聚丙烯酰胺凝胶电泳课件.ppt

1、琼脂糖和聚丙烯酰胺是目前实验室最常用琼脂糖和聚丙烯酰胺是目前实验室最常用的支持介质的支持介质 琼脂糖核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、琼脂糖核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化鉴定和纯化DNADNA或或RNARNA片段片段1.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。2.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒 等大分子物质。3.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。4.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定 5.有热可逆性琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。琼脂糖的基本结构是由 1,3

2、连结的-D-半乳糖和 1,4 连结的 3,6-脱水-L-半乳糖相间联结而成。琼脂糖在水中一般加热到 90 以上溶解，温度下降到 35-40 液体形成良好的半固体状的凝胶。琼脂糖的凝胶性是由存在的氢键所致，凡是能破坏氢键的因素都能导致凝胶性的破坏。1,3 连结1,连结1,连结3,6-脱水3,6-脱水 核酸分子之糖核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈磷酸骨架中的磷酸基团，呈负离子化负离子化状态；状态；核酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正电极方向迁核酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正电极方向迁移，其迁移速率又受到多方面因素的影响。移，其迁移速率又受到多方面因素的影响。琼脂糖凝胶电泳

3、工作原理琼脂糖凝胶电泳工作原理+-PowerDNA-+电镜下观察其显微结构(11m)制备好的琼脂糖凝胶是多孔的，可以使DNA通过 电压、缓冲液、琼脂糖浓度、DNA片段的大小、DNA构象等均会决定DNA的迁移速率 小片段DNA比大片段DNA在其他条件相同下泳动速率要快 琼脂糖浓度越低，相同核酸分子迁移越快 同一分子：超螺旋环状线状切口环状DNA迁移速率的决定因素迁移速率的决定因素+-Power smalllarge 线形线形DNADNA分子，其电场中的迁移率与其相对分子质分子，其电场中的迁移率与其相对分子质量的对数值成反比量的对数值成反比不同类型琼脂糖的性质不同类型琼脂糖的性质不同类型琼脂糖分离

4、DNA片段的范围标标 准准(kb)1500.7250.5150.25120.1560.084琼脂糖琼脂糖缓冲液缓冲液 三角烧瓶三角烧瓶琼脂糖凝胶的配制 琼脂糖的称量 欲配制100ml 1%浓度的琼脂糖凝胶，称取1g琼脂糖粉，倒入指定三角瓶中，加入100ml 1TBE 琼脂糖凝胶电泳的设备电泳槽电泳槽电源电源 电泳槽盖子电泳槽盖子琼脂糖凝胶容器琼脂糖凝胶容器 梳子梳子 如右图将梳子佳好，注意观察梳子的底部应不与容器接触，以免做出的胶漏孔。煮胶琼脂糖在常温下是不融的煮化后呈透明状*在微波炉中煮化时要小心不要让凝胶暴沸，要间歇性煮。待三角瓶冷却到60 左右时倒胶，赶走气泡保证每个梳子齿均能插入胶5m

5、m左右即可待胶凝固后，小心拔去梳子，拔出时注意不要破坏胶孔.用刀片切下所需的胶块，放入加有足够电泳缓冲液(1TBE)的电泳槽中，缓冲液面高于凝胶表面35mm即可倒胶倒胶上样上样 电泳电泳操作方法：操作方法：可在一干净手套上点滴适量(13uL)的3溴酚兰上样缓冲液(深绿色深绿色)，用枪移取适量的样品(110uL)与滴加好的溴酚兰上样缓冲液混合(可观察到混合液变为蓝色蓝色)，再将混合液小心加入胶上的样品孔中。上样要迅速准确，上样量不要过大以致漫出样品孔 若样品要求无污染，可使用新的灭菌枪头上样 若样品无严格要求(如用来做小量酶切鉴定的样品)，可用一个枪头多次上样，但每次上样前在电泳缓冲液中洗几下

6、电源接对正负极注意事项：2000bp1200bp 750bp 500bp200bp80bp荧光染料的选择荧光染料的选择溴化乙锭（ethidium bromide，EB）SYBR GreenadvantagesInexpensiveLess toxicNo UV light requiredNo hazardous waste disposaldisadvantagesLess sensitiveMore DNA needed on gelLonger staining/destaining time花青素属于酚类化合物中的类黄酮类(flavonoids)。基本结构包含二个苯环，并由一3碳的单位连结(C6-C3-C6)。花青素因所带羟基数(-OH)、甲基化(methylation)、醣基化(glycosylation)数目、醣种类和连接位置等因素而呈现不同颜色。颜色的表现因生化环境条件的改变，如受花青素浓度、共色作用、液胞中pH値的影响 自然界有超过300种不同的花青素。样品样品M样品样品M思考题思考题n1、提取的环状质粒、提取的环状质粒DNA在琼脂糖凝胶电泳在琼脂糖凝胶电泳中可出现几条带？中可出现几条带？n2、电泳中缓冲液的作用是什么？、电泳中缓冲液的作用是什么？