第三章-环境工程菌遗传改造及应用-课件.ppt

1、基因工程改造细菌、细胞工程改造细菌基因工程改造细菌、细胞工程改造细菌n改造的目的？改造的目的？n通过人工手段加速生物进化，制造组合性能更为优良通过人工手段加速生物进化，制造组合性能更为优良的生物品种的生物品种（此处限于环保领域此处限于环保领域）第一节第一节 基因工程菌改造原理基因工程菌改造原理n基因？基因？染染色色体体DNA1.1 天然状态下生物基因改变方式天然状态下生物基因改变方式指基因上的指基因上的某一个或几个碱基缺失、置换或某一个或几个碱基缺失、置换或插入插入，导致基因内部原有碱基排序改变，导致基因内部原有碱基排序改变遗传性质改变遗传性质改变诱因诱因物理射线、物理射线、化学诱变剂化学诱变

2、剂原理应用原理应用常规常规细菌或污泥细菌或污泥定向定向培育和驯化培育和驯化详见详见环境工程微环境工程微生物学生物学第三章第三章n高等生物高等生物杂交杂交n精卵细胞质融合过程中精卵细胞质融合过程中所有所有遗传物质的重组遗传物质的重组n低等生物低等生物细菌细菌n三种方式三种方式细菌细菌供体细菌供体细菌的的DNADNA片段片段直接直接吸收吸收进入活的受体进入活的受体细菌细菌并发生基因重并发生基因重新组合的方式。新组合的方式。接合接合大肠杆菌大肠杆菌雌雌雄雄质粒质粒n噬菌体噬菌体细菌病毒细菌病毒n遗传物质通过遗传物质通过噬菌体（邮噬菌体（邮差）的携带差）的携带而转移导手而转移导手的的基因重组现象称为转

3、导。基因重组现象称为转导。转导转导基因工程基因工程人工干预下的人工干预下的杂交、转化、接合、杂交、转化、接合、转导转导技术技术1.2 基因工程原理及方法基因工程原理及方法n环保领域主要利用的是以环保领域主要利用的是以质粒为媒介质粒为媒介的人工的人工转化技术制造转化技术制造“超级细菌超级细菌”一种具有某种优一种具有某种优良性能的天然细良性能的天然细菌或突变细菌菌或突变细菌（长的慢，无使（长的慢，无使用价值）用价值）一种普通细菌一种普通细菌（长的快）（长的快）如大如大肠杆菌肠杆菌+既长得快又具既长得快又具有该优良性能有该优良性能的细菌的细菌基因基因工程菌工程菌 特殊基因的发现与分离载体质粒克隆限制

4、性核酸内限制性核酸内切酶内切切酶内切连接酶拼接杂连接酶拼接杂合质粒合质粒转化入转化入受体菌受体菌DNADNA粘性末端粘性末端选择性选择性培养基培养基筛选筛选常见的为大肠杆菌、常见的为大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌等枯草杆菌、酵母菌等在特殊培养基上在特殊培养基上（如含有青霉素如含有青霉素）筛选目的细菌筛选目的细菌质粒质粒上具上具有有抗抗性基性基因因长出必然是长出必然是重组成功的重组成功的细菌细菌1.3 基因工程在环境污染生物处理中的应用基因工程在环境污染生物处理中的应用n将将IMP134IMP134菌体内降解氯代苯邻二酚的菌体内降解氯代苯邻二酚的基因克隆基因克隆到广到广泛宿主质粒泛宿主质粒pKT23

5、1pKT231上，形成上，形成重组质粒重组质粒（对卡拉霉素（对卡拉霉素有抗性），有抗性），转化转化到假单胞菌（常见的污染物处理细菌）到假单胞菌（常见的污染物处理细菌）后，形成后，形成基因工程菌基因工程菌降解氯代降解氯代OO硝基苯酚硝基苯酚（农药、染料、药物和炸药的有毒副产品）（农药、染料、药物和炸药的有毒副产品）n黄杆菌、棒杆菌、产碱杆菌属黄杆菌、棒杆菌、产碱杆菌属具有分解尼龙聚合物的具有分解尼龙聚合物的质粒，质粒，但三种菌不易在污水中繁殖，但三种菌不易在污水中繁殖，在污水中易繁殖在污水中易繁殖的的大肠杆菌大肠杆菌无此质粒。无此质粒。n运用基因工程原理制造出运用基因工程原理制造出含分解尼龙聚合

