电子教案与课件:生化分离原理与技术-7-分离纯化的组合应用.pptx
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- 电子 教案 课件 生化 分离 原理 技术 纯化 组合 应用
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1、第八章第八章 分离纯化的组合应用分离纯化的组合应用江南大学生物工程学院江南大学生物工程学院第三篇第三篇 分离技术的融合与集成分离技术的融合与集成第八第八章章 分离纯化的组合应用分离纯化的组合应用概述概述分离的主要流程分离的主要流程分离技术的选择和组合分离技术的选择和组合典型生物分子分离实例分析典型生物分子分离实例分析一一 概述概述观点:为了成功地分离样品,必须根据样品特性和分离目的合理地设计出分离纯化实验方案。由于每个分离任务涉及的目标分子,样品中杂质成分,需达到的分离效果都是不同的,因此不存在通用的分离纯化方案。生化分离过程往往是将若干单元纯化技术联合使用而实现的。选择合理单元纯化技术固然很
2、重要,然而如何将这些技术合理的组合和按顺序使用也是成功的分离所必须考虑的。初始阶段中间阶段精制纯度分离步骤分离纯化的三个不同阶段分离纯化的三个不同阶段初始阶段初始阶段主要任务在于从相对较大体积的抽提液中去除大量杂质,同时能浓缩样品和保障样品处稳定的环境条件。此时所选择的方法往往希能满足快速大规模处理的需要,此阶段选择方法的时候侧重点应放在速度和处理量上。一般匀浆和沉淀技术、膜过滤技术等可以在此阶段的前期使用,此阶段的后期则可以使用离子交换和亲和层析等技术。中间阶段中间阶段主要任务在于进一步除去大量杂质,如混在目的蛋白质中的其他蛋白质、核酸和多糖等,而这些杂质与目的物的性质差异相对较小,显然选择
3、的分离方法要有较高的分辨率,作为中间过程要处理的样品量仍比较大,所以此阶段选择分离方法的侧重点应放在分辨率和处理量上。离子交换、亲和层析、制备级等电聚焦等技术可以在此阶段使用。精制阶段精制阶段主要任务在于最后除去微量杂质,使最后的产品获得高纯度,最后的微量杂质往往与目的物的性质较为接近,所以此阶段分离方法的侧重点主要放在分辨率上。尽管分离技术仍然可以采用离子交换、凝胶层析等技术,但可通过选择高效的填料来满足高分辨率的要求。各种技术的使用频率各种技术的使用频率二二 分离的主要流程分离的主要流程建立分析方法生化分离整个过程一旦开展,都应首先建立快速灵敏准确的分析方法来衡量效果(收率、纯度),以保证
4、分离工作顺利进行。三种三种分析分析鉴定鉴定方法类型方法类型1、生物测定方法一个生物测定方法的建立,必须选择适当的生物对象,继而决定测试的生物反应类型,如加入受试物后细菌的生长或抑制,血压的变化,组织分泌物的增加或减少等。然后在定性反应基础上进一步建立生物反应的定量标准。2、理化测定方法是一种最常用最方便的分析测定方法,主要根据目的物的初步了解的特殊的理化性质建立定性定量的鉴定方法,这类方法常有:比色法、层析法、光谱法、电泳法等。理化测定方法的最大优点是实验操作简便快速,能及时指导分离过程,判断分离方法的实际效果。3、理化方法与生物学方法结合测定对于某些生物体内含量较低,或所建立的理化测定方法的
5、特异性和灵敏度不足以反映该物质定性与定量的要求时,常常需要结合生物学方法来全面准确地反映该物质的存在情况。分析鉴定方法分析鉴定方法的的要求要求一个好的分析鉴定方法必须满足以下要求:特异性或专一性强;重现性好;准确度高;灵敏度高;时间短,操作简便。提取材料选择提取材料选择选择材料的范围:包括动物、植物、微生物选材的主要原则:来源丰富,含量相对较高,杂质尽可能少三三 分离分离方法方法的的选择选择1、目的物是胞内物质还是胞外物质2、原料中产物和主要杂质浓度3、产物和主要杂质的物理化学特性差异4、产品的用途和质量标准5、产品的市场价格6、废物的处理方法影响下游技术工艺选择的因素:生物分离过程的一般流程
