聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳法分离牛血清蛋白课件.ppt

1、生物化学实验生物化学实验实验一实验一 蛋白质的部分性质蛋白质的部分性质一、试验原理一、试验原理 蛋白质分子中某种或某些集团可与显色剂作用，产生颜色。不同的蛋白质由于所含的氨基酸不完全相同，颜色反应亦不完全相同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质也可产生同样的颜色反应，因此不能根据颜色反应的结果来决定被测物是否为蛋白质。另外，颜色反应也可作为一些常用蛋白质定量测定的依据。第一部分、蛋白质的颜色反应二、实验仪器二、实验仪器1、吸管 2、滴管 3、试管 4、电炉 5、pH试纸 6、水浴锅三、实验试剂三、实验试剂1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-20倍，3-4层纱布过滤，滤液放在冰箱里

2、冷藏备用。2、0.5%苯酚：1g苯酚加蒸馏水稀释至200ml。3、Millons试剂：40g汞溶于60ml浓硝酸（水浴加温助溶）溶解后，冷却，加二倍体积的蒸馏水，混匀，取上清夜备用。此试剂可长期保存。4、尿素晶体5、1%CuSO4：1g CuSO4晶体溶于蒸馏水，稀释至100ml6、10%NaOH：10g NaOH溶于蒸馏水，稀释至100ml7、浓硝酸8、0.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%的乙醇并稀释至100ml.9、冰醋酸10、浓硫酸四、实验步骤四、实验步骤（一）（一）米伦（米伦（Millons）反应）反应：米伦试剂是硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物。他能与苯酚及某些二羟基苯

3、衍生物起颜色反应。组成蛋白质的氨基酸中只有酪氨酸含苯酚集团，因此该反应为蛋白质中酪氨酸存在的依据。：1、苯酚实验：取0.5%苯酚溶液1ml于试管中，加Millons试剂0.5ml，于电炉上小心加热，溶液即出现玫瑰红色。2、蛋白质实验：取2ml蛋白液，加Millons试剂0.5ml，出现白色的蛋白质沉淀，小心加热，凝固的蛋白质出现红色。（二）（二）双缩脲反应双缩脲反应：尿素被加热，则两分子的尿素放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成紫色的化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故也能进行此反应。双缩脲反应可作为蛋白质定量测定的依据。：1、取少量尿

4、素晶体放在干燥的试管中，微火加热使其熔化成液体，此时有氨气放出，可用湿润的试纸检验，至液体重新结晶出现白色固体时，停止加热，冷却。然后加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1%CuSO4溶液，混匀，观察有无紫色出现。2、取蛋白液1ml，加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1%CuSO4溶液，混匀，观察有无紫色出现。（三）（三）黄色反应黄色反应：蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），于浓硝酸可反应并生成黄色物质，此物质在碱性环境下变为桔黄色的硝基苯衍生物。：取一支试管，加入1ml蛋白液及浓硝酸5滴。加热，冷却后注意颜色变化。然后再加入10%NaOH溶液1ml，

5、颜色有什么变化？（四）（四）茚三酮反应茚三酮反应：蛋白质与茚三酮共热，产生兰紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切蛋白质及a-氨基酸所共有。亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）与茚三酮反应呈黄色，含有氨基的其他物质亦呈此反应。：取蛋白液1ml于试管中，加4-8滴茚三酮溶液，加热至沸，即有蓝紫色出现。第二部分、第二部分、蛋白质的沉淀反应一、试验原理一、试验原理蛋白质是亲水性胶体，在溶液中的稳定性与质点大小、电荷水化作用有关，但其稳定性是有条件的，相对的。如果条件发生了变化，破坏了蛋白质的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。二、实验仪器二、实验仪器1、移液管 2、吸管 3、试管 4、电炉三、实

6、验试剂三、实验试剂1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-20倍，3-4层纱布过滤，滤液放在冰箱里冷藏备用。2、饱和硫酸铵溶液：100ml蒸馏水中加硫酸铵至饱和。3、硫酸铵晶体：用研钵研成碎末。4、95%乙醇。5、醋酸铅溶液：1g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml6、硫酸铜溶液：1g CuSO4晶体溶于蒸馏水，稀释至100ml7、氯化钠晶体8、10%三氯乙酸溶液：10g三氯乙酸溶于蒸馏水中并稀释至100ml9、饱和苦味酸溶液：100ml蒸馏水中加苦味酸至饱和。10、1%醋酸溶液。四、实验步骤四、实验步骤（一）蛋白质的盐析作用（一）蛋白质的盐析作用：向蛋白质中加入大量的中性盐（硫酸铵、硫酸钠或氯

