荧光免疫技术抗核抗体课件.ppt
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- 关 键 词:
- 荧光 免疫 技术 抗体 课件
- 资源描述:
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1、荧光免疫技术荧光免疫技术抗核抗体(抗核抗体(ANA)检测)检测间接免疫荧光法(间接免疫荧光法(IIF)黄卓春黄卓春 免疫学免疫学检测方法检测方法免疫沉淀法免疫沉淀法免疫凝集法免疫凝集法酶免疫检测技术酶免疫检测技术荧光免疫技术荧光免疫技术电化学发光技术电化学发光技术共同的基础共同的基础抗原抗体抗原抗体反应反应检测方法检测方法沉淀沉淀凝集凝集显色显色荧光荧光电子发光电子发光荧光免疫技术荧光免疫技术抗原抗体反应与荧光标记技术抗原抗体反应与荧光标记技术结合,对抗原结合,对抗原 或抗体进行定性、定位或定量检测或抗体进行定性、定位或定量检测抗核抗体的检测抗核抗体的检测间接免疫荧光法间接免疫荧光法荧光免疫技
2、术荧光免疫技术间接间接荧光标记的二抗荧光标记的二抗FF直接法:直接法:荧光标记的抗体荧光标记的抗体优点:步骤少优点:步骤少缺点:每种抗体都需缺点:每种抗体都需要标记荧光,不通用要标记荧光,不通用间接法:间接法:荧光标记的二抗荧光标记的二抗优点:通用荧光二抗优点:通用荧光二抗缺点:步骤多缺点:步骤多抗核抗体的定义抗核抗体的定义 抗核抗体的检测抗核抗体的检测 抗核抗体检测策略抗核抗体检测策略 抗核抗体的临床意义抗核抗体的临床意义 讨论要求讨论要求ANA(antinulear antibody)定义)定义传统定义:传统定义:是指是指抗细胞核抗原抗细胞核抗原成分的自身抗体成分的自身抗体 狭义定义狭义定
3、义现代定义:现代定义:是指抗细胞内所有抗原成分的自身抗体是指抗细胞内所有抗原成分的自身抗体 对对ANA的理解已不再局限于核成分,而是指的理解已不再局限于核成分,而是指一类一类抗核酸和核蛋白等细胞成分抗体抗核酸和核蛋白等细胞成分抗体的总称的总称 广义定义广义定义抗核抗体的定义抗核抗体的定义 ANA细胞靶抗原成份模式图细胞靶抗原成份模式图真核细胞真核细胞高尔基体高尔基体分泌颗粒分泌颗粒粗面内质网粗面内质网核仁核仁核粒子核粒子糖原颗粒糖原颗粒溶酶体溶酶体细胞骨架蛋白细胞骨架蛋白细胞膜细胞膜线粒体线粒体滑面内质网滑面内质网中心粒中心粒推荐采用以推荐采用以HEp-2细胞细胞(Human Epitheli
4、al Cells,人人喉癌上皮细胞株)为底物的喉癌上皮细胞株)为底物的间接免疫荧光法间接免疫荧光法(Indirect ImmunoFluorescence assays,IIF)优点:优点:HEp-2细胞形态大,细胞抗原种类齐全,细胞形态大,细胞抗原种类齐全,分裂期成份(如着丝点、纺缍体、中心粒)分裂期成份(如着丝点、纺缍体、中心粒)等丰富等丰富(抗原齐全)(抗原齐全)IIF法可直接观察针对细胞成份的抗体法可直接观察针对细胞成份的抗体(形(形态直观)态直观)抗核抗体的检测抗核抗体的检测 试剂与器材试剂与器材 ANA检测试剂盒检测试剂盒包被组织切片的生物薄片(包被组织切片的生物薄片(Hep2细胞
5、细胞、猴肝片)、猴肝片)PH7.2 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液/吐吐温温20标记标记FITC羊抗人二抗羊抗人二抗阴性、阳性质控阴性、阳性质控石蜡石蜡(封片介质,(封片介质,PH8.4)加样枪,试管,加样枪,试管,洗片槽,荧光显微镜洗片槽,荧光显微镜 荧光显微镜荧光显微镜观察观察 HEp-2细胞(底物片试剂盒)细胞(底物片试剂盒)加入标本加入标本反应反应 加入荧光二抗加入荧光二抗反应反应 洗去洗去未反应血清蛋白未反应血清蛋白 FFFFF 洗去洗去多余荧光二抗多余荧光二抗 自身抗体自身抗体非特异非特异蛋白蛋白ANA检测原理和步骤检测原理和步骤检测过程检测过程:2 步步反应反应 +2步步洗涤洗涤+1步
6、步观察观察包被组织切片的生物薄片包被组织切片的生物薄片加样板加样板加加25ul25ul待测样本后盖板待测样本后盖板,避免产生气泡避免产生气泡洗涤(先洗涤(先冲洗冲洗后浸泡)后浸泡)PBS-Tween20擦干生物擦干生物薄片薄片四周四周洗液洗液待测血清稀释待测血清稀释100倍倍20ul血清血清+2mlPBS稀释液稀释液室温温育室温温育3030分钟分钟浸洗至少浸洗至少5 5分钟分钟操作步骤操作步骤生物薄片生物薄片编号编号,如,如1,2,3实验报告实验报告注明所加样本号注明所加样本号(如如1-1,5051;1-2,5047)阴阳质控阴阳质控不稀释不稀释加样板上加入加样板上加入FITC标记标记20ul
7、二抗后,盖板二抗后,盖板室温温育室温温育3030分钟分钟 洗涤(先洗涤(先冲洗冲洗后浸泡)后浸泡)PBS-Tween20浸洗至少浸洗至少5 5分钟分钟擦干擦干薄片四周薄片四周洗液洗液石蜡石蜡(一小滴一小滴)封片封片(勿用力挤压勿用力挤压)荧光显微镜下观察结果荧光显微镜下观察结果操作步骤操作步骤封片不可用力挤压盖玻片,以免损坏基质。封片不可用力挤压盖玻片,以免损坏基质。可左右挪动盖玻片以使其正确嵌入载片凹槽里。可左右挪动盖玻片以使其正确嵌入载片凹槽里。注意事项注意事项(1)试剂不经复温直接使用会降低反应温度,底物片凝集水珠会影响反应效果,使用前要复温。(2)标本稀释应准确,样本浓度过高或过低会造
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