6、生物分离过程的一般流程原料液原料液细胞分离细胞分离(离心、过滤离心、过滤)细胞胞内产物细胞胞内产物路线路线1 1路线路线2 2细胞破碎细胞破碎碎片分离碎片分离路线路线1A1A路线路线1B1B清液胞外产物清液胞外产物粗分离(沉淀、膜过滤等粗分离(沉淀、膜过滤等)纯化纯化(层析、电泳层析、电泳)脱盐脱盐(凝胶过滤、超过滤凝胶过滤、超过滤)浓缩浓缩(超滤、蒸发超滤、蒸发)精制精制(结晶、干燥结晶、干燥)包含体包含体溶解溶解(加盐酸胍、脲加盐酸胍、脲)复性复性四四 典型生物分子分离实例分析典型生物分子分离实例分析蛋白质(酶)的分离纯化与鉴定 核酸的分离纯化与鉴定 多糖的分离纯化与鉴定 小分子物质的分离
7、与鉴定 蛋白质(酶)的分离纯化与鉴定蛋白质(酶)的分离纯化与鉴定 蛋白质(酶)分离纯化的原则 温和、高效、低成本 蛋白质(酶)纯度的鉴定 1.层析法 (常用RP-HPLC)2.凝胶电泳(常用SDS-PAGA)3.超离心法(需带分析系统的超离心设备)4.N端序列测定(均一单链蛋白,N端残基仅一种)5.溶解度测定(适合已知种类蛋白质)实例1 一种枯草芽孢杆菌氨肽酶的纯化及鉴定 工艺路线:枯草芽孢杆菌发酵粗酶液乙醇分级沉淀(37.5%60%)得酶沉淀,缓冲液溶解,15000rpm冷冻离心10min,去除沉淀SephadexG-75凝胶过滤Phenyl-sepharose 6FF疏水层析SDS-PAG
8、E鉴定纯度在不确定氨肽酶分子量的基础上,先采用中等分离范围的SephadexG-75(分级范围300080000)进行分离。乙醇分级后酶液经过SephadexG-75凝胶过滤,层析柱(1.1cm60cm),pH8.5,50mmol/LTris-HCl缓冲液(含0.1mmol/L的Co2)平衡柱子,上样量0.5mL,缓冲液流速为0.4mL/min,每管收集1.2mL,LNA法检测酶活。Sephadex G-75凝胶过滤图谱凝胶过滤图谱 有两个蛋白质峰,只有峰有酶活性,SDS-PAGE显示有三条主带,回收率为70.3,纯化倍数21.6。SephadexG-75凝胶过滤凝胶过滤层析柱(1.5cm40
9、cm),以含0.8mol/L的(NH4)2SO4的pH8.5,25mmol/LTris-HCl缓冲液平衡柱子,上样量2.5mL后,分别以含0.8mol/L,0.6mol/L,0.4mol/L,0.2mol/L(NH4)2SO4的 pH8.5,25mmol/LTris-HCl缓冲液进行阶段洗脱,280nm检测出峰,以LNA法检测酶活。Phenyl Sepharose 6FF疏水层析疏水层析Phenyl Sepharose 6FF疏水层析图谱疏水层析图谱盐浓度0.8mol/L时,一部分未吸附的蛋白洗脱下来,0.6mol/L时没有出峰,0.4mol/L、0.2mol/L盐浓度均有洗脱峰,测定酶活,只
10、有峰具有活性。回收率为12.6,纯化倍数100.7SDS-PAGE鉴定氨肽酶纯度鉴定氨肽酶纯度1.分子量标准分子量标准,2.乙醇分级沉淀乙醇分级沉淀,3.Sephadex G-75,4.Phenyl Sepharose 6FF疏水层析疏水层析 SDS-PAGE比较和鉴定各步氨肽酶分离纯度比较和鉴定各步氨肽酶分离纯度提纯步骤提纯步骤总酶活(总酶活(U)总蛋白(总蛋白(mg)比活(比活(U/mg)回收率()回收率()纯化倍数纯化倍数粗酶液(粗酶液(500mL)39350025.45154601001乙醇分级沉淀乙醇分级沉淀3431004.397815087.25.1Sephadex G-75276