7、化钠等），使蛋白质胶体颗粒脱水，破坏其水化层，同时它所带有的电荷亦被中性盐上所带的相反电荷的离子所中和。于是稳定因素被破坏，蛋白质聚集沉淀。盐析作用一般不使蛋白质变性。：1、取试管1支，加蛋白液2ml，在加入饱和硫酸铵溶液2-4ml，摇匀静置数分钟，则有球蛋白析出。2、将上述混合液过滤。向滤液中逐渐加入少量固体硫酸铵（每次加入量约为米粒大小），边加边摇，直至饱和为止，此时析出为清蛋白。再加入少量蒸馏水，观察沉淀是否溶解。（二）有机溶剂沉淀蛋白质（二）有机溶剂沉淀蛋白质：某些有机溶剂（如乙醇、甲醇、丙醇等），因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝聚

8、而沉淀。：取一试管加蛋白液1ml，加入晶体氯化钠少许，待溶解后再加95%乙醇3ml,摇匀，观察现象。（三）重金属盐与某些有机酸沉淀蛋白质（三）重金属盐与某些有机酸沉淀蛋白质：重金属离子（如Pb2+、Cu2+等）与蛋白质的羧基等结合生成不溶性的金属盐类而沉淀，同时蛋白质发生变性。某些有机酸的酸根则与蛋白质的自由氨基结合而沉淀。：1、取试管2支，各加蛋白液2ml，一支管中滴加1%醋酸铅溶液，另一支管中滴加1%硫酸铜溶液，至有沉淀产生。2、取一支试管加蛋白液2ml，再加入10%三氯乙酸1ml，充分混匀，观察结果。（四）生物碱试剂沉淀蛋白质（四）生物碱试剂沉淀蛋白质：植物体内具有显著生理作用的含氮碱性

9、化合物成为生物碱。能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂。当溶液PH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易与生物碱试剂的负离子发生反应而沉淀。：取一支试管，加入蛋白液2ml及醋酸4-5滴，再加饱和苦味酸数滴，观察现象。实验二实验二 蛋白质等电点的测定蛋白质等电点的测定一、实验原理一、实验原理蛋白质是两性电解质。蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上征服电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有其特异性的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此

10、种性质的变化测定各钟蛋白质的等电点。最常用的方法是测定其溶解度最低时的溶液pH值。本实验借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸与醋酸钠(醋酸钠混合在酪蛋白溶液中)配制成各种不同pH值的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。在蛋白质溶液中存在下列平衡：在蛋白质溶液中存在下列平衡：二、实验仪器水浴锅、温度计、200mL锥形瓶、100mL容量瓶、吸管、试管、试管架、乳钵三、实验试剂0.4%酪蛋白醋酸钠溶液1.00mol/L醋酸溶液0.10mol/L醋酸溶液0.010.10mol/L醋酸溶液四、实验步骤四、实验步骤（1）取同样规格的试管

11、4支，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀（在测定等电点的实验中，要求各种试剂的浓度和加入量相当准确）。试管号蒸馏水（m l）0.01N 醋酸（m l）0.1N 醋酸（m l）1.0N 醋酸（m l）18.40.628.70.338147.41.6（2）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶1ml；加一管，摇匀一管。此时1、2、3、4管的pH值依次为5.9、5.3、4.7、3.5。观察其混浊度。静置10min后，再观察其混浊度。最混浊的一管的pH即为酪蛋白的等电点。实验三实验三 双缩脲法测定蛋白质的浓度双缩脲法测定蛋白质的浓度一、实验原理一、实验原理蛋白质在碱性溶液中可与CU2+形成紫色化合物，