6、物的大肠杆含分解尼龙聚合物的大肠杆菌（工程菌）菌（工程菌）可在污水中大量繁殖并将尼龙迅速降解。可在污水中大量繁殖并将尼龙迅速降解。n同样原理还制造出了分解同样原理还制造出了分解多糖、抗金属、除草剂降解多糖、抗金属、除草剂降解、杀虫剂降解杀虫剂降解等基因工程菌。等基因工程菌。n这些基因工程菌的安全性如何？这些基因工程菌的安全性如何？n重组基因会不会在不同微生物之间通过自然方式传播重组基因会不会在不同微生物之间通过自然方式传播呢？呢？n基因工程菌会不会成为地区霸主呢？基因工程菌会不会成为地区霸主呢？n通常通常通过微宇宙法进行实验分析通过微宇宙法进行实验分析，并在基因工程菌基，并在基因工程菌基因中因

7、中添加自杀基因添加自杀基因，目标污染物去除后自杀基因启动，目标污染物去除后自杀基因启动，自行消灭。自行消灭。n涉及的专业技术内容涉及的专业技术内容nDNADNA的分离技术的分离技术nDNADNA的测序技术的测序技术n工具酶的使用技术工具酶的使用技术n人工转化技术人工转化技术n酶定性定量分析技术酶定性定量分析技术nPCRPCR基因扩增技术基因扩增技术（可用于水中大肠杆菌、病（可用于水中大肠杆菌、病毒的快速鉴定）毒的快速鉴定）第二节第二节 细胞工程菌改造原理细胞工程菌改造原理n利用细胞工程中的构建环境工程菌细菌使用溶菌酶真菌使用纤维素酶化学融合：聚乙二醇+Ca2+电融合：交流电场+高强度脉冲 选择

8、性培养基培养等渗透压培养基培养可生长繁殖具体细节具体细节生物材料生物材料的最佳产的最佳产率条件率条件温度、pH、生物生理状况、细胞密度、酶浓度等最佳融合最佳融合效率效率化学药剂浓度、电场形状、频率、幅度脉冲强度、时间、次数鉴别培养鉴别培养基基培养基配方最佳再生最佳再生条件条件 培养基配方及培养条件将种间互生细胞的转化为细胞内互生将种间互生细胞的转化为细胞内互生例如例如 原生质体融合构建纤维素降解菌原生质体融合构建纤维素降解菌n已知已知 两株两株脱氢双香草醛（脱氢双香草醛（DDV)降解菌降解菌Fusobacterium varium(梭菌属）和Enterococcus faecium（肠球菌属）

9、(DDV是与纤维素有关的有机化合物是与纤维素有关的有机化合物)8d降解310脱氢双香草醛8d降解310脱氢双香草醛8d降解30脱氢双香草醛互生现互生现象象8d降解80脱氢双香草醛内互生互生现象现象nPseudomonas alcaligens CO可降解可降解苯甲酸酯苯甲酸酯和和3氯氯苯甲酸酯苯甲酸酯，但不能利用，但不能利用甲苯甲苯nPseudomonas pudita R5-3可降解可降解苯甲酸酯苯甲酸酯和和甲苯甲苯，但，但不能利用不能利用3氯苯甲酸酯氯苯甲酸酯n两菌株两菌株均不能均不能利用利用1 1，4 4二氯苯甲酸酯例如例如 原生质体融合构建苯环化合物降解菌原生质体融合构建苯环化合物降解菌结合亲本优势性能结合亲本优势性能