11、6000.828433390070.321.6Phenyl-sepharose6FF495810.0319155670012.6100.7氨肽酶纯化结果工艺路线:银杏种仁破碎缓冲液4浸取离心得上清液硫酸铵分级沉淀(30%80%)DEAE-52离子交换层析MonoQ离子交换层析SDS-PAGE鉴定纯度。实例2 银杏种仁中一种抗氧化活性蛋白的纯化及鉴定 DEAE-52离子交换层析离子交换层析将经硫酸铵分级沉淀后的粗蛋白提取液透析后用磷酸缓冲液调pH6.5,上样,层析柱(2.0cm15cm),起始缓冲液为pH6.5,0.02mol/L的磷酸缓冲液。洗脱缓冲液为含0.1mol/L,0.2mol/L,0
12、.3mol/L,0.4mol/L的NaCl,pH6.5的磷酸缓冲液,阶段洗脱,流速1ml/min。在280nm波长下检测,收集峰液,以DPPH法检测抗氧化活性。经检测B2的抗氧化活性较高,且蛋白含量也较高。银杏银杏种仁蛋白的种仁蛋白的DEAE-52离子交换层析离子交换层析 Mono Q离子交换层析离子交换层析将有活性的B2部分浓缩脱盐,用磷酸缓冲液调整pH为7.0,上MonoQ离子交换层析柱(1.0cm10cm),起始缓冲液为pH7.0,0.02mol/L的磷酸缓冲液。线性梯度洗脱,缓冲液为pH7.0,0.02mol/L的磷酸缓冲液,NaCl的浓度在30min内由0.01mol/L增加到0.4
13、mol/L,流速1ml/min,在280nm波长下检测,收集峰液,适当浓缩后以DPPH法检测,峰C1的抗氧化性较高,收集峰C1。银杏银杏种仁蛋白的种仁蛋白的MonoQ离子交换层析离子交换层析 SDS-PAGE鉴定纯度鉴定纯度SDS-PAGE鉴定蛋白质亚基也为单一条带,分子量为8.7KD工艺路线:薏苡种子经破碎反复浸提等预处理硫酸铵分级盐析(50%75%)层析聚焦离子交换层析SDS-PAGE实例3 利用层析聚焦和离子交换层析快速分离分析薏苡38ku抗真菌蛋白聚焦聚焦层析(层析聚焦)层析(层析聚焦)补充知识点:聚焦层析是依据蛋白质的等电点差异和离子交换行为不同,聚焦层析是依据蛋白质的等电点差异和离
14、子交换行为不同,在在等电聚焦等电聚焦的基础上发展起来的,这一方法既有的基础上发展起来的,这一方法既有聚焦聚焦作用,作用,同时又有高分辨率的优点。同时又有高分辨率的优点。利用离子交换技术载样量高的特点,它可以把样品集中在利用离子交换技术载样量高的特点,它可以把样品集中在0.040.05个个pH梯度内,一次层析可以纯化几百毫克蛋白。梯度内,一次层析可以纯化几百毫克蛋白。一、流动相和固定相一、流动相和固定相流动相为多缓冲剂:由一系列精选的物质构成,在一定的流动相为多缓冲剂:由一系列精选的物质构成,在一定的pH范围具有相似的较强的缓冲能力。范围具有相似的较强的缓冲能力。Polybuffer 96和和P
15、olybuffer 74,如果将它们混合则在,如果将它们混合则在49范围都有较强缓冲能力。范围都有较强缓冲能力。固定相为多缓冲交换剂,通过化学方法把固定相为多缓冲交换剂,通过化学方法把带有多种电荷基团带有多种电荷基团的配体的配体与其偶联而成。由于这种多缓冲交换剂存在多种类型电与其偶联而成。由于这种多缓冲交换剂存在多种类型电荷基团,所以它的缓冲能力也相当强,可以自发的形成荷基团,所以它的缓冲能力也相当强,可以自发的形成pH梯梯度,同时也是离子交换的活性集团。度,同时也是离子交换的活性集团。基本原理基本原理在离子交换层析中,在离子交换层析中,pH梯度溶液的形成是靠梯度混合仪实现的。梯度溶液的形成是