12、在一定浓度的范围内，蛋白质浓度与生成的紫色化合物颜色的深浅成正比，可用比色法测定。二、实验仪器二、实验仪器1、试管2、吸管3、容量瓶4、7220分光光度计三、实验试剂三、实验试剂1、1mg/ml卵清蛋白液：将1g卵清蛋白溶于0.9%NaCl溶液并稀释至1000ml.2、双缩脲试剂：将1.75gCuSO4.5H2O溶于约150ml蒸馏水，然后置于1000ml容量瓶中，加入300ml浓氨水、300ml冰冷的蒸馏水和200ml饱和氢氧化钠溶液，摇匀，室温放置2小时，再加蒸馏水至刻度，摇匀备用。四、实验步骤四、实验步骤1、标准曲线的绘制：取7支干燥的试管，按下表加入试剂：将上述溶液混合后，试管中即有紫

13、红色出现，在540nm下测的各管的吸光度，以蛋白质浓度为横坐标，OD值为纵坐标作出标准曲线。2、样液的测定取未知浓度的蛋白质溶液3.0ml置试管中，加入双缩脲试剂2.0ml，混匀，测其540nm的吸光度，对照标准曲线求得未知液蛋白质浓度。0 1 2 3 4 5 6 2mg/ml 卵清蛋白液（ml）0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 1.8 蒸馏水（ml）3 2.7 2.4 2.1 1.8 1.6 1.2 双缩脲试剂（ml）2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 OD540 0 实验四实验四 酶的专一性研究酶的专一性研究 一、原理一、原理 用不同的醇作底物，观察醇脱氢酶的

14、专一性。根据NADH对340nm波长紫外线有最大吸收的特性，可用OD340nm表示酶活力。每毫克酶蛋白有多少酶活力单位成为酶的比活力。二、实验仪器二、实验仪器1.吸管2.试管3.7220分光光度计4.TU-1800紫外分光光度计1、3mol/L甲醇溶液：120ml无水甲醇加蒸馏水稀释至1000ml.2、3mol/L乙醇溶液：174.6ml无水乙醇加蒸馏水稀释至1000ml。3、3mol/L正丙醇溶液：225ml正丙醇加蒸馏水稀释至1000ml。4、0.01mol/L磷酸氢二钾溶液：称取1.74gK2HPO4溶于蒸馏水中，稀释并定容至1000ml。5、0.06mol/L焦磷酸钠溶液：称取22.5

15、6g焦磷酸钠溶于蒸馏水中，稀释并定容至1000ml。6、0.0015mol/LNAD溶液：称取NAD0.0995g溶于蒸馏水并稀释至1000ml。7、醇脱氢酶溶液：用0.01mol/L磷酸氢二钾溶液溶解至每毫升含200-1000活力单位。三、实验试三、实验试剂剂 8、Folin-酚试剂B：将100g钨酸钠、25g钼酸钠、700ml蒸馏水、50ml85%磷酸继100ml浓盐酸置于1500ml的磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，回馏10小时，再加入硫酸锂150g，蒸馏水50ml及液溴数滴，开口煮沸15分钟，在通风橱内驱除过量的溴。冷却，稀释至1000ml，过滤，滤液成微绿色，贮于棕色瓶中

16、。临用时，用1mol/l的氢氧化钠溶液滴定，用酚酞作指示剂，根据滴定结果，将试剂稀释至相当于1mol/L的酸。四、实验步骤四、实验步骤 取四支石英比色杯编以1、2、3、4号，按下表加入试剂。在1号比色杯中加入0.1ml酶液，混匀，放入分光光度计，用作空白对照。在向2号比色杯中加入0.1ml酶液（开始计时），迅速混匀测OD340nm，以后每隔15秒测一次，直至OD340nm的值不再上升。按同样的方法再测3、4号比色杯中的溶液。以OD340nm值为纵坐标，时间秒为横坐标作图，取初速度（曲线上升部分）求得酶活力。（本试验以OD340nm酶改变0.001单位定为一个活力单位，以酶活力单位/分表示酶活力

17、）。试剂01230.06mol/LNa4P2O2溶液（pH8.5）0.50.50.50.50.0015mol/LNAD溶液0.10.10.10.13mol/L甲醇溶液-0.1-3mol/L乙醇溶液-0.1-3mol/L正丙醇溶液-0.1蒸馏水2.32.22.22.2取酶液0.1ml，加蒸馏水4.9ml，摇匀。加此稀释液1.0ml，加入Folin-酚试剂A4.0ml，室温放置10分钟，加入Folin-酚试剂B 0.5ml，30分钟后，测OD500nm。对照标准曲线，求得蛋白质浓度。计算的酵母醇脱氢酶对三种醇的比活力。（比活力=活力单位数/毫克蛋白质。以比活力为纵坐标，醇的碳链长度为横坐标作图，按

