程技术的应用 固定化酶和固定化细胞在食品发酵工业和制药工业方面的应用，不仅可以改革现有的生产工艺，而且可以创新多酶反应工艺，还可以促使发酵工业发生根本性变革，因此在制药工业中的应用具有很大潜力。第四节第四节 生物制药中试放大工艺设计生物制药中试放大工艺设计 一、中试放大实验的目的中试放大实验的目的 中试放大是由小试转入工业化生产的过渡性研究工作，对小试工艺能否成功地进入规模生产至关重要。这些研究工作都是围绕如何提高收率，改进操作，提高质量

42、，形成批量生产等方面进行。中试放大是为了验证实验室工艺路线的可行性以及在实验室阶段难以解决或尚未发现的问题。二二.进入中试应具备的条件进入中试应具备的条件收率稳定，质量可靠操作条件已经确定生物材料的资源已确定并已系统鉴定进行过物料平衡，三废问题已有初步处理方法提出中试规模及所需原辅料的规格和数量提出安全生产的要求 在考查工艺条件的研究阶段中，必须注意和解决：在考查工艺条件的研究阶段中，必须注意和解决：1.原辅材料规格的过渡试验 在小试时，一般采用的原辅材料规格较高，目的是为了排除原料中所含杂质的不良影响，从而保证实验结果的准确性。但是当工艺路线确定之后，在进一步考察工艺条件时，应尽量改用大规模

43、生产时容易得到的原辅材料。2.设备选型与材质质量试验 在小试阶段，大部分实验是在小型玻璃仪器中进行，但在工业生产中，物料要接触到各种设备材料，故中试时 要对设备材料的质量及设备的选型进行实验，为工业化生产提供数据 3.反应条件限度试验 是为了找到最适宜的工艺条件（如培养基种类，反应温度，压力，pH等），一般均有一个许可范围。进行工艺条件限度试验，全面掌握反应规律。4.原辅材料、中间体及产品质量分析方法研究 便于制定简便易行、准确可靠的检验方法 5.下游工艺的研究 尽量简化下游工艺操作，采用新工艺，新技术，新设备等以提高劳动生产率，降低成本三、中试放大方法三、中试放大方法1.经验放大法：凭借经验

44、通过逐级放大（实验装置，中间装置，中型装置和大型装置）来摸索反应器的特征。2.相似放大法3.数学模型放大法 中试放大程序可采用步步为营或一竿子到底策略。四、中试放大的研究内容四、中试放大的研究内容（1）工艺路线与各步反应方法的最后确定（2）设备材质与型号的选择（3）反应器的规模选择及反应搅拌器型式与搅拌速度的考查（4）生产反应条件的研究（5）工艺流程与操作方法的确定（6）物料衡算（7）安全生产与三废防治措施研究（8）原辅材料，中间体的物理性质和化工常数的测定（9）原辅材料、中间体质量标准的制定。（10）消耗定额，原料成本，操作工时与生产周期计算。l生化活性物质常用的提取方法有哪些？l生化制药工艺中分离纯化的主要原理有哪些？l现代菌种选育技术有哪些？l微生物生长的六大营养要素是什么？l微生物的培养方法有哪些？l动物细胞大规模培养的操作方式有哪些？l固定化酶的制备方法有哪些？