16、靠梯度混合仪实现的。pH梯度溶液的形成梯度溶液的形成离子交换层析离子交换层析而在聚焦层析中,当洗脱液流进多缓冲交换剂时,由于交换剂上而在聚焦层析中,当洗脱液流进多缓冲交换剂时,由于交换剂上带有具有缓冲能力的电荷基团,故带有具有缓冲能力的电荷基团,故pH梯度溶液可以自动形成。梯度溶液可以自动形成。聚焦层析聚焦层析9876蛋白质的行为蛋白质的行为蛋白质所带电荷取决于它的等电点(蛋白质所带电荷取决于它的等电点(pI)和层析柱中的)和层析柱中的pH值。当值。当柱中的柱中的pH低于蛋白质的低于蛋白质的pI时,蛋白质带正电荷,且不与阴离于交时,蛋白质带正电荷,且不与阴离于交换剂结合。而随着洗脱剂向前移动,
17、固定相中的换剂结合。而随着洗脱剂向前移动,固定相中的pH值是随着淋洗值是随着淋洗时间延长而变化的。当蛋白质移动至环境时间延长而变化的。当蛋白质移动至环境pH高于其高于其pI时,蛋白质时,蛋白质由带正电行变为带负电荷,并与阴离子交换剂结合。由于洗脱剂由带正电行变为带负电荷,并与阴离子交换剂结合。由于洗脱剂的通过,蛋白质周围的环境的通过,蛋白质周围的环境pH 再次低于再次低于pI时,它又带正电荷,时,它又带正电荷,并从交换剂解吸下来。随着洗脱液向柱底的迁移,上述过程将反并从交换剂解吸下来。随着洗脱液向柱底的迁移,上述过程将反复进行,于是各种蛋白质就在各自的等电点被洗下来,从而达到复进行,于是各种蛋
18、白质就在各自的等电点被洗下来,从而达到了分离的目的。了分离的目的。pH梯度下移的速度是梯度下移的速度是poly buffer流速的流速的1/10,流出时是它的,流出时是它的等电点。等电点。不同蛋白质具有不同的等电点,它们在被离子交换剂结合以前,不同蛋白质具有不同的等电点,它们在被离子交换剂结合以前,移动之距离是不同的,洗脱出来的先后次序是按等电点排列的。移动之距离是不同的,洗脱出来的先后次序是按等电点排列的。pH值是沿着柱长增加的,在此值是沿着柱长增加的,在此pH梯度中,梯度中,蛋白质的蛋白质的pIpH时,其带正电荷,从离子时,其带正电荷,从离子交换剂上解吸出来,交换剂上解吸出来,pI=pH时
19、不移动。时不移动。67pH89Protein 2移动速率移动速率Protein 1聚焦效应聚焦效应蛋白质按其等电点在蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。列的过程叫做聚焦效应。pH梯度的形成是梯度的形成是聚焦效应的先决条件。聚焦效应的先决条件。4567pH在聚焦层析过程中,一种样品分次加入在聚焦层析过程中,一种样品分次加入时,只要先加入者尚未洗出,并且有一时,只要先加入者尚未洗出,并且有一定的聚焦时间,就还可以将样品再加到定的聚焦时间,就还可以将样品再加到柱上,其聚焦过程仍能够顺利完成,得柱上,其聚焦过程仍能够顺利完成,得到满意的结果。到满意的结果。聚焦效
20、果聚焦效果分离效果分离效果 聚焦层析聚焦层析Mono P柱,起始缓冲液为 0.075 molL-1Tris,用1 M CH3COOH调pH 9.3;洗脱缓冲液为 poly buffer 96稀释10倍,1 M CH3COOH 调pH6.0,高盐离子洗脱缓冲液为2 M CH3COONa。试验前将各溶液过滤(0.22 m 滤膜),脱气 5 min。设定流速 0.5 mLmin-1,检测波长280 nm。系统pH计在线监测流动相pH值,每次运行前用 pH 标准液(pH 7.0、pH 10.0)校正。洗脱过程中形成线性pH 下降梯度,梯度(9.0 6.0)内按 0.2 pH 间隔自动收集。当流出液的