18、图说明酶的专一性。实验五实验五 醋酸纤维薄膜电泳法分离牛醋酸纤维薄膜电泳法分离牛血清蛋白血清蛋白一、原理一、原理 蛋白质是两性电解质。当PHPI时，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动；当PHPI时，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动。血清中含有数种蛋白质，在同一PH值时，因所带电荷不同，而在电场中的移动速度也不相同，故可用电泳法将其分离。本试验以牛血清为材料，醋酸纤维薄膜为支持物，通过点样、电泳、染色、脱色从而得到血清中蛋白质的分离图谱，再进行观察和定量分析。二、实验仪器二、实验仪器1、牛血清2、醋酸纤维薄膜3、镊子4、电泳仪5、电泳槽6、载玻片三、实验试剂三、实验试剂 1、巴比妥巴比妥钠缓冲

19、液（离子强度，PH8.6）：称取巴比妥1.66g和巴比妥钠12.76g，溶于蒸馏水并稀释至1000ml。用pH计较正后使用。2、染色液：氨基黑10B0.5g,甲醇50ml，冰乙酸10ml，蒸馏水40ml混匀即可。3、漂洗液：95%乙醇45ml，冰乙酸5ml和蒸馏水50ml混匀即可。四、试验步骤四、试验步骤 1、准备：用镊子取薄膜一条，浸入缓冲液中，完全浸透后（大约3-5分钟），用镊子取出，将无光泽的一面向上，平放在干净滤纸上，将滤纸对折，吸取多余的缓冲液。2、点样：取载玻片一块，用点样管将血清均匀的涂在载玻片的一端面上，在薄膜一端1/3处点样。3、电泳：将薄膜平贴于放在电泳槽上并已浸透缓冲液的

20、滤纸上，无光泽面要向下放置，点样端放在阴极，进行电泳。电泳条件：电压90-110V，电流0.4-0.6A,通电60分钟。4、染色：电泳完毕，将薄膜浸入染色液中5-10分钟，进行染色。5、漂洗：染色完毕，将薄膜取出，放入漂洗液中漂洗至背景无色，在浸入蒸馏水中。6、图谱观察：观察图谱，将各种血清蛋白质按实际比例大小绘于实验报告纸上。实验六实验六 维生素维生素C的定量测定的定量测定（2，6-二氯靛酚滴定法）二氯靛酚滴定法）一、原理一、原理 维生素c又称为抗坏血酸，其还原型能还原染料2，6-二氯靛酚钠盐，本身则氧化成脱氢抗坏血酸。在酸性溶液中，2，6-二氯靛酚成红色，被还原后变为无色。因此可用2，6-

21、二氯靛酚滴定样品中含有的维生素C，当样品中的维生素C被完全还原后，在滴加过量的2，6-二氯靛酚，溶液变为淡红色，即为终点。如无其他杂质干扰，则样品液所还原的2，6-二氯靛酚的量与样品中所含有维生素C的量成正比。二、实验仪器二、实验仪器新鲜水果吸管容量瓶滴定装置锥形瓶研钵漏斗 三、实验试剂三、实验试剂 1、2%草酸溶液：草酸2g，溶于100ml蒸馏水。2、1%草酸溶液：草酸1g，溶于100ml蒸馏水。3、标准维生素C液：准确称取10.0mg维生素C，溶于1%草酸溶液，并稀释至100ml，贮于棕色瓶中，冷藏，最好临用时配制。此溶液浓度0.1mg/ml.4、0.1%2，6-二氯靛酚溶液：称取500m

22、g2，6-二氯靛酚溶于300ml含有104mg碳酸氢钠的热水中，冷却，加蒸馏水并稀释至500ml，滤去不溶物，贮于棕色瓶中，冷藏。四、实验步骤四、实验步骤 1.样品中抗坏血酸的提取：将水果用水洗干净，用滤纸吸取表面水分。称取2.0g，加2%草酸试剂100ml置组织捣碎机中打成浆状。称取浆状物5.0g，倒入50ml容量瓶中，用2%草酸溶液稀释并定容，混匀，静止10分钟，过滤（最初数毫升滤液弃去），滤液备用。2.滴定1)标准液的滴定：准确吸取标准抗坏血酸溶液1.0ml于100ml锥形瓶中，加9ml1%草酸溶液，用2，6-二氯靛酚滴定至淡红色。滴定终点要保持15秒钟。有所用2，6-二氯靛酚的体积算出

