酶联免疫吸附试验-乙肝两对半测定课件.ppt

1、酶联免疫吸附实验(ELISA)乙肝两对半测定酶联免疫吸附实验原理将抗原(或抗体)结合到固相载体上，当加入阳性标本后，相应抗体(或抗原)结合到固相抗原(或抗体)上，利用酶标记的抗抗体(或抗体)可检测出标本中与固相抗原(或抗体)结合的抗体(或抗原)。n间接法、夹心法、竞争法、捕获法乙型肝炎病毒嗜肝病毒科双链DNA病毒三种病毒颗粒 n小球型：由HBsAg组成，不含核酸n管型：由小球型连接而成n大球型(Dane颗粒)：完整，有感染性乙肝病毒血清标志物HBsAgn第一个出现，感染后1-2周即可阳性n阳性表示存在HBV感染HBsAbn出现在HBsAg消失后n保护性抗体n疫苗免疫成功的标志 乙肝病毒血清标志

2、物HBeAgn病毒复制标志n传染性强HBeAb n传染性降低n长期存在是DNA与肝细胞整合的结果乙肝病毒血清标志物HBcAg nHBV复制的标志n血清中检测不出来IgM-HBcAb n急性HBV感染IgG-HBcAbn急性感染恢复期和慢性持续感染乙肝病毒血清标志物检测原理血清学标志原理包被试剂标记或结合物结果判断HBsAg夹心法HBsAbHBsAb显色(+)HBsAb夹心法HBsAgHBsAg显色(+)HBeAg夹心法HBeAbHBeAb显色(+)HBeAb竞争法HBeAbHBeAb及中和抗原不显色(+)HBcAb竞争法HBcAgHBcAb不显色(+)HBcAb-IgM捕获法抗人IgM 链 H

3、BcAb显色(+)试剂盒组成包被板nHBsAg红色nHBsAb绿色nHBeAg蓝色nHBeAb粉红色nHBcAb橘黄色试剂盒组成阴性对照和阳性对照酶标记物(HBeAb测定试剂中含中和抗原)底物A和底物B终止液洗涤浓缩液操作步骤平衡：将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温(18-25)。配洗涤液：充分摇匀浓缩洗涤液(如有晶体应充分溶解)，用蒸馏水或去离子水按1:19稀释。编号：将微孔条固定于支架，按序编号。操作步骤加样：分别用加样器在孔中加入阴、阳性对照或待测血清样本50ul(HBcAb测定时待测血清用生理盐水1:30稀释50ul血清+1.5ml生理盐水)。加酶：分别在每孔中加入酶标记抗体50ul

4、(HBeAb测定时还要在每孔中加入中和抗原HBeAg50ul)，轻拍混匀。操作步骤温育：置37温育60分钟，室温平衡5分钟。洗涤：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完后扣干(每次洗涤保持30-60秒的浸泡时间)。显色：每孔加底物A、B各50ul，轻拍混匀，置37避光15分钟。终止：每孔加终止液50ul，混匀。观察结果。结果判断肉眼判定(见前表)酶标仪判定：用酶标仪单波长450nm或双波长450nm/630nm测定各孔OD值，并根据cut-off值判定结果nOD值cut-off值为阳性nOD值cut-off值为阴性注意事项浓缩洗涤液配制前充分摇匀。加样本时要加到孔底。加试剂前应将试剂瓶翻转数次，使液体混

5、匀。如果滴加，滴加前应弃去1-2滴。注意事项滴加时瓶身应保持垂直，以使滴量准确。勿将试剂滴在孔壁上。洗涤时各孔须加满，防止孔口内有游离酶残留。洗涤时注意孔与孔之间的交叉污染。脂血，溶血可影响结果。注意事项所有样本都应按传染源处理。样品显色深浅与样品中抗体的含量没有一定正相关。任何一种测试都不能绝对保证样品中没有低浓度的抗体存在。不同品名、不同批号的试剂不可混用，以免产生错误结果。常见模式及临床意义HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAb临 床 意 义+急性或慢性乙型肝炎感染；提示HBV复制，传染性强大三阳+急性HBV感染趋向恢复；慢性HBsAg携带者；传染性弱小三阳+急性HBV感染；

6、慢性HBsAg携带者；传染性弱+慢性HBsAg携带者易转阴；急性HBV感染趋向恢复+急性HBV感染早期或慢性携带者，传染性强+急性HBV感染早期；急性HBV感染潜伏期；慢性HBV携带者，传染性弱常见模式及临床意义HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAb临 床 意 义+非典型性或亚临床型HBV感染+注射过乙肝疫苗有免疫力；既往感染；假阳性+急性HBV感染后康复+HBV感染后已恢复+既往感染，仍有免疫力；HBV感染恢复期+既往感染未能测出HBsAb；恢复期HBsAg已消，HBsAb尚未出现；无症状HBsAg携带者过去和现在未感染过HBV固相抗原或抗体样本(含抗体或抗原)酶标抗体或抗原夹心法竞争法捕获法注意事项封口膜使用说明：n微孔板拆封后，在取出当天所需的微孔条后，其余微孔条可以封口膜封存以避免受潮。在封存时，注意勿把封口膜粘贴到微孔条底部，以免影响其透光性。n微孔板温育时，以封口膜覆盖孔口，可避免其它因素对实验带来的非预期的影响。