21、pH 稳定在 6.0 0.1,注入1 mL高盐离子洗脱缓冲液进行高盐洗脱。薏苡薏苡抗真蛋白的层析聚焦分离图谱抗真蛋白的层析聚焦分离图谱 离子交换层析离子交换层析薏苡抗真菌蛋白的离子交换层析分离图谱薏苡抗真菌蛋白的离子交换层析分离图谱Hitrap SP 柱,Mono S柱,流动相A是25 mmolL-1乙酸,pH 5.0;流动相B是在流动相A中加入NaCl至1 molL-1。洗脱梯度 0%100%NaCl,洗脱体积10个柱体积,流速1 mLmin-1;分离出活性组分用流动相A稀释后第一次Mono S分离,洗脱梯度 0%77%NaCl,洗脱体积15个柱体积,流速 0.8 mLmin-1;分离出的活
22、性组分用流动相A稀释后,再次进行 MonoS分离,洗脱梯度12%24%NaCl,洗脱体积15个柱体积,流速0.8 mLmin-1。实例5 鹰嘴豆分离蛋白分离纯化以RP-HPLC为纯度检测手段,运用Sephacryl S-200和DEAE-Sepharose CL-6B对鹰嘴豆分离蛋白进行分离纯化,得到分子量为170 kD和110 kD的两个主要组分。Sephacryl S-200凝胶层析凝胶层析Sephacryl S-200平衡脱气并装入16mm1.5m柱中。洗脱缓冲液:pH7.6的磷酸盐缓冲液,含0.0325mol/L K2HPO4、0.0026mol/LKH2PO4、0.4mol/L Na
23、Cl、离子强度0.5mol/L 和0.01mol/L巯基乙醇。样品:0.5gCPI溶于10ml pH7.6的磷酸盐缓冲液中,4、10000g离心15min,取上清液,上样量4ml,洗脱流速为16.5ml/h。蛋白质标准分子量蛋白质标准分子量:A-二磷酸果糖酶(二磷酸果糖酶(Mw158000;B-牛血清蛋白(牛血清蛋白(Mw68000);C-白蛋白(白蛋白(Mw45000);D-胰凝乳蛋白酶原(胰凝乳蛋白酶原(Mw25000);E-细胞色素细胞色素C(Mw125000)Sephacryl S-200凝胶分离层析图谱凝胶分离层析图谱 DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析离子交换层析
24、DEAE-Sepharose CL-6B层析用起始磷酸盐缓冲液平衡柱子(2.6cm20cm)后上样,洗脱流速为100ml/h。起始缓冲液:pH7.6的磷酸盐缓冲液,含0.0325mol/L K2HPO4、0.0026mol/L KH2PO4。洗脱缓冲液:起始缓冲液中加入不同浓度的NaCl溶液阶段洗脱,NaCl浓度00.5mol/L(如图7.20),每个阶段浓度洗脱两个柱体积(200ml)。样品制备:S-200分离纯化后得到的组分,在DEAE起始缓冲液中透析脱盐、10kDa超滤膜浓缩后上样。上样量为40ml,蛋白质120mg。S-200峰峰2 S-200峰峰3DEAE-Sepharose-6B分
25、离纯化图谱分离纯化图谱(3)RP-HPLC检测检测据蛋白质的表面疏水性差异,利用反相层析柱对DEAE分离纯化得到的组分B、D进行纯度鉴定,结果可看出,B和D在C18柱上的保留时间分别为9.696min 和9.439min,但同时都有一个裂解峰,保留时间分别为9.432min和9.081min(除此之外均为溶剂峰)。C18 RP-HPLC纯度鉴定图谱纯度鉴定图谱小结:上述5个分离实例中,前期都须根据材料的不同特点进行一定的前处理,中后期往往是将两种技术组合起来,有疏水层析+凝胶层析、离子交换+离子交换、层析聚焦+离子交换、凝胶过滤+离子交换,并通过SDS-PAGE或Nature-PAGE或RP-
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