23、1ml染料相当于多少毫克抗坏血酸。2)样品液的滴定：准确吸取滤液两份，每份10ml，分别放入两个100ml锥形瓶中，滴定方法同上。五、结果计算五、结果计算 按下式计算100mg样品中含抗坏血酸的毫克数：m=V*T/W*100 V=滴定时所用染料ml数 T=每毫升染料氧化抗坏血酸质量 W=10ml样液相当于含样品的质量数实验七实验七 核酸的定量测定核酸的定量测定-定磷法定磷法 一、原理一、原理核酸分子中有一定比例的磷，测得含有磷的量，即可求得核酸的量。用强酸使核酸分子中的有机磷消化为无机磷，再与钼酸铵反应生成黄色物质，当有还原剂存在时，Mo6+还原成Mo4+，此4价的钼再与试剂中没有反应的MoO

24、4结合成Mo(MoO4)2或Mo3O8,呈蓝色，称为钼蓝。在一定浓度范围内，蓝色的深浅和磷的含量成正比，可用比色法测定。样品中往往含有无机磷，影响结果，使其偏高，故要将其除去。二、实验仪器二、实验仪器 1、7220分光光度计 2、试管 3、容量瓶 4、克氏烧瓶 5、漏斗 6、恒温水浴锅三、实验试剂三、实验试剂1、标准磷溶液：将磷酸二氢钾于110烘至恒重，准确称取0.8775g溶于3、少量蒸馏水中，全部转移至500ml容量瓶中，加入5ml硫酸溶液（10mol/l）及氯仿数滴，用蒸馏水稀释至刻度，此溶液每毫升含磷400ug，临用时准确稀释20倍（20ug/ml）2、定磷试剂：A、17%硫酸：17m

25、l浓硫酸缓缓加入83ml蒸馏水中B、2.5%钼酸铵溶液：2.5g钼酸铵溶于100ml蒸馏水中。C、10%抗坏血酸溶液：10g抗坏血酸溶于100ml蒸馏水中，贮于棕色瓶中，溶液呈淡蓝黄色可用，呈棕黄色甚至棕色即失败。临用时，将上述三种溶液和蒸馏水按如下比例混合（体积比），17%硫酸：2.5%钼酸铵溶液：10%抗坏血酸溶液：蒸馏水=1：1：1：23、5%氨水4、27%硫酸：27l浓硫酸缓缓加入7ml蒸馏水中5、30%过氧化氢四、试验步骤四、试验步骤1.磷标准曲线的绘制取干燥的试管8支，编号，按下表加入试剂：管号01234567标准磷溶液蒸馏水定磷试剂0330.12.930.22.830.32.73

26、0.42.630.52.530.62.430.72.33加毕摇匀，在45恒温水浴中保温10分钟，冷却，在660nm下测吸光度，以OD值为纵坐标，磷含量为横坐标作标准曲线。2.总磷的测定：称取样品0.1g，用少量水溶解，全部转移至50ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度。此溶液每毫升含样品2毫克。吸取上述样液1.0ml，置于50ml克氏烧瓶中，加入2.5ml 27%硫酸及一粒玻璃珠，克氏烧瓶上插一小漏斗，在通风橱中加热，至溶液透明，表示消化完成。冷却，将消化液转移到100ml容量瓶中，用少量蒸馏水洗涤克氏烧瓶两次，洗涤液一并倒入容量瓶中。在加水至刻度，混匀后，吸取3.0ml于试管中，加定磷试剂3.0ml

27、，混匀，在45恒温水浴中保温10分钟，冷却，在660nm下测吸光度。3.无机磷的测定吸取样液（2mg/ml）1.0ml，置于100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，混匀后，吸取3.0ml于试管中，加定磷试剂3.0ml，混匀，在45恒温水浴中保温10分钟，冷却，在660nm下测吸光度。五、结果计算五、结果计算 有机磷OD660=总磷OD660无机磷OD660 由标准曲线查的有机磷克数（X）。按下式计算样品中核算的百分含量：核酸%=X/测定时取样毫升数*稀释倍数*11/样品重量*100%实验八实验八 Folin-Wu法定量测定血糖的含量法定量测定血糖的含量一、目的要求 1、掌握FolinWu法测定血糖

28、含量的原理和方法。2、学会制备无蛋白血滤液。二、实验原理二、实验原理Cu2+(CuSO4)+葡萄糖葡萄糖 Cu+(Cu2O)Cu2O +酸性酸性钼钼酸酸试剂试剂 蓝蓝色色钼钼化合物化合物 OD420比色比色 无蛋白血滤液中的葡萄糖和碱性硫酸铜溶液共热反应，Cu2+即被葡萄糖还原成Cu+（Cu2O）,Cu2O又把酸性钼酸试剂（Mo6+）还原成低价的蓝色钼化合物钼蓝。血滤液中葡萄糖的含量与产生的Cu2O成正比，而Cu2O的量与产生的钼化合物的量成正比。可用比色法定量的测定。二、实验仪器二、实验仪器1、新鲜兔子血 2、滤纸 3、血糖管（25ml）4、奥氏吸管（1ml）5、锥形瓶（50ml）6、漏斗7

29、、电炉 8、水浴锅 9、7200型可见分光光度计血糖管奥氏吸管7200型分光光度计 1、标准葡萄糖溶液（、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）(1)1%葡萄糖母液：称取1.000g葡萄糖，溶于蒸馏水，稀释并定容至100ml。(2)葡萄糖标准液：取1.0ml葡萄糖母液于100ml容量瓶中，加蒸馏水定容。2、10%钨酸钠溶液钨酸钠溶液：称取钨酸钠10g，溶于蒸馏水并定容至100毫升。3、0.33mol/LH2SO4溶液溶液：于53ml蒸馏水中加入1ml的浓硫酸。4、碱性硫酸铜溶液、碱性硫酸铜溶液 A液：无水碳酸钠35g，酒石酸钠13g及碳酸氢钠11g溶于蒸馏水，稀释定容至1000ml.B液：硫酸铜晶

30、体5g，溶于蒸馏水并定容至100ml。临用时，A液：B液=15：1混合（体积比），混合液于冰箱中保存（4）。四四、实验试剂实验试剂 5、酸性钼酸盐溶液：、酸性钼酸盐溶液：称取钼酸钠600g,用少量蒸馏水溶解后倾入2000ml 的容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，倾入另一较大的试剂瓶中，加溴水0.5ml，摇匀，静止数小时后取上清夜500ml，于1000ml容量瓶中，徐徐加入225ml85%磷酸，边加边摇匀，再加25%硫酸150ml。置暗处次日，用空气将剩余的溴赶去。然后加99%醋酸75ml，摇匀，用蒸馏水稀释定容至1000ml,贮于棕色瓶中。1、无蛋白血滤液的制备、无蛋白血滤液的制备：用奥氏吸管吸

31、取全血（已加抗凝剂草酸钠）1ml,缓缓放入50ml锥形瓶中，加蒸馏水7ml，摇匀，溶血后（血液变为红色透明）加10%钨酸钠1ml，摇匀。再加0.33mol/LH2SO41ml，边加边摇，加毕充分摇匀，放置515分钟，至沉淀变为暗棕色（如不变色可再加0.33mol/L H2SO412滴）。用干滤纸过滤。先倾入少许，待滤纸湿润后在全部倒入，如滤液不清需重新过滤。每毫升无蛋白血滤液相当于1/10ml全血。五、实验步骤五、实验步骤2、血糖的定量测定：、血糖的定量测定：取25ml的血糖管3支，编号。第一支血糖管中加入1ml蒸馏水（空白管）；第二支血糖管中加1ml标准葡萄糖液；用奥氏吸管吸取无蛋白血滤液1ml，放入第三支血糖管中。然后向三支血糖管中各加入2ml新配制的碱性硫酸铜溶液，同时置于沸水浴中8分钟，取出，在流水中迅速冷却后各加4ml酸性钼酸盐溶液。一分钟后，用蒸馏水稀释至25ml，混匀，用7200分光光度计在420波长处比色，以空白管调节零点。按下式计算100ml全血中所含血糖的含量m=OD1/OD2 C 10 100式中:m=100ml全血中含血糖毫克数C=标准液葡萄糖含量（0.1mg/ml）OD1=样品液光密度值OD2=标准液光密度值六、结果计算六、结果计算：